趙彥玲，任子利，李瑜鑫，王建洲，商 鵬，強(qiáng)巴央宗（西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000）

犏牛、牦牛睪丸組織中Ghrelin與GHSR基因mRNA表達(dá)水平研究

趙彥玲，任子利，李瑜鑫，王建洲，商 鵬，強(qiáng)巴央宗
（西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000）

對(duì)犏牛、牦牛睪丸組織中生長素（Ghrelin）與生長激素促分泌素受體（GHSR）基因 mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行研究。運(yùn)用熒光定量PCR方法，檢測(cè)Ghrelin、GHSR基因在犏牛、牦牛睪丸組織中mRNA的表達(dá)水平差異，結(jié)果顯示：在犏牛、牦牛睪丸組織中，Ghrelin基因mRNA相對(duì)表達(dá)量犏牛顯著高于牦牛（分別為0.8177±0.0225、0.4656±0.0222，P＜0.05）；GHSR基因mRNA相對(duì)表達(dá)量也是犏牛顯著高于牦牛（分別為0.8622±0.0347、0.4722±0.0761，P＜0.05）。相對(duì)于牦牛睪丸組織，犏牛睪丸組織中Ghrelin與GHSR基因mRNA均高表達(dá)可能是犏牛雄性不育的原因之一。

犏牛；睪丸；生長素；生長激素促分泌素受體；mRNA表達(dá)

趙彥玲，任子利，李瑜鑫，等. 犏牛、牦牛睪丸組織中Ghrelin與GHSR基因mRNA表達(dá)水平研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43 （7）：151-157.

Ghrelin，被稱為胃饑餓素、生長素等，是生長激素促分泌素受體GHSR的內(nèi)源性配體，是由28 個(gè)氨基酸組成的多肽［1］。Ghrelin及GHSR在動(dòng)物體內(nèi)廣泛分布，具有調(diào)節(jié)生長激素分泌、攝食、能量代謝、生殖等多種生物學(xué)作用［2-3］。在睪丸中，這兩個(gè)基因的功能均表現(xiàn)為抑制睪酮的分泌［4］。相對(duì)于牦牛，犏牛表現(xiàn)出很強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)，深受牧區(qū)、半農(nóng)半牧區(qū)和鄰近農(nóng)區(qū)群眾的歡迎，但犏牛3代以內(nèi)雄性均不育，這成為生產(chǎn)和育種中的一大瓶頸［5］。對(duì)犏牛、牦牛睪丸組織中Ghrelin與GHSR 基因 mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行研究，能從分子水平上探討犏牛雄性不育的可能原因。Wang等［6］研究了牦牛和犏牛睪丸中SYCP3基因的mRNA表達(dá)和啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)。Dong等［7］檢測(cè)了Cdc2與Cdc25A基因在黃牛、牦牛和犏牛睪丸中的mRNA表達(dá)。Dmrt7在犏牛睪丸中的低表達(dá)與生精功能障礙有關(guān)［8］。方富貴等［9］研究了去勢(shì)對(duì)公豬生殖軸上Ghrelin和功能性Ghrelin受體mRNA的影響。米焱等［10］研究了Ghrelin和GHS-R1a mRNA在牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中的表達(dá)。然而，關(guān)于Ghrelin和GHSR在犏牛和牦牛睪丸中mRNA表達(dá)情況未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究采集成年犏牛（黃牛與牦牛雜交1代，F(xiàn)1）及牦牛的睪丸，運(yùn)用RT-PCR及熒光定量PCR方法，分別檢測(cè)Ghrelin及GHSR基因在兩種牛睪丸中的 mRNA表達(dá)水平差異，從分子水平上分析犏牛雄性不育的可能原因，為最終解決犏牛生產(chǎn)中的瓶頸問題（犏牛雄性不育）奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

本試驗(yàn)于 2015 年 6 ～11 月在西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院藏豬研究中心完成。

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1樣品采集及處理 分別選取西藏林芝當(dāng)?shù)亟】党赡觋＃S牛與牦牛雜交1代，F(xiàn)1）、牦牛各9頭，屠宰后取其睪丸，取樣后將樣本隨即放入RNA樣品保存液中，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80℃冰箱備用。

1.1.2主要試劑及儀器設(shè)備 Trizol（碧云天生物技術(shù)研究所）、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒（天根生物技術(shù)有限公司）、SYBRR Premix Ex Taq TMⅡ〔寶生物工程 （大連）有限公司〕、瓊脂糖（西班牙）、溴化乙錠（Sigma公司）、2×PCRMix（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）。

PCR儀、Eppendorf Centrifuge 5417R 離心機(jī)及Eppendorf Centrifuge 5415R 離心機(jī)（德國Eppendorf公司）、Boi-Rad凝膠成像系統(tǒng)、CFX96熒光定量實(shí)時(shí)PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中已公布的牛Ghrelin、GHSR及β-actin基因的cDNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物信息見表1。

1.2.2總RNA提取及鑒定 利用 Trizol 一步法，按照該試劑說明書提供的方法，提取各樣品的總RNA。先用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度和純度（A260/A280比值應(yīng)在1.8～2.0），再用1%瓊脂糖凝膠電泳確定總RNA的完整性，若RNA的純度和完整性均符合要求，就將各樣品的總RNA稀釋成同一濃度并立即用于反轉(zhuǎn)錄或置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3反轉(zhuǎn)錄cDNA及有效性檢測(cè) 將稀釋成同一濃度的總RNA按加入2μg 的量建立20 μL反應(yīng)體系，按照FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明書，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用內(nèi)參基因（β-actin）引物以cDNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，合格cDNA可用于后續(xù)試驗(yàn)或置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實(shí)時(shí)定量PCR的引物信息

1.2.4基因PCR擴(kuò)增 用梯度PCR篩選3對(duì)引物的最佳退火溫度后，以cDNA第一鏈為模板，加入引物、dNTP和2×PCR Mix等，混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）1 μL，2×PCR Mix 10 μL，Primer（10 μmol/L）各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL，總體積20 μL。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)為：95℃ 5 min；95℃20 s、60℃ 20 s 、72℃ 30 s，38個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min；4℃保存。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及熒光定量PCR 將反轉(zhuǎn)錄得到的所有樣本cDNA分別取2 μL混合構(gòu)成熒光定量PCR的校準(zhǔn)樣，將校準(zhǔn)樣按5倍梯度進(jìn)行稀釋，共稀釋5個(gè)點(diǎn)（包括原校準(zhǔn)樣），在熒光定量實(shí)時(shí)PCR儀上運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序，程序結(jié)束后看其標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和引物擴(kuò)增效率，若擴(kuò)增效率為90%～105%，說明引物可用于熒光定量。

目的基因及內(nèi)參基因的熒光定量PCR中，每個(gè)樣本的目的基因和內(nèi)參基因在同一板擴(kuò)增，且設(shè)目的基因與內(nèi)參基因的校準(zhǔn)樣擴(kuò)增，均設(shè)3個(gè)重復(fù)，以這3個(gè)重復(fù)的Ct值的平均值作為該個(gè)體睪丸組織的平均Ct值。檢查熔解曲線時(shí)，單一峰說明沒有非特異擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃15 min；95℃10 s、58℃30 s、72℃30 s，40個(gè)循環(huán)；95℃10 s，65～95℃每增加0.5℃讀取熒光1次，繪制熔解曲線。熒光定量PCR采用20 μL反應(yīng)體系：SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ10 μL，上、下游引物（10.0 μmol/L） 各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL，cDNA1.0 μL。

樣本目的基因的表達(dá)量采用2-ΔΔCT法計(jì)算：

ΔCT（樣品）=CT（樣品目的基因）-CT（樣品內(nèi)參基因）

ΔCT（標(biāo)準(zhǔn)樣）=CT（標(biāo)準(zhǔn)樣目的基因）-CT（標(biāo)準(zhǔn)樣內(nèi)參基因）

ΔΔCT=ΔCT（樣品）-ΔCT（標(biāo)準(zhǔn)樣）目的基因表達(dá)量=2-ΔΔCT

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（P ＜0.05表示差異顯著），用 Sigma Plot 10.0 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果描繪柱狀圖。

2　結(jié)果與分析

2.1總RNA的檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)紫外分光光度儀測(cè)定，各個(gè)樣本總RNA的純度為2.0～2.1，將其統(tǒng)一稀釋成400 ng/ μL；再用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，清晰可見5S、18S、28S條帶。說明所提取的總RNA純度和完整性均符合反轉(zhuǎn)錄要求，且無DNA污染，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2基因的PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖2）顯示，擴(kuò)增條帶與目的基因的片段大小（Ghrelin 234 bp、GHSR 118 bp、β-actin 116 bp）一致。

2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

從圖3～圖5可見，β-actin、Ghrelin、GHSR 等3個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增中，以倍比（5倍）稀釋的不同濃度校準(zhǔn)樣為模板，3個(gè)基因的擴(kuò)增曲線均能依次起跳，起跳間隔約2.4圈（2n=5，n為圈數(shù)），熔解曲線為尖銳的單一峰，Ct值與模板濃度呈線性相關(guān)，可見沒有非特異性擴(kuò)增；且3個(gè)基因的擴(kuò)增效率均接近100%，相關(guān)系數(shù)R2值均大于0.99，標(biāo)準(zhǔn)曲線也有較大的斜率。在3個(gè)基因的定量擴(kuò)增中，其熔解曲線也均為尖銳的單一峰（圖6），沒有非特異性擴(kuò)增。可見，可以用2-ΔΔCT法對(duì)目的基因Ghrelin及GHSR進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算。

圖2 Ghrelin、GHSR及β-actin PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

相比于牦牛睪丸組織，Ghrelin基因mRNA相對(duì)表達(dá)量犏牛顯著高于牦牛（分別為0.8177 ±0.0225、0.4656±0.0222，P＜0.05）；GHSR基因 mRNA相對(duì)表達(dá)量也是犏牛顯著高于牦牛（分別為0.8622±0.0347、0.4722±0.0761，P ＜0.05）。可見，在犏牛、牦牛睪丸組織中，犏牛Ghrelin及GHSR基因mRNA的高表達(dá)可能是犏牛雄性不育的原因之一。

圖3 β-actin擴(kuò)增及標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 Ghrelin擴(kuò)增及標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 GHSR擴(kuò)增及標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 β-actin、Ghrelin、GHSR擴(kuò)增及熔解曲線

3　討論

Ghrelin在性腺軸中是一個(gè)神奇的調(diào)節(jié)器［11-12］。在牛卵巢中 Ghrelin mRNA 廣泛表達(dá)［13］，F(xiàn)ang 等［14］研究了在成年大鼠發(fā)情周期中Ghrelin對(duì)卵巢分泌雌激素和孕激素的影響，認(rèn)為Ghrelin對(duì)動(dòng)物繁殖有調(diào)節(jié)作用。Caminos等［15］研究表明，Ghrelin mRNA 的表達(dá)與黃體的功能密切相關(guān)，且這種表達(dá)是組織特異性的。Zhang等［16］用 RT-PCR和免疫組織化學(xué)方法研究了豬發(fā)情周期中下丘腦-垂體-卵巢中Ghrelin的表達(dá)，結(jié)果表明在卵巢中，Ghrelin mRNA 的表達(dá)在間情期最高，發(fā)情前期最低，說明 Ghrelin可能在調(diào)節(jié)能量平衡和繁殖的內(nèi)分泌系統(tǒng)中起著主要作用，Viani等［17］也得到類似結(jié)論。Rak等［18］研究表明，在卵泡中，Ghrelin是促進(jìn)GH的分泌而不是合成，而GH則可以刺激 Ghrelin 的合成與分泌。

Lukaszyk等［19-20］認(rèn)為Ghrelin與GHSR-1a在大鼠睪丸的精原細(xì)胞中表達(dá)，GHSR-1a在大鼠附睪的精子中也表達(dá)。Ghrelin存在于睪丸間質(zhì)和支持細(xì)胞中，在睪丸網(wǎng)、附睪、輸精管、精囊中均表達(dá)［21］。Ghrelin和GHSR在人的睪丸中均有mRNA與蛋白表達(dá)［22］。Ghrelin和GHSR-1a能顯著抑制大鼠睪酮的分泌［23］。Miller等［24］用免疫組化方法，檢測(cè)出在成年綿羊睪丸組織中Ghrelin與GHSR-1a的表達(dá)有季節(jié)性變化，而胎齡對(duì)綿羊胎兒睪丸組織中以上2個(gè)基因的蛋白表達(dá)有非常顯著的影響。方富貴等［9］研究表明，手術(shù)去勢(shì)、免疫去勢(shì)和未去勢(shì)公豬下丘腦 Ghrelin與GHSR基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異不顯著，未去勢(shì)公豬垂體Ghrelin mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著低于手術(shù)閹割去勢(shì)公豬，免疫去勢(shì)公豬睪丸中 Ghrelin受體mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于未去勢(shì)公豬。這表明公豬生殖軸存在Ghrelin mRNA和功能性Ghrelin受體mRNA，且手術(shù)閹割去勢(shì)導(dǎo)致垂體中Ghrelin mRNA 的相對(duì)表達(dá)量增加，免疫去勢(shì)增加了睪丸Ghrelin受體mRNA的相對(duì)表達(dá)量，提示Ghrelin可能對(duì)生殖軸有調(diào)節(jié)功能。Fang等［25］研究了公豬睪丸中Ghrelin與GHSR-1a基因mRNA表達(dá)水平與血清睪酮水平之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，免疫去勢(shì)公豬睪丸中Ghrelin與GHSR-1a基因mRNA表達(dá)水平顯著高于未去勢(shì)公豬，血清中睪酮水平顯著低于未去勢(shì)公豬；GHSR-1a與Ghrelin基因表達(dá)有正相關(guān)關(guān)系，卻與血清中睪酮水平呈負(fù)相關(guān)。這表明Ghrelin有調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物睪丸功能的作用，這與本研究結(jié)果基本一致。即雄性不育的犏牛睪丸中Ghrelin及GHRS mRNA的表達(dá)均顯著高于有生育能力的牦牛，這就從分子水平上解釋了犏牛 Ghrelin與GHRS mRNA的高表達(dá)可能是犏牛雄性不育的原因之一，而關(guān)于犏牛、牦牛睪丸組織中Ghrelin與GHSR蛋白的表達(dá)水平還需要進(jìn)一步研究。

綜上可以認(rèn)為，相對(duì)于牦牛睪丸組織，犏牛睪丸組織中Ghrelin與GHSR基因mRNA均高表達(dá)可能是犏牛雄性不育的原因之一，這將為最終解決犏牛雄性不育問題的研究奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

Expression level of Ghrelin and GHSR mRNA in testis of cattle-yak and yak

ZHAO Yan-ling，REN Zi-li，LI Yu-xin，WANG Jian-zhou，SHANG Peng，CHAMBA Yangzom
（Faculty of Animal Science，Tibet Agricultural and Animal Husbandry College，Linzhi 860000，China）

The expression level of Ghrelin and growth hormone secretagogue receptor（GHSR） gene mRNA tested respectively in testis of cattle-yak and yak by using fluorescence quantitative polymerase chain reaction （PCR）. The results showed that Ghrelin mRNA expression level in cattle-yak testis was significantly higher than that in yak （0.8177±0.0225，0.4656±0.0222，P＜0.05）. Similarly，GHSR mRNA expression level in cattleyak testis was significantly higher than that in yak（0.8622±0.0347，0.4722±0.0761，P＜0.05）. These results indicated that both Ghrelin and GHSR mRNA expression level in cattle-yak testis was significantly higher than that in yak，which was likely to be one of the reasons for male infertility of cattle-yak.

cattle-yak；testis；Ghrelin；GHSR；mRNA expression

S823.8+52；Q344+.13

A

1004-874X（2016）07-0151-07

2015-12-03

西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院2014年度高校生均獎(jiǎng)補(bǔ)資金重點(diǎn)學(xué)科發(fā)展保障平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目；西藏特色畜牧資源創(chuàng)新平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目；西藏自治區(qū)自然科學(xué)基金（2015ZR-13-32）

趙彥玲（1972-），女，碩士，副教授，E-mail：ylzhaohn@163.com

強(qiáng)巴央宗（1965-），女，藏族，博士，教授，E-mail：qbyz628@126.com