林　勇　李榮洲　鄭煒?lè)濉〗鹋嗦暋∪巫诤Ｕ憬∪鸢彩腥嗣襻t(yī)院消化內(nèi)科，浙江溫州　325200

抗生素耐藥基因位點(diǎn)和藥物代謝酶聯(lián)合檢測(cè)在幽門(mén)螺桿菌根除治療中的應(yīng)用

林勇李榮洲鄭煒?lè)褰鹋嗦暼巫诤?br/>浙江省瑞安市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，浙江溫州325200

目的 分析溫州地區(qū)幽門(mén)螺桿菌（Hp）對(duì)克拉霉素和左氧氟沙星的耐藥情況及相關(guān)耐藥基因突變特征，同時(shí)檢測(cè)患者的藥物代謝酶CYP2C19的代謝類(lèi)型。通過(guò)綜合分析藥物代謝酶和耐藥位點(diǎn)突變情況為臨床Hp個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。方法 選擇2015年1～3月在瑞安市人民醫(yī)院經(jīng)胃鏡和病理檢查確診的慢性胃炎患者116例，其中男67例，女49例，年齡24～76歲，平均（43.8±5.3）歲。采用E-test法測(cè)定Hp對(duì)克拉霉素和左氧氟沙星的最低抑菌濃度（MIC），耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)：克拉霉素MIC＞1 μg/mL，左氧氟沙星MIC＞1 μg/mL。提取Hp基因組DNA，采用PCR法擴(kuò)增23S rRNA和gyrA基因片段，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。個(gè)體CYP2C19代謝類(lèi)型的測(cè)定同樣采用PCR擴(kuò)增和測(cè)序的方法。 結(jié)果 34株克拉霉素耐藥Hp菌株的23S rRNA V區(qū)均有基因突變發(fā)生，突變位點(diǎn)A2143G最為常見(jiàn)，突變率達(dá)到91.17%。左氧氟沙星耐藥Hp菌株的gyrA基因最常見(jiàn)的突變方式為N87K（56.76%）。個(gè)體藥物代謝酶類(lèi)型主要為快代謝和中代謝類(lèi)型。結(jié)論23S rRNA基因的突變位點(diǎn)A2143G是導(dǎo)致Hp對(duì)克拉霉素耐藥的主要原因。gyrA基因的87和91位氨基酸突變是導(dǎo)致Hp對(duì)左氧氟沙星耐藥的主要原因。臨床Hp根除治療應(yīng)適時(shí)采用高通量檢測(cè)技術(shù)提高個(gè)體化用藥效能。

幽門(mén)螺桿菌；耐藥；測(cè)序；CYP2C19

［Abstract］Objective To investigate drug resistance of Helicobacter pylori（Hp）strains to levofloxacin and clarithromycin in Wenzhou district，and to detect the type of CYP metabolism，so as to provide theoretical basis for clinical anti-Hp treatment.Methods 116 patients with chronic gastritis were selected in Rui′an People's Hospital from January 2015 to March 2015 and their diagnosis under gastroscope and pathology were analyzed.The patients included 67 cases of male，50 cases of female，aged from 24 to 76 years old，average（43.8±5.3）years old.Minimum inhibitory concentration（MIC）values for clarithromycin and levofloxacin resistance in Hp were tested by E-test method.Genomic DNA of Hp was extracted，followed by PCR amplification and DNA sequencing for 23S rRNA and gyrA fragments.Determination of CYP2C19 metabolism type was also performed by the methods of PCR amplification and sequencing.Results 34 Clarithromycin resistant Hp strains showed mutations in the 23S rRNA V region，most commonly seen at Site A2143G（91.17%）.Gene gyrA of the levofloxacin-resistant strains was mostly mutated as N87K（56.76%）.The types of individual drug metabolizing enzymes were mainly fast metabolism and medium metabolism.Conclusion A2143 mutation of 23S rRNA leads to the Hp resistance to clarithromycin.The 87 and 91 amino acid mutations of gyrA gene are the main reasons for the Hp strains resistance to levofloxacin.The eradication therapy of Hp infection should be based on the high throughput detection technology to improve the effectiveness of individual drug use.

［Key words］Helicobacter pylori；Drug resistance；Sequencing；CYP2C19

抗生素濫用與幽門(mén)螺桿菌 （Helicobacter pylori，Hp）耐藥在我國(guó)是普遍存在且非常嚴(yán)重的問(wèn)題。遏制Hp耐藥發(fā)展、保證抗菌藥物的療效已經(jīng)到了刻不容緩的時(shí)刻。目前，影響Hp感染個(gè)體化根除治療療效的因素主要包括三方面：宿主、Hp和抗生素。宿主主要包括CYP2C19的基因多態(tài)性會(huì)明顯影響質(zhì)子泵抑制劑（proton pump inhibitors，PPI）代謝水平及抑酸效果，對(duì)Hp根除療效產(chǎn)生影響［1］；Hp因素主要為Hp對(duì)抗生素的耐藥性，其中又以三聯(lián)療法中克拉霉素和左氧氟沙星的耐藥為主［2］；抗生素因素主要包括抗生素的藥物劑量、服用頻率、療程等因素的影響。本文采用藥敏實(shí)驗(yàn)E-test法和PCR產(chǎn)物測(cè)序法對(duì)Hp臨床分離株進(jìn)行了克拉霉素和左氧氟沙星的耐藥檢測(cè)并同時(shí)檢測(cè)了患者CYP2C19的代謝類(lèi)型，通過(guò)二者聯(lián)合檢測(cè)指導(dǎo)臨床Hp根除治療過(guò)程中的合理用藥。

1　資料與方法

1.1一般資料

選擇2015年1～3月在瑞安市人民醫(yī)院經(jīng)胃鏡和病理檢查確診的慢性胃炎患者116例，其中男67例，女49例，年齡24～76歲，平均（43.8±5.3）歲。所有患者1個(gè)月內(nèi)均未服用任何抗Hp治療藥物。胃竇黏膜標(biāo)本經(jīng)快速尿素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)Hp陽(yáng)性。胃竇黏膜組織立即放入1 mL的腦心浸出液（BHI）液體培養(yǎng)基（杭州致遠(yuǎn)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司）中，-80℃保存?zhèn)溆谩１狙芯糠桨竿ㄟ^(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，納入研究前所有患者均簽署知情同意書(shū)。根據(jù)藥物靶點(diǎn)分析得知，常見(jiàn)幾種用于根除Hp感染的抗生素，其作用靶蛋白所富集開(kāi)發(fā)的藥物多為以下疾病治療藥物，排除此類(lèi)病例入組就減少了藥物副作用發(fā)生的可能［3］。排除標(biāo)準(zhǔn)：心血管疾病患者、哮喘患者、糖尿病患者、神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者、近期服用其他藥物患者。

1.2方法

1.2.1藥敏實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)Hp菌株，采用E-test法測(cè)定Hp對(duì)克拉霉素和左氧氟沙星的最低抑菌濃度（minimalinhibitoryconcentration，MIC）。耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)：克拉霉素MIC＞1μg/mL，左氧氟沙星MIC＞1μg/mL。1.2.2 PCR擴(kuò)增及耐藥位點(diǎn)測(cè)序采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）按照說(shuō)明書(shū)步驟提取Hp基因組DNA。分別擴(kuò)增Hp克拉霉素耐藥基因23S rRNA、左氧氟沙星耐藥基因gyrA。擴(kuò)增引物由杭州致遠(yuǎn)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司合成，詳細(xì)見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系50 μL：DNA模板5 μL，500 nmol/L上下游引物，1U rTag酶，200 μmol/L dNTP，1×PCR buffer，ddH2O 29 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性 30 s、52℃退火30 s、72℃延伸30 s循環(huán)35次，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生化科技有限公司），對(duì)PCR產(chǎn)物切膠回收純化后，送軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院采用Illumina HiSeq2000測(cè)序儀測(cè)序。結(jié)果與Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株26695序列進(jìn)行比對(duì)。見(jiàn)表1。

表1　PCR擴(kuò)增引物序列

1.2.3藥物代謝酶CYP2C19 PCR擴(kuò)增及測(cè)序PCR引物 CYP2C19*2位點(diǎn)擴(kuò)增的正向引物：AATTACAACCAGAGCTTGGC；反向引物：TATCACTTTCCATAA AAGCAAG；CYP2C19*3位點(diǎn)擴(kuò)增的正向引物：TAT TATTATCTGTTAACTAATATGA； 反向引物：ACTTCAGGG CTTGGTCAATA。經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到目標(biāo)片段長(zhǎng)度：CYP2C19*2為 166 bp，CYP2C19*3為327 bp。PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收純化后，送軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院測(cè)序。

1.3確定基因型

測(cè)序結(jié)果與人類(lèi)基因庫(kù)中的 CYP2C19*2、CYP2C19*3基因序列比對(duì)，確定待測(cè)突變位點(diǎn)上的基因型。

2　結(jié)果

2.1HP藥敏檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

本次研究共成功分離出107例Hp菌株，其中13例對(duì)克拉霉素耐藥，16例對(duì)左氧氟沙星耐藥，21例對(duì)克拉霉素和左氧氟沙星雙重耐藥，剩余57例為敏感菌株。具體突變特征見(jiàn)表2。

表2　Hp耐藥位點(diǎn)突變特征

2.2Hp耐藥基因突變特征分析株

從測(cè)序結(jié)果可以看出，34株克拉霉素耐藥Hp菌株的23S rRNA V區(qū)均有突變發(fā)生，突變位點(diǎn)A2143G較常見(jiàn)［4］，突變率達(dá)91.17%，其他依次為A2174G（5.88%）、A2187G（2.95%）。37例Hp臨床分離株經(jīng)PCR均擴(kuò)增出gyrA基因中含喹諾酮類(lèi)耐藥決定區(qū)的目的片段。測(cè)序結(jié)果顯示，37株左氧氟沙星耐藥Hp菌株的gyrA基因突變方式主要為N87K（56.76%）［5］，其他依次為N87I（16.22%）、D91N（21.62%）和D91G（5.40%）。57例敏感菌株中未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。

2.3藥物代謝酶CYP2C19測(cè)序分析

根據(jù)CYP2C19的遺傳多態(tài)性可把其分為兩種表型，即強(qiáng)代謝型和弱代謝型［6］。其中強(qiáng)代謝型根據(jù)基因型的不同又可被分為純合子強(qiáng)代謝型和雜合子強(qiáng)代謝型即中間代謝型。通過(guò)對(duì)107例樣CYP2C19*2和CYP2C19*3位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，部分測(cè)序圖譜見(jiàn)圖1，測(cè)序結(jié)果分析如下：

圖1　CYP2C19測(cè)序圖譜分析

2.3.1 CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型在測(cè)序樣本中的分布在107例樣本中，21例為野生型純合子，占比19.63%。55例只有一種基因發(fā)生雜合突變（*1/*2、*1/*3），為中間代謝型。其中*1/*2型45例，*1/*3型10例。一種基因發(fā)生純合突變或兩種基因均發(fā)生雜合突變者31例，為慢代謝人群，其中*2/*2型9例，*2/*3型21例，*3/*3型1例。見(jiàn)表3。

2.3.2CYP2C19*2和CYP2C19*3基因突變情況的分析 在107個(gè)樣本中，發(fā)生于681位點(diǎn)的突變（GA和AA）較常見(jiàn)（n=75，70.09%）。其中以雜合突變居多（n=66，61.68%）。純合突變9例，占比8.41%。636位點(diǎn)雜合突變31例，占比28.97%；發(fā)生在636位點(diǎn)的純合突變概率較低（n=1），占比0.93%。

表3　CYP2C19基因多態(tài)性分布統(tǒng)計(jì)

3　討論

目前臨床用于Hp根除治療的抗生素主要有甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、慶大霉素、呋喃唑酮［7］。PPI主要包括奧美拉唑、蘭索拉唑、雷貝拉唑、埃索美拉唑［8］。

在Hp根除的三聯(lián)療法中，由于患者個(gè)體間藥物代謝酶代謝能力的差異，導(dǎo)致個(gè)體對(duì)PPI的治療效果差異較大。在浙江地區(qū)，Hp對(duì)抗生素的耐藥主要集中在甲硝唑、克拉霉素和左氧氟沙星三種藥物上［9］。甲硝唑的耐藥率達(dá)90%以上，已不適合作為臨床根除Hp治療藥物。浙江地區(qū)Hp根除治療過(guò)程中主要考慮為克拉霉素和左氧氟沙星耐藥。

有研究表明，克拉霉素耐藥的主要原因是由于23S rRNA基因突變導(dǎo)致［10］。23S rRNA基因最常見(jiàn)突變位點(diǎn)主要包括A2142和A2143位點(diǎn)［11］。在本研究中，A2142位點(diǎn)并未發(fā)生突變，主要突變位點(diǎn)為A2143位點(diǎn)，說(shuō)明浙江地區(qū)克拉霉素耐藥主要是由于A2143位點(diǎn)突變導(dǎo)致。左氧氟沙星耐藥主要是由于gyrA基因突變導(dǎo)致，突變主要發(fā)生在第87和91位氨基酸［12］。37株左氧氟沙星耐藥Hp菌株的gyrA基因突變最常見(jiàn)的突變方式為N87K（56.76%），其他依次為N87I（16.22%）、D91N（21.62%）和D91G（5.40%）。

對(duì)107例樣本的藥物代謝酶CYP2C19進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)強(qiáng)代謝和中等代謝型共占比近70%，慢代謝型占30.99%。提示大部分人群服用正常劑量PPI后，由于藥物代謝較快，體內(nèi)血藥濃度維持時(shí)間不長(zhǎng)，根除治療達(dá)不到理想效果。對(duì)于強(qiáng)代謝型患者，要增加PPI給藥劑量而不是增加抗生素給藥劑量，在一定時(shí)間內(nèi)保持PPI體內(nèi)的血藥濃度以提高Hp的根除率［13］?？咕幬锏淖饔脵C(jī)制為直接殺滅Hp，PPI通過(guò)增加胃內(nèi)PH值，通過(guò)多種機(jī)制改善抗生素的抗菌療效，延長(zhǎng)抗菌藥物半衰期并提高穩(wěn)定性，具有特異性抗Hp作用，和抗生素具有協(xié)同作用［14］。PPIs中只有雷貝拉唑通過(guò)肝內(nèi)的非酶途徑代謝，即通過(guò)與葡萄醛酸結(jié)合和形成硫醚醛酸后由尿排泄，與絕大多數(shù)藥物無(wú)藥動(dòng)學(xué)相互作用，僅影響少數(shù)依賴胃酸吸收的藥物，故在臨床上更為安全、穩(wěn)定［15-28］。對(duì)于浙江地區(qū)的PPI使用，應(yīng)該首先考慮雷貝拉唑的使用或者對(duì)經(jīng)CYP2C19代謝的PPI藥物臨床使用要適當(dāng)增加劑量以確保抑酸效果。

綜上所述，臨床Hp個(gè)體化根除治療適時(shí)應(yīng)采用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)Hp對(duì)抗生素的耐藥性并同時(shí)檢測(cè)個(gè)體藥物代謝酶CYP2C19的代謝類(lèi)型，根據(jù)Hp菌株對(duì)抗生素的耐藥情況和個(gè)體CYP2C19的代謝類(lèi)型合理選用抗生素和PPI以提高臨床Hp根除療效。

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Application of combined detection of antibiotic resistance gene loci and CYP2C19 in helicobacter pylori eradication therapy

SHI ZhengchaoYU MingLI KechengLIN YongLI RongzhouZHENG WeifengJIN PeishengREN Zonghai
Department of Gastroenterology，Rui′an People's Hospital，Zhejiang Province，Rui′an 325200，China

R978.1

A

1674-4721（2016）08（b）-0020-05

2016-04-20本文編輯：趙魯楓）

浙江省溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20140271）。