李杉杉，毛培春，郭靜雅，郭　強，田小霞，孟　林

(北京市農(nóng)林科學(xué)院 北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心，北京　100097)

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20個紫花苜蓿品種的ISSR遺傳多樣性分析

李杉杉，毛培春，郭靜雅，郭強，田小霞，孟林

(北京市農(nóng)林科學(xué)院 北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心，北京100097)

采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對來自美國、加拿大、澳大利亞和荷蘭等4個國家的20個紫花苜蓿品種進行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析。結(jié)果顯示：從100條ISSR引物中篩選出10條帶型清晰、多態(tài)性較好的引物，共擴增出75條帶，其中62條呈多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率(PPB)為82.67%。20個紫花苜蓿品種的遺傳相似性系數(shù)為0.60～0.87，平均為0.75，其中Algonquin與Phabulous之間的遺傳相似性最高，達0.87，Sanditi，WL232和4020品種間，以及32IQ和Sequel品種間的遺傳相似性最低，均為0.60。UPGMA聚類分析結(jié)果可將20個紫花苜蓿品種劃分為6大類群，充分說明其具有豐富的遺傳多樣性。

紫花苜蓿；ISSR；遺傳多樣性；聚類分析

紫花苜蓿為多年生豆科牧草，具有高產(chǎn)、抗旱、耐寒、耐鹽堿的特性[1]，因其適口性好、營養(yǎng)價值高，有“牧草之王”的美譽[2]。苜蓿自西漢傳入我國已有2000多年的栽培歷史[3]，目前我國的苜蓿產(chǎn)業(yè)正處于快速增長期，苜蓿在生態(tài)環(huán)境治理和草牧業(yè)健康發(fā)展中具有極其重要的作用[4]。對苜蓿遺傳特性和遺傳規(guī)律的研究是苜蓿產(chǎn)業(yè)健康穩(wěn)步發(fā)展的重要基礎(chǔ)，特別要明確不同苜蓿品種之間的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，可為苜蓿種質(zhì)資源合理利用和新品種選育奠定重要的科學(xué)基礎(chǔ)。

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是利用微衛(wèi)星序列作為PCR引物進行多位點擴增，以此來識別重復(fù)序列并對序列在不同基因組中的分布進行評估[5]。該技術(shù)克服了RAPD技術(shù)重復(fù)性不理想，AFLP技術(shù)復(fù)雜、費用高和SSR技術(shù)需要通過預(yù)知基因組序列來設(shè)計引物的缺點[6]，其技術(shù)簡單快捷被運用到許多植物研究領(lǐng)域[7]。利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在燕麥(Avenasativa)[8]、大豆(Glycinemax)[9]、甜菜(Betavulgaris)[10]、麗穗鳳梨(Vriesea)[11]、煙草(Nicotianatabacum)[12]等植物的遺傳多樣性及親緣關(guān)系的研究中均取得了較好的結(jié)果。目前采用ISSR技術(shù)對苜蓿指紋圖譜構(gòu)建[13]、苜蓿種質(zhì)材料親緣關(guān)系及遺傳多樣性[14-16]的研究也有報道。此次研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對收集到的來自4個國家20個紫花苜蓿品種的遺傳多樣性進行分析，闡明其親緣關(guān)系，旨在為苜蓿后續(xù)育種工作和發(fā)掘優(yōu)異等位位點提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1試驗材料

以收集自美國、荷蘭、加拿大和澳大利亞等4個國家的20個紫花苜蓿品種為試驗材料(表1)。

1.2基因組DNA提取及檢測

20份紫花苜蓿種子分別播種于花盆中，于室溫下25～28℃培養(yǎng)，出苗后每份材料隨機取10～15個單株的幼葉0.5 g，等量混合，根據(jù)TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit 試劑盒方法提取各個苜蓿品種基因總DNA，并利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳及核酸蛋白儀對DNA的質(zhì)量及濃度進行檢測。將提取的DNA稀釋至20 ng/μL，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　供試材料及來源

1.3苜蓿ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化

PCR擴增選用的引物是根據(jù)British Columbia 大學(xué)公布的100條ISSR引物序列由上海生工有限公司合成；PCR試劑盒購自大連寶生物公司。擴增程序為：94℃，2 min；94℃，20 s，55℃，30 s，72℃，1 min 30 s，30 cycle；72℃，7 min；4℃，保存。加樣體系為：10×loading，buffer 2μL；MgCl2，1.2 μL；引物(0.5OD)，1 μL；dNTP，1 μL；Taq酶，0.2 μL；DNA模版，1 μL；ddH2O補齊20 μL。

1.4PCR擴增及電泳檢測

于BIO PCR儀上進行PCR擴增。用1.4%瓊脂糖凝膠檢測擴增產(chǎn)物，并于凝膠成像系統(tǒng)下拍照。

1.5遺傳相似性分析

電泳圖譜中的每個條帶均被認(rèn)為1個分子標(biāo)記，表示1個引物的結(jié)合位點。選取100～2 000 bp內(nèi)的PCR擴增片段進行統(tǒng)計分析，根據(jù)有無條帶統(tǒng)計于表格中，有帶記作1，無帶或不清晰條帶記為0，生成各材料的0，1矩陣；利用NTSYSpc 2.10s軟件中的UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic averages) 構(gòu)建20個苜蓿品種的遺傳關(guān)系樹狀圖，分析其遺傳關(guān)系。

2　結(jié)果與分析

2.1瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

從100條ISSR引物中篩選出10條帶型清晰、多態(tài)性較好的引物，并對20個紫花苜蓿品種進行PCR擴增，擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳并在凝膠成像儀上觀測、照相。圖1顯示了引物864對20個紫花苜蓿品種的擴增結(jié)果。

圖1　引物864的擴增結(jié)果Fig.1　Result of PCR amplification using primer 864 注：M-DL2000 DNA Marker；1-Sanditi；2-32IQ；3-42IQ；4-Alfa queen；5-Derby；6-Sardi7；7-Sardi10；8-Sitel；9-Aurora；10-Sequel；11-5s43；12-AC caribou；13-Spyder；14-Magna；15-4030；16-WL232；17-4020；18-Algonquin；19-Phabulous；20-3010

2.2ISSR-PCR多態(tài)性分析

對擴增后的電泳條帶進行統(tǒng)計分析，ISSR擴增條帶均位于200～2 000 bp。10條ISSR引物共擴增出75條帶，平均每個引物擴增條帶數(shù)為7.5條，其中有62條具有多態(tài)性，多態(tài)性比例(PPB)為82.67%(表2)，充分說明供試紫花苜蓿遺傳資源的遺傳多態(tài)性較為豐富，ISSR標(biāo)記可以很好地揭示供試紫花苜蓿種內(nèi)的遺傳差異和親緣關(guān)系。

2.3遺傳相似性分析

根據(jù)ISSR所得數(shù)據(jù)對20個紫花苜蓿品種之間的遺傳相似性系數(shù)(GS)分析評估，結(jié)果表明，20個紫花苜蓿品種的遺傳相似系數(shù)(GS)為0.60～0.87，平均約為0.75，主要集中在4個區(qū)域：即0.82～0.87、0.78～0.82、0.74～0.78和0.67～0.74(表3)。其中Algonquin與Phabulous之間的遺傳相似性最高，為0.87，Sanditi與WL232、4020以及32IQ和Sequel之間的遺傳相似性最低，均為0.60。說明20個紫花苜蓿品種之間的遺傳相似性系數(shù)變幅較大。

表2　20個苜蓿品種ISSR引物及其擴增結(jié)果

表3　20個苜蓿品種的遺傳相似系數(shù)

2.4聚類分析

根據(jù)遺傳距離采用UPGMA類平均法進行聚類分析，建立聚類分支樹狀圖(圖2)，在GS為0.74處，將20個紫花苜蓿品種明顯劃分為6大類群：第1大類群包含Sanditi和Alfa queen品種。第2大類群由12個品種組成，分為兩個亞類，其中Derby和Sardi7首先聚在一起，后與42IQ聚在一起共同組成了I亞類的一個分支，Aurora、Sequel與5s43聚在一起組成了Ⅰ亞類的另一分支；第Ⅱ亞類的第1個分支是由Spyder和Magna先聚在一起后又與3010品種相聚組成的，另一個分支則是由Algonquin與Phabulous先聚在一起后再與4020品種聚在一起共同組成，說明Algonquin與Phabulous、Aurora與Sequel、Spyder與Magna之間的親緣關(guān)系較近。第3大類群由4030和WL232品種組成。第4大類群包括Sardi10和Sitel品種。AC caribou和32IQ分別單獨聚為一類，構(gòu)成第5和第6大類群，說明兩者遺傳差異相對較大。

圖2　20個苜蓿品種的UPGMA遺傳距離聚類圖Fig.2　UPGMA clustering of 20 alfalfa varieties based on genetic distance

3　討論

種質(zhì)資源是遺傳改良的基礎(chǔ)，只有了解種質(zhì)資源遺傳變異信息及親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，才能有目的地選配親本，培育出優(yōu)良品種[11]。近年來，分子標(biāo)記技術(shù)被大量應(yīng)用于苜蓿遺傳多樣性的研究中，劉青松等[1]、蒿若超等[17]、李擁軍等[16]、魏瑧武等[13]、張穎娟等[16]、姜健等[19]分別采用RAPD，SSR和ISSR等分子標(biāo)記技術(shù)對苜蓿進行分子遺傳多樣性分析，研究得到的譜帶多態(tài)位點比率在77.7%～98.8%。

紫花苜蓿為異花授粉植物，且自交嚴(yán)重衰退無法培育純合品種，迄今為止全世界絕大多數(shù)紫花苜蓿品種均是通過表型輪回選擇或大量自然選擇培育出來的綜合品種(群體)，這就造成部分育成品種間或多或少存在一定的親緣關(guān)系[20]。姜健等[19]認(rèn)為苜蓿種質(zhì)資源的遺傳多樣性與地理位置及親本的血緣關(guān)系密切相關(guān)。研究中Algonquin和Phabulous的遺傳距離最近，Sanditi與WL232和4020之間的遺傳距離最遠(yuǎn)，因此，推測Algonquin與Phabulous具有較近的親緣關(guān)系，是否可能由于地理位置較近而具有相同或相近的親本，而后者是否可能因地理來源的緣故而導(dǎo)致遺傳距離較大。不同遺傳背景的品種間的雜交可能會產(chǎn)生明顯的雜種優(yōu)勢[21]。研究發(fā)現(xiàn)Sanditi與WL232和4020品種間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其與這兩個品種雜交可能會產(chǎn)生較大的雜種優(yōu)勢，此外，32IQ與其他品種的遺傳距離也較大，因此推測它與其他19個紫花苜蓿品種雜交也會產(chǎn)生較大的雜種優(yōu)勢。

劉青松等[1]通過試驗認(rèn)為，聚為一類的大多是來源相同或相近的苜蓿品種，說明來源相同的苜蓿品種表現(xiàn)為較近的親緣關(guān)系。研究結(jié)果顯示，4030與WL232品種聚在一起，說明它們具有較近的親緣關(guān)系以及相似的遺傳背景，應(yīng)當(dāng)在品質(zhì)及適應(yīng)性等方面具有相似的特性，這與李巖等[22]的研究結(jié)果較為一致。同時，研究得出Sanditi，Sitel和Magna分別與Alfa queen，Sardi10和Spyder聚在一起，因此，推斷后三者可能也具有前面三者較為相似的遺傳特性。通過對20個紫花苜蓿品種的ISSR遺傳多樣性的分析，可為深入系統(tǒng)挖掘紫花苜蓿優(yōu)異等位基因和培育新品種奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

4　結(jié)論

通過10條ISSR引物共在20個苜蓿品種中擴增出75個清晰可辨的位點，其中，有62個具有多態(tài)性，其多態(tài)位點率達到82.67%，說明苜蓿在其遺傳進化過程中基因組DNA發(fā)生了豐富的變異。

研究中Algonquin和Phabulous的遺傳距離最近，Sanditi與WL232和4020之間的遺傳距離最遠(yuǎn)，因此推測Algonquin與Phabulous具有較近的親緣關(guān)系。Sanditi與WL232和4020品種間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其與這兩個品種雜交可能會產(chǎn)生較大的雜種優(yōu)勢，此外，32IQ與其他品種的遺傳距離也較大。4030與WL232品種聚在一起，說明它們具有較近的親緣關(guān)系以及相似的遺傳背景。

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Analysis of genetic diversity of 20 alfalfa varieties using ISSR molecular markers

LI Shan-shan,MAO Pei-chun,GUO Jing-ya,GUO Qiang,TIAN Xiao-xia,MENG Lin

(BeijingResearchandDevelopmentCenterforGrassandEnvironment,BeijingAcademyofAgricultureandForestrySciences,Beijing100097，China)

In this paper,the genetic diversity of 20 alfalfa (Medicagosativa)varieties from America,Canada,Australia and Netherland were studied using inter-simple sequence repeat (ISSR) molecular markers in order to provide the scientific basis for analyzing the genetic diversity and genetic relationship of alfalfa.Sixty two polymorphic bands were amplified with 10 effective primers selecting from 100 ISSR primers,and the average percentage of polymorphic bands was about 82.67%.The value of genetic similarity (GS) indexes among those 20 alfalfa varieties varied from 0.60 to 0.87,and the average GS value was about 0.75.The GS value between Algonquin and Phabulous was the highest about 0.87.But the GS value between the varieties of Sanditi and WL232,4020,between the varieties of 32IQ and Sequel was the lowest,only about 0.60,respectively.These 20 alfalfa varieties were classified into 6 groups using the UPGMA cluster analysis method.Therefore,the results showed that 20 alfalfa varieties had the higher level of genetic diversity,and which would provide a theoretical basis for the genetic characteristics of alfalfa germplasm resources and the breeding of new varieties.

alfalfa；ISSR；genetic diversity；cluster analysis

2015-09-21；

2016-05-10

北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(KJCX20140103)；國家國際科技合作專項項目(2015DFR30570-6)資助

李杉杉(1986-)，女，山東青島人，碩士研究生。

E-mail：lss117@126.com

S 541

A

1009-5500(2016)04-0001-06

孟林為通訊作者。