張 喆，張 正，曾永三（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物保護(hù)系，廣東 廣州 510225）

昆蟲病原線蟲Oscheius myriophila的形態(tài)和分子特征

張 喆，張 正，曾永三
（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物保護(hù)系，廣東 廣州 510225）

2010—2013年在昆蟲病原線蟲調(diào)查中，從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物園采集土樣，利用大蠟螟（Galleria mellonella）誘集，獲得1個小桿類昆蟲病原線蟲種群（華農(nóng)種群HN）。該線蟲雌蟲的形態(tài)符合Oscheius myriophila的原始描述，測量值中除蟲體寬度（70～123 vs 57～70 μm）和口腔寬度（5～8 vs ＜4.5 μm）更寬、尾更長（138～188 vs 108～135 μm）外，其余特征值均在該種原始描述的范圍內(nèi)；用HN種群的18S和28S rDNA序列進(jìn)行Blast搜尋和比對，結(jié)果表明該種群18S序列與GenBank中的O. myriophila （AY602176）的相似度高達(dá)99%（1512/1514=99%），28S序列與O. myriophila（U81588）的相似度達(dá)100%（609/609=100%）。分子系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，HN與GenBank中的多個O. myriophila種群以高置信度聚在相同的Insectivorus 支系。綜合形態(tài)學(xué)和18S和28S rDNA序列特征，確定華農(nóng)種群HN為Oscheius myriophila。

昆蟲病原線蟲；小桿線蟲；Oscheius myriophila；18S rDNA；28S rDNA

張喆，張正，曾永三. 昆蟲病原線蟲Oscheius myriophila 的形態(tài)和分子特征［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（7）：87-92.

昆蟲病原線蟲隸屬于斯氏線蟲科（S t e i n e r n e m a t i d a e）、異小桿線蟲科（Heterorhabdidae）和小桿科（Rhabdidae） 線蟲。長期以來，昆蟲病原線蟲分類依據(jù)為傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征。但是同種的個體形態(tài)特征往往會隨營養(yǎng)和培養(yǎng)等條件的不同而產(chǎn)生差異，給昆蟲病原線蟲的分類鑒定帶來困難。20世紀(jì)80年代后，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，大大促進(jìn)了昆蟲病原線蟲的分類和鑒定。一些DNA分子標(biāo)記如RAPD （Random Amplification Polymorphic DNA）、RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism），18S、28S rDNA基因和ITS（Internal Transcribed Spacer）區(qū)序列已被用于昆蟲病原線蟲種類的鑒定［1-8］。在2010—2013年進(jìn)行昆蟲病原線蟲調(diào)查中，我們從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園分離到1個種群，稱為華農(nóng)種群（HN），并研究了該種群的形態(tài)和分子特征，鑒定了該種群，為該線蟲的應(yīng)用研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1土樣采集

2012年7月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園中的植物園采用5點(diǎn)取樣法在表土下10～20 cm處采集土壤樣品，每點(diǎn)采集3份，每份約1 kg，共15份。然后，混勻土樣并裝入塑料盒，用大蠟螟（Galleria mellonella）誘集土壤中的昆蟲病原線蟲。

1.2昆蟲病原線蟲的誘集

在塑料盒中盛200 g 土壤，并將3頭大蠟螟末齡幼蟲埋入土壤中作為活體誘餌，之后將塑料盒子置于20～25℃條件下，5 d后檢查大蠟螟的存活情況，將被線蟲寄生致死的大蠟螟尸體收集，轉(zhuǎn)移至線蟲收集盤［9-10］進(jìn)行昆蟲病原線蟲的收集。每個土樣均設(shè)3次重復(fù)。

1.3線蟲收集盤

線蟲收集盤示意圖見圖1。其設(shè)置參考White［9］的方法。將高1 cm、直徑6 cm的小培養(yǎng)皿倒置于大培養(yǎng)皿（高2 cm，直徑12.5 cm）底部。在小培養(yǎng)皿頂放1張與小培養(yǎng)皿直徑大小一致的圓形濾紙，另加放1長條形濾紙，然后向大培養(yǎng)皿中注入足量的滅菌水，保證條形濾紙兩端浸在水里，并使圓形濾紙始終保持濕潤狀態(tài)。最后將上述螟蟲尸體置于濕潤的濾紙上，10～15 d后檢查是否有昆蟲病原線從大蠟螟尸體中游到水中。當(dāng)線蟲達(dá)到一定量后，將水倒入50 mL小燒杯中凈化線蟲。同時重新向培養(yǎng)皿中加入新的滅菌水，進(jìn)行下一次收集，反復(fù)幾次，以收集足夠多的線蟲。

圖1 線蟲收集盤示意圖

1.4昆蟲病原線蟲的純化和保存

用無菌水反復(fù)多次純化收集到的線蟲。具體操作：將上述收集的線蟲倒入200 mL燒杯，加入足量的無菌水，靜置約30 min，待線蟲沉到燒杯底后，輕輕倒去上層的水，如此重復(fù)4～5次。在8～12℃冰箱中保存凈化好的線蟲懸浮液。為延續(xù)線蟲種群，每隔3個月左右用大蠟螟末齡幼蟲重新繁殖線蟲1次?；蛴煤?.1%甲醛水溶液的海綿于在8～12℃的冰箱中長期保存線蟲。

1.5昆蟲病原線蟲的繁殖

用大蠟螟繁殖線蟲，即將1張始終保持濕潤的無菌濾紙放在直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，加入10頭大蠟螟，然后用分離到的昆蟲病原線蟲接種大蠟螟，7 d后檢查線蟲的侵染和大蠟螟的死亡情況。

1.6昆蟲病原線蟲的形態(tài)學(xué)

將待鑒定線蟲熱殺死（60℃，3 min），并用FA固定液固定，在LEICA（DM4000B）顯微鏡下進(jìn)行觀察、測量與描述，并用LEICA （DFC490）相機(jī)拍攝重要形態(tài)特征圖，圖片用Photoshop CS6編輯。

1.7昆蟲病原線蟲的分子特征

1.7.1線蟲DNA的提取 先將單條線蟲加入到含20 μL預(yù)冷的含蛋白酶K的WLB液［11］的離心管中，將離心管置于70℃恒溫水浴中至少1 h，之后95℃下溫育15 min，使蛋白酶K失活。然后高速離心（12 000 r/min ） 2 min，取上清液進(jìn)行PCR擴(kuò)增或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增18S的正向引物為18SnF （5' TGGATAACTGTGGTAATTCTAGAGC 3'），反向引物為18SnR（5' TTACGACTTTTGCCCGGTTC 3'）［12］；擴(kuò)增 28S的正向引物為 D2a（5' ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG 3'），反向引物為D3b（5' TGCGAAGGAACCAGCTACTA 3'）［13］。在25 μL PCR反應(yīng)體系中含有1 μL正向引物，1 μL反向引物，9.5 μL ddH2O，12.5 μL MixTaqDNA聚合酶，1 μL線蟲DNA模板。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10 min［14］。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖（含Goldview）凝膠電泳檢測，用0.5×TBE作電泳緩沖液（Tris-base 54.00 g，硼酸27.50 g，EDTA（0.5 M，pH 8.0）20 mL，ddH2O 980 mL），在電壓120 V下電泳20 min，用Kodak GEL LOGIC 200 IMAGING SYSTEM 凝膠成像系統(tǒng)觀察和拍攝。

1.7.3DNA測序及序列分析 將PCR產(chǎn)物由六合華大基因科技股份有限公司測序部純化后，用3730全自動測序儀（美國ABI公司）進(jìn)行測序。所得序列及與其高匹配的GenBank中的線蟲序列經(jīng)ClustalW比對后，再利用 MEGA5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析待鑒定線蟲與相關(guān)線蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

2　結(jié)果與分析

2.1形態(tài)特征

2.1.1形態(tài)測量值 待鑒定線蟲雌蟲的形態(tài)測量值見表1。與Poinar［15］對小桿屬線蟲Rhabditis （Oscheius） myriophila的原始描述相比，蟲體寬度（70～123 vs 57～70μm）和口腔寬度（5～8 vs ＜4.5μm）更寬、尾更長（138～188 vs 108～135μm），其余特征值均在該種原始描述的范圍內(nèi)。

2.1.2形態(tài)特征描述 雌蟲：熱殺死后雌蟲體直或略向腹面彎曲。表皮光滑，頭頸連貫?？谇婚L而窄，柱形，清楚。唇口腔壁沒有明顯骨化，后口腔壁同型。食道前體部柱形，后部稍膨大形成中食道球。食道基球發(fā)達(dá)，卵圓形，具有發(fā)育良好的瓣門。排泄孔位于后食道基部球附近。雙卵巢，有回折。陰門在體中部或近中部，為一橫向裂縫，陰唇略突起。尾圓錐狀，漸趨細(xì)（圖2）。

表1 昆蟲病原線蟲Oscheius myriophila華農(nóng)種群（HN）雌蟲形態(tài)測量值（μm）

侵染性二齡幼蟲：熱殺死后蟲體直?？谇?、食道形態(tài)與成蟲相似。尾圓錐狀，末端細(xì)長（圖2 E、J）。

雄蟲：未見。

待鑒定線蟲雌蟲和幼蟲形態(tài)特征與前人［15-16］對Oscheius myriophila的描述相符。

2.2分子生物學(xué)特征

2.2.1PCR擴(kuò)增 用18S引物18snF/18snR，28S引物D2a/D3b進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到18S擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為1 529 bp，28S的大小為627 bp。

2.2.2DNA序列比對 將待鑒定線蟲種群的18S和28S rDNA序列進(jìn)行Blast搜尋和比對，結(jié)果表明該線蟲種群18S序列與GenBank 中Oscheius myriophila種群（AY602176）的相似度高達(dá)99%（1512/1514=99%）；該線蟲種群28S序列與GenBank中Oscheius myriophila種群（U81588）的相似度為100% （609/609=100%）。

圖2 昆蟲病原線蟲Oscheius myriophila HN種群光學(xué)顯微形態(tài)特征

2.2.3與相近種的分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 從基于18S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出，所選的31個線蟲種群分成2個大支系，其中隸屬于Oscheius屬的所有21個種群都聚在1個支系，該支系又分成2個明顯的小支系，即Insectivorus （食昆蟲的） 支系和Dolichurus （長尾的） 支系。本研究的O. myriophila HN種群與其中9個種群聚在Insectivorus支系，置信度為100，在這個支序中，華農(nóng)種群（O. myriophila HN）又與3個O. myriophila種群（KP756941，RSU13936，U81588）及1個Oscheius的未知種（AF082994）以100的置信度聚在一起。而另一類昆蟲病原線蟲——異小桿線蟲（Heterorhabditis）則被聚在另一個大支系中（圖3），說明Oscheius和Heterorhabditis的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

在由28S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出，所選的Oscheius屬的11個種群包括華農(nóng)種群（O. myriophila HN）以高置信度（95）聚在1個支系中，該支系也分成Insectivorus和Dolichurus兩個小支系。華農(nóng)種群（O. myriophila HN）與其中8個種群聚在Insectivorus支系，置信度為88，在此支系中，O. myriophila HN種群又與同種的另一種群（AY602176）以99的置信度聚在一起。 而O. tupilae 和O. guentheri種群則以100的置信度聚在Dolichurus支系（圖4）。

圖3 基于rDNA 18S序列構(gòu)建的昆蟲病原線蟲系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 基于rDNA 28S序列構(gòu)建的昆蟲病原線蟲系統(tǒng)發(fā)育樹

3　結(jié)論與討論

小桿線蟲屬Oscheius由Andrássyd 在1976年建立，其特點(diǎn)是具有短的口腔和沒有真正的中食道球。Sudhaus［17］、Sudhaus & Hooper［18］將其作為亞屬放在Rhabditis中，并根據(jù)雄蟲交合刺和尾形態(tài)分成兩個類群，即Insectivorus和Dolichurus。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征分析，在采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園植物園土壤中誘集獲得的昆蟲病原線蟲（華農(nóng)種群HN）雖然未觀察到雄蟲，但雌蟲形態(tài)與Poinar［15］和董臘梅［16］對Oscheius myriophila的描述相符；另外，18S 和28S rDNA序列分析也表明華農(nóng)種群（HN）與來自GenBank中的多個O. myriophila種群序列相似度高達(dá)99%；分子系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示華農(nóng)種群與GenBank中的多個O. myriophila種群以高置信度聚在相同的Insectivorus 支系。因此，結(jié)合形態(tài)和分子特征，將華農(nóng)種群（HN）定為Oscheius myriophila。

昆蟲病原線蟲是目前最具應(yīng)用前景的生物殺蟲劑之一，其毒力強(qiáng)、寄主范圍廣，對各種隱蔽性害蟲，尤其是地下害蟲防治具有巨大的應(yīng)用潛力。本研究中的華農(nóng)種群（O. myriophila HN）是通過大蠟螟誘集獲得，在誘集過程中，我們觀察到該線蟲對大蠟螟末齡幼蟲具有很強(qiáng)的致死能力。該種群對其他農(nóng)業(yè)重要害蟲是否具有致病性還有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 楊賢智）

Morphological and molecular characteristics of an entomopathogenic nematode，Oscheius myriophila

ZHANG Zhe， ZHANG Zheng， ZENG Yong-san
（Department of Plant Protection， Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225， China）

During the survey of entomopathogenic nematodes from 2010 to 2013， an entomopathogenic nematode population named Huanong （HN） trapped by using Galleria mellonella was isolated from soil samples collected from botanical garden in campus of South China Agricultural University. Morphological characteristics of the HN population female agreed with the original description of species Oscheius myriophila，and morphometrics of the population fitted into ranges of the original except for a wider body width （70-123 vs 57-70 μm） and stomal width （5-8 vs ＜4.5 μm）， and a longer tail （138-188 vs 108-135 μm）. Blast and alignment of rDNA sequences of the HN revealed identity of 99% （1512/1514=99%） with O. myriophila （AY602176）for 18S and 100% （609/609=100%） with O. myriophila （U81588）for 28S. Molecular phylogenetic analysis indicated that the HN and several populations of O. myriophila from GenBank were clustered into Insectivorus clade with high bootstraps. The HN was identified as Oscheius myriophila based on morphology and analysis of 18S and 28S rDNA sequences.

entomopathogenic nematode；Rhabditid；Oscheius myriophila；18S rDNA；28S rDNA

S476.15

A

1004-874X（2016）07-0087-06

2015-09-28

廣東省科技計劃項(xiàng)目（2011B020308010）

張喆（1989-），男，在讀碩士生，E-mail：188295037@qq.com

曾永三（1965-），男，博士，教授，E-mail：zys65@163.com