徐文嫻，趙從舉，朱敏捷，吳喆瀅，韓 奇，鄭慶揚（. 海南師范大學地理與旅游學院，海南 ?？?5758；. 海南師范大學生命科學學院，海南 ?？?5758）

海南島桉樹人工林土壤微生物功能多樣性特征

徐文嫻1，趙從舉1，朱敏捷1，吳喆瀅2，韓 奇1，鄭慶揚1
（1. 海南師范大學地理與旅游學院，海南 ?？?571158；
2. 海南師范大學生命科學學院，海南 ?？?571158）

運用 Biolog-ECO微平板技術(shù)，對海南島4齡桉樹人工林不同土層深度的土壤微生物群落功能多樣性的動態(tài)變化進行分析。結(jié)果表明：隨著培養(yǎng)時間的延長，土壤微生物平均AWCD逐漸增大，代謝活性逐漸增強，300 h時AWCD值下層土＞中層土＞上層土；不同土層微生物對胺類碳源利用率最高，酚酸類、氨基酸類和多聚物類次之，碳水化合物和羧酸類最低；隨著土層深度增加Shannon多樣性指數(shù)（H）逐漸增大，20～30 cm McIntosh豐富度指數(shù)（U）和Simpson優(yōu)勢度指數(shù)（D）明顯高于其他土層，而McIntosh均勻度指數(shù)（E）又顯著較低，0～10 cm土層的Shannon多樣性指數(shù)（H）、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)（D）和McIntosh豐富度指數(shù)（U）均較低，即桉樹人工林表層土壤的微生物活性受到不同程度的抑制；主成分分析（PCA）表明，在31種碳源中提取的2個主成分因子分別可以解釋所有變量方差的41.65%和32.51%，對PC1和PC2起分異作用的主要碳源為碳水化合物、氨基酸及其衍生物類和胺類；土壤微生物功能多樣性還受土壤性狀的綜合調(diào)控，尤其與土壤有機質(zhì)、土壤容重和土壤堿解氮含量相關(guān)性最明顯。

Biolog-ECO微平板； 桉樹人工林； 功能多樣性； 土壤微生物

徐文嫻，趙從舉，朱敏捷，等. 海南島桉樹人工林土壤微生物功能多樣性特征［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2016，43（7）：65-72.

土壤微生物參與土壤發(fā)生、發(fā)展、發(fā)育的全過程［1］，在維持土壤功能方面扮演著重要的角色，研究其群落功能多樣性是理解生態(tài)系統(tǒng)過程的核心內(nèi)容之一［2-5］。由于土壤物質(zhì)組成、理化過程和微環(huán)境的異質(zhì)性，以及地表覆被差異使得不同生態(tài)系統(tǒng)的土壤微生物多樣性表現(xiàn)更具復雜［6-7］。目前，測定土壤微生物多樣性有微生物生物量法［8］、磷脂脂肪酸法（phospholipid fatty acid，PLFA）［9］和基于PCR的分子生物學分析方法［10］等，但這些方法技術(shù)要求高，耗費時間長，實驗靈活性較差，又難以在較短時間內(nèi)進行大量樣品處理［11］，因而應(yīng)用受到限制。而基于碳源誘導代謝響應(yīng)模式的Biolog-ECO微平板技術(shù)為微生物群落功能多樣性定量研究提供了一種靈敏度高、分辨性強、更加簡便快捷的方法［12-13］，在不同生境土壤微生物群落多樣性比較和土壤總的功能評價中得到廣泛應(yīng)用［11，14-17］。

土壤微生物在維持土壤功能方面具有重要作用，是土壤中最活躍的因子；土壤微生物多樣性是土壤微生物群落穩(wěn)定性的指標及土壤質(zhì)量變化的反映。土壤微生物多樣性是自然和人為因素綜合作用的結(jié)果［18］；土壤微生物的多樣性既受地表植被類型、覆蓋度的影響［19］，也隨土地利用方式改變而變化［20］。海南西部是我國重要的桉樹人工林分布區(qū)，桉樹種植所帶來的生態(tài)問題一直爭論不斷［21］。近年來對桉樹林土壤水分［22］、土壤養(yǎng)分［23］以及生物多樣性［10，24］的研究較多，但對桉樹人工林土壤微生物多樣性及其與主要土壤性狀相互關(guān)系的研究還較少［25-26］。

為此，我們選取海南西部儋州4齡桉樹人工林為研究樣地，采用Biolog-ECO微平板技術(shù)，研究海南桉樹人工林土壤微生物群落的多樣性，闡明不同深度土壤微生物群落代謝功能多樣性、碳源類型利用強度差異，揭示桉樹人工林土壤微生物代謝功能多樣性特征及其與主要土壤環(huán)境因子關(guān)系，旨在為熱帶桉樹人工林土壤微生物功能多樣性研究以及土壤肥力的維持及保育提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1研究區(qū)概況

實驗區(qū)位于海南島西北部儋州林場（19° 42′31″N，109°54′47″E），屬熱帶季風氣候區(qū)，年均溫 23.8℃，年均日照時數(shù)2 000 h以上，≥10℃的年積溫為8 400～8 900℃；年均降水800～1 600 mm，年蒸發(fā)量1 200～2 500 mm，平均空氣相對濕度72%；一般 6～10月為雨季，臺風活動頻繁；11月至次年5月為旱季，降水較少；缺少地表徑流，季節(jié)性干旱明顯；區(qū)域為臺地平原區(qū)，地勢平坦，平均海拔約33m；土壤以砂質(zhì)磚紅壤為主，成土母巖為花崗巖和砂頁巖，土層較薄，土壤肥力較低。

1.2樣地選擇與樣品采集

2015年12月，在尾葉桉 U 6無性系（Eucalyptus urphylla S. T. Black U6）人工林群落內(nèi)分別設(shè)置3個20 m×20 m 樣方，在每個樣方內(nèi)用直徑3.5 cm的土鉆以S型線路五點法分別以10 cm為深度間隔采集0～30 cm土層土壤樣品進行混合，土壤樣品裝入無菌封口袋放入裝有冰塊的保溫盒帶回實驗室。去除可見有機物，過2 mm篩后，一份放在4℃冰箱保存，用于土壤微生物群落特征測定，另一份自然風干后研磨，用于土壤理化性質(zhì)分析。樣地土壤基本理化性質(zhì)見表1。

1.3試驗方法

1.3.1土壤理化性質(zhì)測定 采用環(huán)刀法測定土壤容重，TDR土壤水分儀（ML3x，Delta-T，Device Cambridge，UK ）測定土壤水分，CPC-505電導率儀測定土壤電導率，電位法測定土壤pH值（土液比1∶2.5）；重鉻酸鉀容量法-外加熱法測定土壤的有機質(zhì)，聯(lián)合浸提-比色分析法測定土壤有效磷、速效鉀，堿解擴散法測定土壤堿解氮。

表 1 桉樹人工林不同土層土壤基本理化性質(zhì)

1.3.2土壤微生物群落多樣性測定 實驗采用Biolog-ECO微平板作為微生物研究載體。實驗前先將待測土樣從冰箱內(nèi)提前4 h取出，放置室溫下恢復微生物的活性［4］；稱取相當于10 g風干土的新鮮土樣于裝有90 mL 0.85%滅菌生理鹽水的三角瓶中，200 r/min 振蕩1 h，使土壤中微生物均勻分散，靜止15 min，在無菌操作臺上用0.85%滅菌生理鹽水按10倍稀釋法制成10-3濃度的菌懸液，將制備好的菌懸液倒入樣品槽，用八通道移液器以每孔150μL將菌懸液滴入Biolog-ECO微平板（Biolog，Hayward，USA）的96個孔中；將接種好的Biolog-ECO微平板置于20℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔12 h用酶標儀（Customized Micro-plate Reader，ELx808 TM，Biolog，Hayward，USA）讀取590 nm波段的吸光值+濁度及750 nm波段濁度數(shù)值，連續(xù)測定300 h。

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

土壤微生物群落利用碳源的整體能力用Biolog-ECO微平板單孔平均顏色變化率（average well color development，AWCD）表示。土壤微生物群落功能多樣性分析采用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H′）、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)（D）、McIntosh豐富度指數(shù)（U）和McIntosh均勻度指數(shù)（E）表征［5］，計算AWCD：

式中，C為每個有培養(yǎng)基孔的吸光值，31為 Biolog-ECO微平板上碳源的種數(shù)，C590、C750為590 nm、750 nm的吸光值，當C-R≤0 時均記為0。

采用Biolog-ECO微平板培養(yǎng)至156 h的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計算土壤微生物群落多樣性指數(shù)：式中，Pi為有培養(yǎng)基的孔與對照孔的光密度值差與板總差的比值；ni為第i孔的相對吸光度；N為吸光值總和，S為顏色有變化的碳源孔的數(shù)目，確定光密度值0.25為顏色變化的最低閾值，計入S。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析在Excel 2007、SPSS 21.0軟件環(huán)境下進行方差分析（one-way ANOVA）、LSD法差異顯著性檢驗及主成分分析（PCA），利用Pearson相關(guān)系數(shù)評價不同因子間的相關(guān)關(guān)系。

2　結(jié)果與分析

2.1不同土層土壤微生物群落總碳源利用的活性變化

圖1 不同土層土壤微生物群落平均顏色變化率

微平板單孔平均顏色變化率（AWCD）作為微生物整體活性的有效指標，反映了土壤微生物利用單一碳源的能力；AWCD值越大，表示土壤中微生物群落的代謝活性越強。在整個培養(yǎng)期，桉樹人工林不同土層的AWCD呈相似的變化趨勢（圖1）。培養(yǎng)初期0～24 h為微生物代謝活動的適應(yīng)期，土壤微生物對微平板孔中的碳源底物利用不明顯；隨著培養(yǎng)時間的延長，土壤微生物碳源代謝能力逐漸增強；48 h后迅速增加，進入對數(shù)增長期；156 h后，增長漸緩進入穩(wěn)定期；不同土層AWCD呈相似的變化趨勢，也存在差異。整個培養(yǎng)過程，0～10 cm土層AWCD值始終最低，10～20 cm最高；在264 h前20～30 cm土層AWCD相對10～20 cm土層最低，之后上升速度逐漸加快并超過后者；到300 h時，0～10、10～20、20～30 cm土層的平均AWCD分別為0.85、0.97和1.00；即隨著土層深度增加，土壤平均AWCD逐漸增加，碳源利用能力增強，微生物代謝活性逐漸增強。

2.2不同土層土壤微生物群落碳源利用類型

根據(jù)化學基團的性質(zhì)將Biolog-ECO微平板上的31種碳源底物劃分為六大類：碳水化合物12種、氨基酸及其衍生物類6種、羧酸類5種、酚酸類2種、多聚物4種及胺類2種。桉樹人工林不同土層的土壤微生物對6類碳源底物的利用存在較大差異（表2）。

隨著土層深度增加，對碳水化合物類利用

表2 不同土層土壤微生物群落對不同碳源利用率的影響

逐漸下降，氨基酸類、羧酸類、酚酸類和胺類底物利用逐漸上升，對多聚物類底物利用強度先下降后上升。桉樹人工林土壤不同土層微生物均對胺類碳源利用率最高，多聚物類、氨基酸類和酚酸類次之，羧酸類和碳水化合物最低。

2.3不同土層土壤微生物群落功能多樣性分析

采用培養(yǎng)過程中增長期與穩(wěn)定期拐點處時間第156 h的碳源利用程度數(shù)據(jù)進行多樣性指數(shù)分析，以Shannon-Wiener指數(shù)表征土壤中微生物群落多樣性、Simpson指數(shù)描述土壤中微生物群落優(yōu)勢度、McIntosh指數(shù)表征土壤中微生物群落豐富度、McIntosh指數(shù)表征土壤中微生物群落均勻度（表3）。桉樹人工林不同土層之間Shannon指數(shù)隨土層深度增加而增大；Simpson指數(shù)可反映微生物群落中的常見物種，Simpson指數(shù)隨土層深度增加而增大但差異不明顯，說明桉樹人工林不同土層中常見微生物種類相似度較高，但隨土層增加出現(xiàn)特有種；McIntosh指數(shù)反映了微生物利用碳源種類數(shù)的不同，可明顯區(qū)分不同的碳源利用程度，20～30 cm桉樹人工林土壤微生物McIntosh指數(shù)明顯高于其他土層，說明不同土層土壤微生物碳源利用差異顯著；0～10 cm土層McIntosh指數(shù) 最高，20～30 cm最低，說明各土層土壤微生物菌群分布均勻度有所差異。由此可見，土壤微生物群落功能多樣性與土層深度關(guān)系密切。

2.4不同土層土壤微生物碳源利用多樣性的主成分分析

表3 土壤微生物功能多樣性指數(shù)分析

為了更好理解土壤微生物群落功能的差異，對不同土層土壤微生物對六大類31種碳源的利用情況進行了主成分分析。采用培養(yǎng)第156 h時間點的數(shù)據(jù)，共提取出6個主成分，前2個主成分累積貢獻率達到74.17%，其中PC1貢獻率為41.65%，PC2為32.51%。以PC1為橫軸，以PC2為縱軸，以不同處理在2個主成分上的得分值為坐標作圖，得到不同處理土壤微生物碳源利用的主成分分析結(jié)果見圖2。

圖2 桉樹人工林不同土層土壤微生物碳源利用的主成分分析

結(jié)果顯示，不同處理在PC軸上出現(xiàn)明顯的分異：0～10、10～20和20～30 cm土層各為一類；20～30 cm土層整體得分最低但均分布在PC1和PC2的正半軸區(qū)域，0～10 cm土層在PC2負半軸得分較高，10～20 cm土層在PC1負半軸得分最高。由此可見，隨著土層深度增加，桉樹人工林土壤微生物基礎(chǔ)代謝增強，兩個主成分能較好區(qū)分桉樹人工林不同土層土壤微生物的群落特征。從主成分分析的相關(guān)矩陣可見，在第一主成分上貢獻較大的碳源有16種，在第二主成分上有12種（表4）。由表4可知，影響第一主成分的碳源主要為碳水化合物類、氨基酸及其衍生物類、羧酸類和多聚物類，第二主成分貢獻最大的主要為氨基酸及其衍生物類和羧酸類。因此，碳水化合物類、氨基酸及其衍生物類、羧酸類和多聚物類為本區(qū)域土壤微生物利用的主要碳源底物，但在主成分分離中，主要貢獻者為碳水化合物類、氨基酸及其衍生物類和胺類碳源。

表4 桉樹林地土壤中與PC1、PC2顯著相關(guān)的碳源

2.5土壤微生物功能多樣性與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系分析

為探討土壤理化性質(zhì)與土壤微生物群落功能多樣性之間的關(guān)系，對土壤理化性質(zhì)與微生物群落多樣性進行相關(guān)分析。結(jié)果（表5）顯示，土壤容重、土壤有機質(zhì)和土壤堿解氮含量對土壤微生物多樣性影響最大，土壤容重與4個指數(shù)均顯著相關(guān)，有機質(zhì)與Shannon多樣性指數(shù)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)呈極顯著負相關(guān)，與McIntosh均勻度指數(shù)呈極顯著正相關(guān)，堿解氮與Shannon多樣性指數(shù)呈顯著負相關(guān)，與McIntosh均勻度指數(shù)呈顯著正相關(guān)?？梢姡寥鲤B(yǎng)分與微生物群落功能多樣性關(guān)系最為密切，是造成不同土層土壤微生物群落多樣性差異的重要原因之一。

表5 土壤理化性質(zhì)與土壤微生物功能多樣性相關(guān)性分析

3 結(jié)論與討論

隨著培養(yǎng)時間的延長，桉樹人工林不同土層的土壤微生物碳源利用能力與代謝活性逐漸增強，不同土層土壤微生物的胺類碳源利用率最高，酚酸類、氨基酸類和多聚物類次之，碳水化合物和羧酸類最低。

桉樹人工林土壤微生物功能多樣性除受土壤理化性質(zhì)影響外，桉樹生長及凋落物分解產(chǎn)生的化感物質(zhì)可能對表層土壤微生物活性受到不同程度的抑制作用。

主成分分析顯示，在31種碳源中提取的2個主成分因子分別可以解釋所有變量方差的41.65%和32.51%，碳水化合物類、氨基酸及其衍生物類和胺類碳源為對PC1和PC2起分異作用的主要碳源。

3.1土壤微生物群落碳源利用的活性變化

研究表明，AWCD隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)呈現(xiàn)出適應(yīng)期、對數(shù)期至穩(wěn)定期的微生物常規(guī)生長曲線，意味著桉樹人工林土壤微生物碳源利用活性均隨著培養(yǎng)時間的延長呈現(xiàn)逐漸

增加的趨勢，這與多數(shù)研究結(jié)果［11，16-17，27-28］一致。0～10 cm AWCD始終處在最低水平，培養(yǎng)0～264 h前，10～20 cm土層土壤微生物對Biolog-ECO微平板上碳源底物的代謝能力較強；培養(yǎng)264 h后，20～30 cm土層土壤微生物代謝能力上升速度較快；培養(yǎng)300 h后，土壤微生物代謝活性隨著土層深度增加而增強。范瑞英等［29］研究發(fā)現(xiàn)不同林齡的落葉松人工林土壤微生物活性（AWCD） 0～10 cm土層大于10～20 cm土層；鐘圣赟等［7］對8種不同植被類型土壤微生物研究認為，上層土土壤微生物對碳源的利用能力較下層土的強。與本研究結(jié)果差異的原因可能在于桉樹生長過程釋放的化感物質(zhì)等在表層聚集抑制部分土壤微生物活性，使土壤中微生物群落多樣性降低；另外，桉樹人工林除草劑的使用，也會降低表層土壤微生物量多樣性。

3.2土壤微生物群落碳源利用類型

不同土層土壤微生物碳源利用率有所差異；總體而言，20～30 cm土層最高，由于表層土壤中微生物群落多樣性指數(shù)較低，微生物種類較少，因而0～10 cm土層碳源利用總體呈現(xiàn)最低。不同土層土壤微生物胺類碳源利用率最高；0～10 cm土層多聚物類碳源利用率較高，羧酸類底物利用最低；10～20 cm和20～30 cm土層微生物分別對氨基酸類碳源和酚酸類碳源利用高于其他底物，均對碳水化合物利用最低；由此可見，桉樹人工林不同土層土壤中微生物類型不同。研究發(fā)現(xiàn)，桉樹根系會產(chǎn)生酚聚合物等分泌物，而這些分泌物可能是桉樹人工林部分土壤微生物的重要碳源［25-26］。譚宏偉等［10］研究桉樹人工林與不同林分土壤微生物活性，認為桉樹人工林表層、中層和下層土壤中微生物生物量碳存在顯著差異。其次，不同林齡、林分結(jié)構(gòu)和季節(jié)因素均顯著影響土壤微生物活性［11，30-32］。本實驗采樣時間為旱季，今后還要采集雨季樣品進行對比實驗，以期全面了解桉樹人工林不同土層微生物群落碳源利用情況。

3.3土壤微生物群落功能多樣性

桉樹人工林不同土層土壤微生物群落功能多樣性有明顯的差異，表層土壤的微生物活性受到不同程度的抑制。李小容等［11］研究不同林齡的木麻黃林土壤微生物時發(fā)現(xiàn)，表層土壤中化感物質(zhì)的積累會減弱林地土壤微生物的代謝能力，表層土壤微生物群功能多樣性降低。桉樹人工林地微生物群功能多樣性因土壤理化性狀隨著土層深度變化的影響，土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和代謝活性發(fā)生改變。土壤微生物群落功能多樣性不僅受到土壤本底養(yǎng)分的影響［33］，還與土壤總氮、有機碳、C/N和銨態(tài)氮均顯著相關(guān)［34］，甚至固氮樹種植入會使桉樹人工林土壤微生物明顯增加［26］。

影響土壤微生物功能多樣性的因素很多，采用Biolog-ECO微平板碳源利用為基礎(chǔ)的定量分析方法，只能培養(yǎng)能夠利用Biolog-ECO板中碳源的微生物，對不能利用Biolog-ECO板中的碳源底物及處于休眠狀態(tài)的微生物群落功能多樣性還無法體現(xiàn)。因此，要摸清不同土層土壤微生物的群落功能特征還需要結(jié)合其他手段進行深入分析。

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（責任編輯 楊賢智）

Soil microbial functional diversity of Eucalyptus plantation in Hainan Island

XU Wen-xian1，ZHAO Cong-ju1，ZHU Min-jie1，WU Zhe-ying2，HAN Qi1，ZHENG Qing-yang1
（1.School of Geography and Tourism，Hainan Normal University，Haikou 571158，China；2.School of Life Sciences，Hainan Normal University，Haikou 571158，China）

As one of the most important components in soil ecosystem，soil microbes have irreplaceable effects on nutrient and energy cycling. In the research，the changes of functional diversity of soil microbial community were analyzed by using the method of Biolog-ECO microplate culture in different soil depths of 4-year Eucalyptus plantation in western Hainan Island. The results showed that the average well color development （AWCD） increased with incubation time，and there were significant differences among different soil layers，varying from 0.85，0.97 and 1.00（cultured for 300 hours） for 0-10 cm，10-20 cm and 20-30 cm soil layer. The microbial communities in different soil layers had similar carbon sources utilization mode； it found that amine was the highest availability of carbon sources，followed by Phenolic acids，amino acids，polymer，and carbohydrates，and carboxylic acids had the lowest utilization rate. However，the carbon utilization efficiency increased with the soil depth，the values of Shannon-Wiener index （H），Simpson index （D） and McIntosh index （U） all increased with layer increasing； itsuggested that soil microbial activity in the surface layer of Eucalyptus plantation was restrained in different degrees. Principal component analysis （PCA） indicated that 2 principal components possessed 41.65% and 32.51% explained variance to carbon sources. Carbohydrates，amino acids and amine were the 3 main carbon sources separating the 2 principal component factors. The significant relationships were observed between the metabolic diversity of microbial communities and soil physical and chemical properties，through correlation analysis，soil organic carbon，soil bulk density and soil available nitrogen were important factors determining the rate of metabolism of carbon substrates in soil.

Biolog-ECO microplate； Eucalyptus plantation； functional diversity； soil microbe

S154.3

A

1004-874X（2016）07-0065-08

2016-03-07

國家自然科學基金（41361006）；國家科技支撐計劃項目（2012BAC18B04）

徐文嫻（1987-），女，在讀碩士生，E-mail：1246090705@qq.com

韓奇（1981-），女，碩士，副教授，E-mail：hnnu_hanqi@126.com