王　紅　洪　莉武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北武漢　430060

E鈣黏蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶-9在盆底器官脫垂患者宮骶韌帶中的表達(dá)及相關(guān)性分析

王紅洪莉
武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北武漢430060

目的 探討E鈣黏蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）在盆底器官脫垂（POP）患者子宮骶韌帶中的表達(dá)情況，并分析兩者的相關(guān)性。方法 選取2015年1月～2016年1月武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科子宮全切患者55例，分為三組，其中輕度POP組（POPⅠ～Ⅱ度）15例，重度POP組（POPⅢ～Ⅳ度）22例，正常組（非POP患者）18例，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)三組患者子宮骶韌帶組織中E-鈣黏蛋白和MMP-9的表達(dá)情況，比較分析兩者在各組的相關(guān)性。結(jié)果 輕度POP組及重度POP組的E-鈣黏蛋白表達(dá)顯著低于正常組（P＜0.01），而MMP-9的表達(dá)高于正常組（P＜0.05或P＜0.01），并且E-鈣黏蛋白的降低和MMP-9的升高隨POP嚴(yán)重程度加重而加大；E-鈣黏蛋白和MMP-9在輕度和重度POP組的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.5612，P=0.0295；r=-0.6221，P=0.002）。結(jié)論E-鈣黏蛋白降低和MMP-9的升高可能是POP發(fā)病機(jī)制之一，二者可能共同參與了POP的發(fā)生發(fā)展。

盆底器官脫垂；E-鈣黏蛋白；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；相關(guān)性分析

［Abstract］Objective To investigate expression of E-cadherin and matrix metalloproteinase-9（MMP-9）in uterosacral ligament of women with pelvic organ prolapse and analyze the correlation between the two proteins.Methods Fifty-five patients undergoing hysterectomy were selected from January 2015 to January 2016 in the Department of Gynecology and Obstetrics of Renmin Hospital of Wuhan University，then they were divided into three groups：the mild group（POPⅠ-Ⅱ，15 cases），the severe group（POPⅢ-Ⅳ，22 cases）and control group（without POP，18 cases）.Western blot was used to detect E-cadherin and MMP-9 of the uterosacral ligament tissues taken from patients of the three groups，then the differences and correlation of the expression of both proteins were analyzed among the three groups.Results The level of E-cadherin in the mild group and the severe group was lower（P＜0.01）and MMP-9 was higher than those of the control group（P＜0.05 or P＜0.01），the decrease of E-cadherin and the rise of MMP-9 increased with severity increase of POP.There was a significant negative correlation between the two proteins in the mild group and the severe group（r=-0.5612，P=0.0295；r=-0.6221，P=0.002）.Conclusion The down-regulation of E-cadherin and up-regulation of MMP-9 in uterosacral ligament tissues may be one of the pathogenesis of POP.The both proteins may paticipate in the pathogenesis of POP.

［Key words］Pelvic organ prolapse；E-cadherin；Matrix metalloproteinase-9；Correlation analysis

盆腔器官脫垂（Pelvic organ prolapse，POP）是由于盆底支持功能減弱和盆底固有肌及韌帶功能缺陷等引起的一組疾病，主要包括子宮脫垂、陰道前壁膨出、陰道后壁膨出等。POP是中老年婦女的多發(fā)病，研究表明在國內(nèi)約有30%的中老年婦女有著不同程度的盆底器官脫垂［1］。其癥狀有陰道腫物膨出、疼痛、局部潰瘍及其引起的婦科炎癥等，在很大程度上影響了中老年婦女的生活質(zhì)量。相關(guān)調(diào)查研究顯示，在美國每年用于POP手術(shù)治療的費(fèi)用高達(dá)10億美元［2］，給患者帶來嚴(yán)重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，研究POP的發(fā)病機(jī)制具有重要的理論和臨床價(jià)值。相關(guān)的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病主要與分娩、年齡、肥胖、慢性腹壓增加及絕經(jīng)等因素相關(guān)［3］。然而，POP發(fā)病具體的分子機(jī)制尚未完全明了，缺乏充分的病因?qū)W理論解釋POP的發(fā)病，許多研究證實(shí)POP發(fā)病與細(xì)胞內(nèi)骨架及細(xì)胞外基質(zhì)（Extra cellular matrix，ECM）的代謝密切相關(guān)［4-6］。本研究中，選取E鈣黏素（E-cadherin）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）兩項(xiàng)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)成分，檢測(cè)它們?cè)赑OP患者子宮骶韌帶中的表達(dá)情況，并分析兩者關(guān)系，旨在進(jìn)一步闡明POP發(fā)病的相關(guān)分子機(jī)制。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2015年1月～2016年1月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）行子宮全切術(shù)患者55例，其中患POP行子宮全切術(shù)的患者37例作為POP組，并以同期因子宮腺肌癥、子宮肌瘤或功能性子宮出血等良性疾病（均未累及宮骶韌帶），而無POP或尿失禁行子宮全切術(shù)的患者18例作為正常組。根據(jù)國際尿控協(xié)會(huì)（International Continence Society，ICS）1996年公布的POP-Q分類法對(duì)POP進(jìn)行分度，以POPⅠ～Ⅱ度患者作為輕度POP組（此組患者切除子宮的主要指征為CINⅡ或Ⅲ，且合并輕度POP），共15例；POPⅢ～Ⅳ度患者作為中度POP組，共22例。各組患者均為陰道分娩和絕經(jīng)者，既往無激素使用史，無明顯的盆腔炎癥、無糖尿病或高血壓等疾病、無各種慢性疾病。參與本研究的所有患者均知情同意并簽署知情同意書，且本研究已經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2樣本來源

在各組患者行子宮全切術(shù)中，切取距離宮頸約0.5 cm處的宮骶韌帶組織，長約0.5 cm。用PBS清洗血液、剪去脂肪等組織，并用液氮短期保存，以備后期提取組織總蛋白。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1組織總蛋白提取將各組液氮凍存的組織取出并編號(hào)，用研缽研磨，加入裂解液充分裂解，離心后提取上清，并使用蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）測(cè)總蛋白濃度，然后加入上樣緩沖液煮沸，放入-20℃冰箱保存，以備后期Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)。1.3.2 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 運(yùn)用Western blot檢測(cè)E-cadherin和MMP-9在各組患者宮骶韌帶中的表達(dá)情況。主要的操作步驟包括：配膠（分離膠10%）、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜（PVDF膜）、封閉、一抗孵育、二抗孵育、掃描分析。主要的試劑及器材：E-鈣黏蛋白小鼠抗人單克隆抗體 （Abcam，USA），MMP-9和GAPDH兔抗人單克隆抗體 （Abcam，USA）、Tris-HCL緩沖鹽溶液（TBS）、奧德賽掃描儀（Odyssey，Li-cor，USA）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1三組患者基本參數(shù)比較

收集記錄與POP相關(guān)的主要因素，如年齡、體重指數(shù)（BMI）、陰道分娩次數(shù)。三組3個(gè)指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。見表1。

表1　各組患者基本參數(shù)比較（x±s）

2.2三組患者宮骶韌帶組織中E-鈣黏蛋白及MMP-9的表達(dá)情況

正常組、輕度POP組和重度POP組三組宮骶韌帶組織中E-鈣黏蛋白表達(dá)分別為37.91±3.41、32.65± 3.36和26.11±3.24，兩兩比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。正常組、輕度POP組和重度POP組三組MMP-9蛋白分別為24.38±2.94、27.61±2.40和31.09± 3.59，兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.0）。見圖1。

圖1　E-鈣黏蛋白和MMP-9在三組中的表達(dá)

2.3三組患者宮骶韌帶組織中E-鈣黏蛋白和MMP-9表達(dá)的相關(guān)性分析

根據(jù)E-鈣黏蛋白和MMP-9在各組的表達(dá)量繪制散點(diǎn)圖，采用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在正常組中E-鈣黏蛋白表達(dá)與MMP-9無明顯相關(guān)性（r=0.377，P=0.123），而在輕度POP組合重度POP組，兩蛋白的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.5612，P=0.0295；r=-0.6221，P=0.002）。見圖2。

圖2　三組患者宮骶韌帶組織中E-cadherin和MMP-9表達(dá)的相關(guān)性分析

3　討論

女性的盆底組織受復(fù)雜的生物力學(xué)和雌激素影響，妊娠、分娩等引起的腹壓變化以及雌激素的撤退都將引起POP的發(fā)生和發(fā)展。盆底的韌帶和肌肉是維持盆底器官正常解剖位置的基礎(chǔ)，而子宮主骶韌帶是提供力學(xué)抗性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，其主要成分是肌肉和膠原纖維，任何原因引起的盆底肌肉和膠原纖維的斷裂和退行性變化都能引起盆底支持結(jié)構(gòu)的松弛，進(jìn)而導(dǎo)致POP或者壓力性尿失禁（Stress urinary incontinence，SUI）［7］。

鈣黏蛋白是一組存在于細(xì)胞表面的糖蛋白，它可以通過鈣依賴型的分子機(jī)制發(fā)揮其保持細(xì)胞間黏附的作用。E-鈣黏蛋白屬于鈣黏蛋白家族的一員，廣泛存在于各類上皮細(xì)胞之中，主要介導(dǎo)同型細(xì)胞間的黏附反應(yīng)，還可以通過與細(xì)胞內(nèi)的配合基連環(huán)蛋白αβ和γ發(fā)揮細(xì)胞骨架的作用，其表達(dá)的丟失將使細(xì)胞失去極性并和周圍細(xì)胞分離。近年來E-鈣黏蛋白的研究主要集中在腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵入等方面［8-9］。在MMPs家族中，MMP-2和MMP-9是主要成員，并與細(xì)胞外基質(zhì)的重塑修復(fù)關(guān)系密切。然而，E-鈣黏蛋白與MMP-9關(guān)系密切，在Llorens等［10］的研究中證實(shí)了E-鈣黏蛋白能夠調(diào)節(jié)MMP-9的表達(dá)，能夠抑制腫瘤細(xì)胞或者宿主細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶，并且有效減少腫瘤細(xì)胞周圍的基質(zhì)以及基底膜中的各種細(xì)胞外基質(zhì)的降解，并且在一項(xiàng)大鼠腎間質(zhì)纖維化的研究中也得到了類似的結(jié)果［11］。在盆底支持組織中主要的細(xì)胞成分是肌肉細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，已經(jīng)證實(shí)了成纖維細(xì)胞合成、分泌的彈性纖維和膠原蛋白是保持盆底支持組織強(qiáng)度和韌性的關(guān)鍵成分［12-13］。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，在盆底支持組織中發(fā)揮重要的作用。而MMP-9又稱為明膠酶，主要功能是分解細(xì)胞外基質(zhì)，降解膠原蛋白并改變膠原蛋白的性狀。許多研究已經(jīng)證實(shí)，MMPs作為細(xì)胞外基質(zhì)重要的降解酶，在組織的修復(fù)、血管發(fā)生、凋亡、腫瘤植入和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用［14-16］。MMP-9在盆底組織的細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，一旦盆底結(jié)締組織受到炎癥、細(xì)胞因子、機(jī)械力等刺激時(shí)，便會(huì)刺激MMP-9的合成，引起富含膠原的組織的可塑性和完整性遭到破壞［17］，進(jìn)而導(dǎo)致POP或SUI的發(fā)生發(fā)展。

在本研究中，POP患者盆底宮骶韌帶中的E-鈣黏蛋白較非POP患者是顯著降低的，然而MMP-9的含量則是升高的。MMP-9的過度升高將極大地增加細(xì)胞外基質(zhì)的降解，膠原蛋白減少，引起成纖維細(xì)胞的功能缺陷，從而導(dǎo)致POP的發(fā)生和發(fā)展。前面提到E-鈣黏蛋白可以結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的配合基連環(huán)蛋白αβ和γ，起到細(xì)胞骨架的作用，它的減少也可能會(huì)引起成纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，并且其黏附作用的降低對(duì)盆底結(jié)締組織的穩(wěn)定性也有負(fù)性作用。從本研究中E-鈣黏蛋白和MMP-9的相關(guān)性分析可以看出兩者在輕度POP組和重度POP組中呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。曾有報(bào)道把表達(dá)E-鈣黏蛋白的基因片段轉(zhuǎn)染進(jìn)前列腺腺癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)MMP-2的表達(dá)降低，腫瘤的侵襲能力也降低［18］，并且E-鈣黏蛋白的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致MMP-9活性升高［10］。在Munshi等［19］的一項(xiàng)關(guān)于口腔角質(zhì)化的研究中也發(fā)現(xiàn)了E-鈣黏蛋白能夠降低MMP-9的合成，另一項(xiàng)類似的研究也顯示在大鼠角質(zhì)細(xì)胞中E-鈣黏蛋白的表達(dá)降低與MMP-9的表達(dá)升高密切相關(guān)［20］。在胎盤植入時(shí)E-鈣黏蛋白可以通過調(diào)節(jié)MMP-2與MMP-9 mRNA的表達(dá)和MMP-2與MMP-9的明膠活性來參與其中［21］。然而，同時(shí)也有研究顯示MMP-9作為蛋白激酶參與E-鈣黏蛋白的分解［22］，并且MMP-9是表皮生長因子受體依賴型的E-鈣黏蛋白減少的調(diào)節(jié)者，其表達(dá)升高能夠單獨(dú)造成E-鈣黏蛋白和黏附節(jié)點(diǎn)的喪失［23］。E-鈣黏蛋白與MMP-9的負(fù)相關(guān)性在本研究中也得到了證實(shí)，這種負(fù)相關(guān)性在POP分度越高的患者中表現(xiàn)越明顯，E-鈣黏蛋白與MMP-9可能存在因果關(guān)系，在POP的發(fā)病和發(fā)展中這兩者的相關(guān)性可能存在重要意義。

綜上所述，在POP患者的盆底骶韌帶中E-鈣黏蛋白的表達(dá)降低，MMP-9表達(dá)升高，兩者呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)兩者可能存在因果關(guān)系，在本研究中并不能得出何者是因何者是果，兩者間可能存在相聯(lián)系的細(xì)胞因子或者信號(hào)分子，是POP發(fā)病機(jī)制之一。然而，兩者具體的關(guān)系以及通過何種途徑相聯(lián)系在POP發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，還需要更多更深入的研究，以期在POP的預(yù)防和治療上尋找新的靶點(diǎn)。

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Expressions of E-cadherin and matrix metalloproteinase-9 and correlation in uterosacral ligament of women with pelvic organ prolapse

WANG HongHONG Li
Department of Gynecology and Obstetrics，Renmin Hospital of Wuhan University，Hubei Province，Wuhan430060，China

R711.2

A

1673-7210（2016）08（b）-0098-04

2016-05-04本文編輯：任念）

武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目（523-266078）。

王紅（1983.9-），女，武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科專業(yè)2012級(jí)在讀碩士研究生；研究方向：腹腔鏡在婦科腫瘤中的應(yīng)用。

洪莉（1970-），醫(yī)學(xué)博士，教授；研究方向：盆底功能障礙性疾病和婦科腫瘤。