陳偉國，李廣偉，嚴(yán)專強(qiáng)，謝青梅（. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 5064；. 廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東 云浮 57400）

J亞群禽白血病病毒受體基因NHE1的遺傳多態(tài)性分析

陳偉國1，李廣偉2，嚴(yán)專強(qiáng)2，謝青梅1
（1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2. 廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東 云浮 527400）

為發(fā)掘J亞群禽白血病病毒（ALV-J）受體基因NHE1潛在的遺傳抗性位點(diǎn)，采用PCR技術(shù)分段擴(kuò)增NHE1受體基因序列，并分析其遺傳多態(tài)性。結(jié)果顯示，在黃羽肉雞NHE1基因外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了16個SNP突變，分別為c.309 G＞C，c.11653 C＞T，c.11689 G＞A，c.11917 C＞T，c.11946 C＞T，c.13405 C＞A，c.13429 T＞C，c.13438 T＞C，c.14108 A＞C，c.14516 A＞G，c.14522 G＞A，c.14654 C＞T，c.15834 G＞A，c.15873 G＞A，c.17560 C＞G and c.17770 G＞A。進(jìn)一步分析表明這些SNP突變均為同義cSNP，未引起氨基酸發(fā)生改變；在黃羽肉雞NHE1基因內(nèi)含子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了SNP和插入/缺失突變，NHE1基因內(nèi)含子2 c.12239～12240 和c.13114～13115分別存在AGGGCTGC和TGAAGCC插入突變，內(nèi)含子11 c.17073～17091存在TGTCCTGTGTCCTCCCTGC缺失突變；在ALV-J攻毒后陰性雞和陽性雞的NHE1基因外顯子區(qū)域均發(fā)現(xiàn)c.309 G＞C、c.11653 C＞T、c.13405 C＞A、c.13438 T＞C、c.14108 A＞C和c.14516 A＞G 6個SNP突變，內(nèi)含子區(qū)域也均發(fā)現(xiàn)與黃羽肉雞相同的插入/缺失突變。研究結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)的NHE1受體基因遺傳變異位點(diǎn)不能作為ALV-J潛在的遺傳抗性位點(diǎn)。

J亞群禽白血病病毒；NHE1受體基因；序列分析；遺傳多態(tài)性

陳偉國，李廣偉，嚴(yán)專強(qiáng)，等. J亞群禽白血病病毒受體基因NHE1的遺傳多態(tài)性分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（7）：145-150.

J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒（ALV-J）引起的一種免疫抑制性腫瘤性傳染?。?］。ALV-J可引起感染雞群產(chǎn)生免疫抑制、生產(chǎn)性能下降，乃至發(fā)生血管瘤、骨髓瘤等特征性腫瘤而死亡，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2-3］。迄今為止，該病尚無商品化疫苗和有效的治療方法，主要通過凈化種群和生物安全措施進(jìn)行預(yù)防［4］。近年來，已從商業(yè)肉雞、蛋雞品系和地方雞種中分離出ALV-J［5-7］?？梢姡F(xiàn)有措施并不能完全控制J亞群禽白血病在中國普遍發(fā)生與流行，該病已成為威脅我國養(yǎng)雞業(yè)（尤其是種雞業(yè)）可持續(xù)健康發(fā)展的重大疾病之一。因此，研發(fā)更適合防控ALV-J的新策略已迫在眉睫。近年有研究表明，抗病育種可以成為防控禽白血病的有效策略［8］。

禽白血病病毒（ALV）必須通過特異性受體侵入宿主細(xì)胞，不同亞群的ALV 由相應(yīng)的細(xì)胞表面特異性受體介導(dǎo)侵入宿主細(xì)胞，繼而發(fā)生感染［9］。Chai等［10］證實ALV-J 侵入宿主細(xì)胞的受體是1型鈉氫交換蛋白（NHE1）。受體基因的遺傳變異會引起宿主對ALV的感染產(chǎn)生遺傳抗性。Kucerová等［11］報道了ALV-J的NHE1受體蛋白第38位氨基酸（色氨酸）的缺失，導(dǎo)致ALV-J宿主細(xì)胞對ALV-J的感染產(chǎn)生遺傳抗性。然而，關(guān)于中國雞種ALV-J受體基因NHE1是否存在潛在的遺傳抗性位點(diǎn)仍有許多未知。本研究擬通過分析ALV-J受體基因NHE1的遺傳多態(tài)性，以期發(fā)掘ALV-J受體基因NHE1潛在的遺傳抗性位點(diǎn)，為進(jìn)一步研究宿主遺傳抗ALV-J的感染提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

惠陽胡須雞和杏花雞的DNA樣品保存于廣東省畜禽健康養(yǎng)殖與環(huán)境控制（企業(yè)）重點(diǎn)實驗室?？齑簏S雞、矮腳黃雞、青腳麻雞、208、411和603商業(yè)肉雞品系的血液樣品采自廣東溫氏食品集團(tuán)祖代種雞場，每個雞種10個樣品。ALV-J攻毒后陰性雞和陽性雞培育于廣東省畜禽健康養(yǎng)殖與環(huán)境控制（企業(yè)）重點(diǎn)實驗室［12-13］。ALV-J攻毒后陰性雞和陽性雞樣品分別為12、18個。血液樣品的DNA提取按照血液DNA抽提試劑盒說明書進(jìn)行，抽提的DNA 于-20℃下保存。

主要試劑：Premix PrimeSTAR HS和DL2000 DNA Marker購自大連寶生物公司，血液DNA抽提試劑盒購自天根生化科技有限公司，其他試劑為本實驗室自配。

1.2試驗方法

1.2.1引物設(shè)計及合成 根據(jù)GenBank 已收錄的原雞 N H E 1 基因序列（登錄號：NC_006110.4）設(shè)計7對引物用于PCR擴(kuò)增ALV-J受體基因NHE1，擴(kuò)增引物信息見表1，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。由于NHE1受體基因內(nèi)含子1過長，共11 340 bp，涵蓋了c.329～11567，故不對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.2NHE1基因的PCR擴(kuò)增 NHE1基因7個片段的PCR擴(kuò)增體系為25 μL：Premix PrimeSTAR HS 12.5 μL，DNA模板1 μL，F(xiàn)/R引物（10 μmol/L）各0.5 μL，雙蒸水補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s、55～60℃退火45 s、72℃延伸1～1.5 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min，12℃終止。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送美吉生物科技公司進(jìn)行測序。

1.2.3NHE1基因的序列分析 運(yùn)用DNAStar Lasergene 7.1軟件對不同黃羽肉雞品種（系）NHE1基因的測序結(jié)果進(jìn)行拼接，并與GenBank登陸的原雞NHE1基因序列進(jìn)行比對，分析不同黃羽肉雞品種（系）NHE1基因的遺傳多態(tài)性，以及對ALV-J攻毒后陰性雞和陽性雞NHE1基因的序列進(jìn)行分析。

表1 NHE1基因PCR擴(kuò)增引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1黃羽肉雞NHE1基因的PCR擴(kuò)增

利用PCR方法擴(kuò)增出了NHE1 基因序列的7個目的片段，通過瓊脂糖凝膠電泳（圖1）可見，PCR擴(kuò)增條帶大小與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致。

圖1 NHE1基因7個片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2黃羽肉雞NHE1基因的序列分析

將NHE1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送測序公司進(jìn)行測序，對7個片段的測序結(jié)果運(yùn)用DNAStar Lasergene 7.1進(jìn)行拼接，獲得NHE1基因全長序列（內(nèi)含子1除外）。將其與GenBank收錄的原雞NHE1基因序列（登錄號：NC_006110.4）進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)在外顯子區(qū)域存在16個SNP突變，分別為c.309 G＞C、c.11653 C＞T、c.11689 G＞A、c.11917 C＞T、c.11946 C＞T、c.13405 C＞A、c.13429 T＞C、c.13438 T＞C、c.14108 A＞C、c.14516 A＞G、c.14522 G＞A、c.14654 C＞T、c.15834 G＞A、c.15873 G＞A、c.17560 C＞G和c.17770 G＞A，這些SNP變異位點(diǎn)分別位于外顯子1、2、3、4、5、8、12等6個外顯子區(qū)域，且不同雞種發(fā)生的SNP突變位點(diǎn)的數(shù)量、位置及其頻率均存在差異（表2）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這16個SNP突變均為同義cSNP，未引起氨基酸發(fā)生改變，其在NHE1 基因mRNA序列（GenBank登錄號：NM_001044643.1）分別位于第309、414、450、678、708、888、912、921、1233、1311、1317、1449、1686、1725、2130和2340位核苷酸（表3）。

在黃羽肉雞的NHE1基因內(nèi)含子區(qū)域發(fā)現(xiàn)插入/缺失突變，內(nèi)含子2 c.12239～12240 和c.13114～13115分別發(fā)生AGGGCTGC 和TGAAGCC序列插入突變，內(nèi)含子11 c.17073～17091發(fā)生TGTCCTGTGTCCTCCCTGC序列缺失突變，不同雞種NHE1基因內(nèi)含子區(qū)域的遺傳變異情況見表4。另外，NHE1基因內(nèi)含子區(qū)域發(fā)現(xiàn)多個SNP突變（未列出）。

表2 黃羽肉雞NHE1基因外顯子區(qū)域的遺傳多態(tài)性

表3 黃羽肉雞NHE1基因外顯子區(qū)域SNP突變信息

表4 黃羽肉雞NHE1基因內(nèi)含子區(qū)域的遺傳多態(tài)性

2.3ALV-J攻毒后陰性雞和陽性雞NHE1基因的序列分析

ALV-J攻毒后的陰性雞NHE1基因序列與原雞相比，發(fā)現(xiàn)在外顯子區(qū)域存在6個SNP突變，其在第309、11653、13405、13438、14108和14516位核苷酸發(fā)生G→C、C→T、C→A、T→C、A→C和A→G改變，在內(nèi)含子區(qū)域發(fā)現(xiàn)插入/缺失突變，內(nèi)含子2 c.12239～12240 和c.13114～13115分別發(fā)生AGGGCTGC和TGAAGCC插入突變，內(nèi)含子11 c.17073～17091發(fā)生TGTCCTGTGTCCTCCCTGC序列缺失突變；而在ALV-J攻毒后陽性雞NHE1基因中，發(fā)現(xiàn)與ALV-J攻毒后陰性雞存在相同的遺傳突變（表5）。

3　討論

NHE1是一種跨膜蛋白，涉及細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、增殖與凋亡等多種功能，與多腫瘤性疾病有密切關(guān)系［14］，是ALV-J的受體蛋白［10］。蔡黎明等［15］研究表明，NHE1蛋白在ALV-J感染引起的致病、致腫瘤過程中也發(fā)揮著重要作用。

表5 ALV-J攻毒后陰性雞和陽性雞NHE1基因的遺傳多態(tài)性

ALV-J用NHE1受體基因編碼的受體蛋白介導(dǎo)侵入宿主細(xì)胞，繼而發(fā)生感染。近年來有研究表明，受體基因的遺傳突變會導(dǎo)致宿主對ALV的感染產(chǎn)生完全抗性或易感性降低。Kucerová等［9］報道了ALV-J的NHE1受體蛋白第38位氨基酸的缺失，引起宿主對ALV-J的感染產(chǎn)生遺傳抗性。Reini?ová等［16］報道白來航品系M的tvb受體基因外顯子4發(fā)生SNP突變，導(dǎo)致TVB受體蛋白第125位氨基酸由半胱氨酸置換位絲氨酸，引起白來航品系M對ALV-B/D感染的易感性降低，對ALV-E的感染產(chǎn)生完全抗性。本研究在黃羽肉雞ALV-J受體基因NHE1外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了16個SNP突變，但這些SNP突變均為同義cSNP，未引起氨基酸發(fā)生改變。而在ALV-J攻毒后陰性雞和陽性雞均發(fā)現(xiàn)其中的6個SNP突變，提示這些NHE1受體基因SNP突變不能作為作為ALV-J潛在的遺傳抗性位點(diǎn)。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，中國雞種ALV-A受體基因tva內(nèi)含子1破裂點(diǎn)信號保守區(qū)域c.502～511和c.502～516分別發(fā)生CGCTCACCCC和CGCTCACCCCGCCCC序列缺失突變，導(dǎo)致內(nèi)含子1保留于tva受體基因mRNA中，并產(chǎn)生一個提前終止密碼子，干擾了tva受體基因mRNA的剪切，從而降低了宿主對ALV-A感染的易感性［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，黃羽肉雞ALV-J受體基因NHE1內(nèi)含子2 c.12239～12240和c.13114～13115分別發(fā)生AGGGCTGC和TGAAGCC序列插入突變，內(nèi)含子11 c.17073～17091發(fā)生TGTCCTGTGTCCTCCCTGC序列缺失突變，然而，在ALV-J攻毒后陰性雞和陽性雞的NHE1受體基因也均發(fā)現(xiàn)存在上述的插入/缺失突變，提示發(fā)現(xiàn)的NHE1受體基因插入/缺失突變不能進(jìn)一步作為ALV-J潛在的遺傳抗性位點(diǎn)去進(jìn)行功能驗證。綜上所述，本研究在ALV-J受體基因NHE1外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)的SNP突變及內(nèi)含子區(qū)域發(fā)現(xiàn)的插入/缺失突變不能直接作為ALV-J潛在的遺傳抗性位點(diǎn)。

［1］ Fadly A M，Nair V. Leukosis/sarcoma group［M］. Ames，IA：Blackwell Publishing，2008：514-568.

［2］ Payne L N，Nair V. The long view：40 years of avian leukosis research［J］. Avian Pathol，2012，41：11-19.

［3］ 崔治中. 我國雞群J亞群白血病流行的過去、現(xiàn)在和將來及其防控—— 對我國動物疫病防控的啟示［J］. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2015（1）：30-32.

［4］ 崔治中. 種雞場禽白血病防控和凈化技術(shù)方案［J］. 中國家禽，2015，37（23）：1-7.

［5］ 李昕鍵，李廣偉，嚴(yán)一銘，等. 2014—2015年廣東省5個黃羽肉種雞場禽白血病感染情況調(diào)查［J］. 中國家禽，2015，37（22）：72-74.

［6］ Gao Y，Yun B，Qin L，et al. Molecular epidemiology of avian leukosis virus subgroup J in layer flocks in china［J］. Journal of Clinical Microbiology，2012，50（3）：953-960.

［7］ 張勝斌，吳天威，韋平，等. 地方優(yōu)良雞種禽白血病病毒感染調(diào)查及凈化［J］. 中國家禽，2010 （12）：11-16.

［8］ Jie H，Liu Y P. Breeding for disease resistance in poultry：opportunities with challenges［J］. World's Poultry Science Journal，2011，67：687-695.

［9］ Barnard R J，Elleder D，Young J A T，et al. Avian sarcoma and leucosis virus-receptor interactions：from classical genetics to novel insights into virus-cell membrane vision［J］. Virology，2006，344：25-29.

［10］ Chai N，Bates P. Na/H exchanger type 1 is a receptor for pathogenic subgroup J avian leukosis virus［J］. Proc Natl Acad Sci 2006，103：5531-5536.

［11］ Ku?erová D，PlachY J，Reini?ová M，et al. Nonconserved tryptophan 38 of the cell surface receptor for subgroup J avian leukosis virus discriminates sensitive from resistant avian species［J］. J Virol，2013，87：8399-8407.

［12］ 李廣偉. 廣東省禽白血病流行病調(diào)查及J亞群遺傳抗病探究［D］. 廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

［13］ 嚴(yán)專強(qiáng). J亞群禽白血病病毒分子進(jìn)化特征及宿主遺傳抗性研究［D］. 廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

［14］ Reshkin S J，Bellizzi A，Caldeira S，et al. Na+/H+ exchanger-dependent intracellular alkalinization is an early event in malignant transformation and plays an essential role in the development of subsequent transformation-associated phenotypes ［J］. FASEB Journal，2000，14（14）：2185-2197.

［15］ 蔡黎明，王真真，王言明，等. 禽白血病病毒J亞群自然感染蛋雞病毒負(fù)載、受體表達(dá)及致瘤譜關(guān)系［J］. 病毒學(xué)報，2013（5）：515-521.

［16］ Reini?ová M，Senigl F，Yin X，et al. A singleamino-acid substitution in the TvbS1 receptor results in decreased susceptibility to infection by avian sarcoma and leukosis virus subgroups B and D and resistance to infection by subgroup E in vitro and in vivo［J］. Journal of Virology，2008，82（5）：2097-2105.

［17］ Chen W G，Liu Y，Li H X，et al. Intronic deletions of tva receptor gene decrease the susceptibility to infection by avian sarcoma and leukosis virus subgroup A［J］. Sci Rep，2015，5：9900.

（責(zé)任編輯 崔建勛）

Analysis on genetic polymorphism of avian leukosis virus subgroup J receptor gene NHE1

CHEN Wei-guo1，LI Guang-wei2，YAN Zhuan-qiang2，XIE Qing-mei1
（1. College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2. Guangdong Wen’s Food Group Co.，Ltd.，Yunfu 527400，China）

To explore the potential genetic resistance loci in avian leukemia virus subgroup J （ALV-J） receptor gene NHE1，the sequence of NHE1 receptor gene was amplified by PCR technique，and the genetic polymorphism of NHE1 gene was analyzed. The results indicated that 16 SNP mutations，including c.309 G＞C，c.11653 C＞T，c.11689 G＞A，c.11917 C＞T，c.11946 C＞T，c.13405 C＞A，c.13429 T＞C，c.13438 T＞C，c.14108 A＞C，c.14516 A＞G，c.14522 G＞A，c.14654 C＞T，c.15834 G＞A，c.15873 G＞A，c.17560 C＞G and c.17770 G＞A，were found within the exon region of NHE1 gene in yellow broilers，these SNPs were synonymous with cSNP and the changes of amino acid were not caused by further analysis. In addition，SNPs and insertion/deletion mutations were also found within the intron region of NHE1 gene in yellow broilers，the AGGGCTGC was inserted between c.12239 and 12240 and the TGAAGCC was inserted between c.13114 and 13115 within the intron 2 of NHE1 gene，respectively，and theTGTCCTGTGTCCTCCCTGC among c.17073-17091 was deleted in intron 11 of NHE1 gene. Furthermore，6 SNPs c.309 G＞C，c.11653 C＞T，c.13405 C＞A，c.13438 T＞C，c.14108 A＞C and c.14516 A＞G within the exon region，as well as insertion/deletion mutations within the intron region that were same with yellow broilers，were found in NHE1 gene of the negative and positive chickens after inoculated by ALV-J. The results demonstrated that the genetic mutation loci found in receptor gene NHE1 may not be used as potential genetic resistance loci of ALV-J.

ALV-J；NHE1 receptor gene；sequence analysis；genetic polymorphism

S858.317.4；Q346+.5

A

1004-874X（2016）07-0145-06

2016-04-12

廣東省自然科學(xué)基金團(tuán)隊項目（S2013030013313）

陳偉國（1981-），男，碩士，助理研究員，E-mail：wgchen81@scau.edu.cn

謝青梅（1972-），女，博士，教授，E-mail：qmx@scau.edu.cn