衛(wèi)　振, 婁繪芳, 吳　凱, 陳雁虹, 謝　敏, 劉迪文, 謝強(qiáng)敏（浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 杭州 310058）

兩個(gè)豚鼠品系速發(fā)型哮喘模型中組胺受體的表達(dá)及對(duì)肺功能的影響

衛(wèi)振, 婁繪芳, 吳凱, 陳雁虹, 謝敏, 劉迪文, 謝強(qiáng)敏
（浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 杭州 310058）

目的建立Zmu-1：DHP和DHP兩個(gè)豚鼠品系的速發(fā)型哮喘模型，探討組胺受體1（H1R）和組胺受體2（H2R）在肺組織中的表達(dá)及對(duì)肺功能的影響。方法兩個(gè)豚鼠品系分別設(shè)置模型組（MW，MP）和對(duì)照組（BW，BP），模型組采用卵清白蛋白（OVA）致敏，對(duì)照組使用生理鹽水。第1，14日致敏豚鼠，第28日用OVA霧化激發(fā)，記錄0～8 min內(nèi)動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性（Cdyn）和氣道阻力 （Raw） 變化。取肺組織樣品，進(jìn)行H1R和H2R mRNA表達(dá)檢測(cè)和免疫組織化學(xué)分析。結(jié)果OVA霧化激發(fā)后，Zmu-1：DHP和DHP品系模型組（MW，MP） Cdyn下降，Raw上升，變化幅度先大后小，約3 min 達(dá)到最大，而兩品系對(duì)照組（BW，BP）變化較小。其中，MW組反應(yīng)較MP組更敏感。定量PCR分析, MW模型組的H1R, H2R mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組BW（P＜0.05, P＜0.05），肺組織切片HE染色，模型組（MW，MP）肺泡間可見(jiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而對(duì)照組（BW，BP）未見(jiàn)。免疫組織化學(xué)可見(jiàn)，H1R和H2R主要分布在氣道和血管周圍的平滑肌上。結(jié)論速發(fā)型哮喘模型，H1R 和H2R主要分布在肺部氣管周圍的平滑肌上，H1R的高表達(dá)與哮喘模型的氣道敏感性密切相關(guān)。

哮喘； 卵清白蛋白（OVA）； 組胺受體； 肺功能； 豚鼠

哮喘是常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，患者常表現(xiàn)出氣道狹窄，呼吸受阻的發(fā)病癥狀，其本質(zhì)是在外界因素刺激下，機(jī)體表現(xiàn)出的一系列免疫反應(yīng)［1］。豚鼠常被用來(lái)制作哮喘動(dòng)物模型，用以模擬哮喘病人發(fā)病的不同階段［2］。作者在實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同品系豚鼠對(duì)組胺刺激的表現(xiàn)存在差異，Zmu-1： DHP品系比DHP豚鼠更敏感。在過(guò)敏反應(yīng)中，組胺可通過(guò)與組胺受體（HR）相結(jié)合，引起氣管的收縮［3］。分布于肺部氣管的組胺受體有H1R和H2R，H1R被認(rèn)為與平滑肌的收縮有關(guān)，H2R則有舒張作用［4］。本實(shí)驗(yàn)使用Zmu-1：DHP和DHP豚鼠品系制作速發(fā)型哮喘模型，檢測(cè)肺組織中H1R和H2R的mRNA表達(dá)，免疫組織化學(xué)分析H1R和H2R在肺組織中的分布情況，以期望了解兩品系H1R，H2R的表達(dá)與氣道敏感性的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)雄性Zmu-1： DHP和DHP豚鼠由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK（浙） 2012-0052］, 體質(zhì)量250～350 g, 共48只, 每個(gè)品系設(shè)模型組（MW，MP）和對(duì)照組（BW，BP），12只/組，飼養(yǎng)于普通級(jí)環(huán)境［SYXK（浙）2012-0178］。

1.2試劑和儀器

卵清白蛋白（OVA）： 美國(guó)Sigma公司, 批號(hào)A5253；無(wú)水氯化鋁Al（OH）3： 國(guó)藥試劑，批號(hào)20130609； 氫氧化鈉：國(guó)藥試劑，批號(hào)20140107； 烏來(lái)糖，國(guó)藥試劑，批號(hào)20130918；定量PCR試劑： Takara公司，批號(hào)，AK901、AK4401和AK3101；H1R一抗：Proteintech Group公司， 批號(hào)13413-1-AP；H2R一抗，Everest Biotech公司，批號(hào)EB06905。Medlab生物信號(hào)采集系統(tǒng)，南京美易科技有限公司，型號(hào)MedLab-U/4C501H。QPCR儀，Bio-rad公司，CFX-96。

1.3OVA哮喘模型的建立

參考《藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》［5］, 模型組采用OVA致敏，對(duì)照組使用生理鹽水。第1日，模型組左右腹股溝分別肌肉注射0.25 mL，腹腔注射0.5 mL, OVA氫氧化鋁生理鹽水凝膠［含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%OVA，4%Al（OH）3］。第14日加強(qiáng)致敏，腹腔注射OVA生理鹽水凝膠, 0.5 mL/只。第28日，1%OVA生理鹽水凝膠霧化激發(fā)（20 s）后，描計(jì)1～8 min肺功能。

1.4肺功能檢測(cè)

質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%烏來(lái)糖生理鹽水溶液按照1 mL/ 100 g的劑量ip麻醉豚鼠。豚鼠行氣管插管后, 置于容積描記箱內(nèi)。1% OVA生理鹽水霧化20 s，Medlab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄0～8 min內(nèi)豚鼠的動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性（Cdyn） 和氣道阻力（Raw）。肺功能改變用Cdyn下降百分率和Raw值增加百分率計(jì)算。計(jì)算公式如下：

1.5解剖與取材

豚鼠股動(dòng)脈放血處死，取左側(cè)第一葉肺，剪取2份，用于mRNA檢測(cè)；剪取左側(cè)第二葉肺，質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%中性甲醛固定，用于HE染色和免疫組織化學(xué)觀察。

1.6QPCR檢測(cè)

參照Taka ra產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，提取總RN A， nanodrop檢測(cè)RNA質(zhì)量（吸光度比值A(chǔ)260/A280在1.8～2.0）和濃度, 調(diào)整到同一濃度, 反轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用Takara SYBR配制反應(yīng)體系, 上機(jī)。引物序列如下, GAPDH, F： 5-ATCACTGCCACCCAGAAGAC-3；

R： 5-TCCACAACCGACACATTAGG-3

H1R, F： 5-CCCAACACCTCGTGGACAT-3；

R： 5-TCACAGCACCTGCCATCTC-3

H2R T： 5-TCAAGATCGCTCGGGAACA-3

R： 5-TCAGCCCACGGTAAACAAA-3。

1.7統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多因素方差分析使用Univariate程序，組間多重比較使用Post Hoc程序，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1豚鼠OVA霧化后豚鼠Cdyn和Raw的變化

1%OVA生理鹽水霧化激發(fā)（20 s）后，模型組（MW，MP）Cdyn下降幅度先高后低, 在3 min達(dá)到最大； 而對(duì)照組（BP, BW）變化幅度較小。在1 min、2 min、3 min，模型組（MP, MW） Cdyn下降幅度都顯著高于對(duì)照組（BP，BW）（P＜0.01）。在1～6 min, Zmu-1： DHP品系模型組Cdyn變化幅度高于DHP品系，但都未達(dá)到顯著水平（表1）。

表1　OVA霧化后豚鼠Cdyn變化

1%OVA生理鹽水霧化20 s后，模型組（MW，MP） Raw增加幅度先高后低, 在3 min達(dá)到最大； 而對(duì)照組（BP, BW）變化幅度較小。在1～6 min，模型組（MP, MW） Raw改變幅度高于對(duì)照組（BP，BW）, 但都未達(dá)到顯著水平（表2）。

2.2豚鼠肺組織中H1R、H2R的mRNA表達(dá)檢測(cè)

隨著OVA刺激, 兩品系哮喘模型（MP，MW）的H1R, H2R表達(dá)量均增加。模型組MW的H1R和H2R mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組BW（P＜0.05, P＜0.05）,模型組MP的H1R和H2R RNA表達(dá)量高于對(duì)照組BP（P=0.056, P＜0.05）。在模型組和對(duì)照組, Zmu-1∶DHP品系的H1R，H2R基因表達(dá)量均高于DHP品系，但未達(dá)到顯著水平（表3）。

表2　OVA霧化后豚鼠Raw變化

表3　豚鼠肺組織H1R和H2R的mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.3豚鼠肺組織病理切片和組織化學(xué)分析

HE染色病理切片分析，模型組（MW, MP），肺泡可見(jiàn)有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而對(duì)照組（BW，BP）很少（圖1）。免疫組織化學(xué)可見(jiàn)，H1R和H2R主要分布在肺組織氣道和血管周圍的平滑肌上，H1R的表達(dá)多于H2R（圖2和圖3）。

圖1　豚鼠肺組織病理學(xué)觀察

3　討論

3.1激發(fā)實(shí)驗(yàn)豚鼠肺功能的變化

圖2　豚鼠肺組織H1R免疫組織化學(xué)

圖3　豚鼠肺組織H2R免疫組織化學(xué)

本實(shí)驗(yàn)激發(fā)檢測(cè)時(shí)， Zmu-1∶DHP和DHP兩個(gè)豚鼠品系，模型組對(duì)刺激反應(yīng)敏感，表現(xiàn)為Cdyn先下降后恢復(fù)，Raw先增加后恢復(fù), 其中, Zmu-1∶DHP品系比DHP品系改變幅度更大，體現(xiàn)出該品系在速發(fā)型哮喘模型激發(fā)實(shí)驗(yàn)中更容易模擬出氣道敏感的性狀。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M在3 min時(shí)Cdyn 和Raw出現(xiàn)最大改變，Xie等［6］在豚鼠的藥物實(shí)驗(yàn)時(shí)顯示，致敏豚鼠激發(fā)后在4 min時(shí)Cdyn 和Raw的改變達(dá)到最大，藥理學(xué)指南［5］指出豚鼠速發(fā)型哮喘模型激發(fā)實(shí)驗(yàn)Cdyn 和Raw最大改變常在3～5 min出現(xiàn)。衛(wèi)振等［7］在體外氣管條檢測(cè)不同豚鼠品系對(duì)組胺的敏感性，當(dāng)組胺濃度為10-5mol/L和10-4mol/L時(shí), Zmu-1∶DHP品系豚鼠氣管條的收縮率顯著高于DHP品系（P＜0.01～0.05），從離體角度驗(yàn)證了Zmu-1∶DHP和DHP品系對(duì)外界刺激反應(yīng)敏感性的差異。

3.2H1R和H2R的組織分布和表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)定量PCR檢測(cè)，Zmu-1∶DHP和DHP兩個(gè)品系，模型組肺組織中H1R的mRNA相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照組增加明顯，揭示哮喘模型組H1R的表達(dá)量增加。兩個(gè)品系模型組H2R的mRNA表達(dá)量都顯著升高（P＜0.05，P＜0.05），揭示模型組H2R的表達(dá)上升。

分布于肺部氣管的組胺受體主要有H1R和H2R，H1R被認(rèn)為與平滑肌的收縮有關(guān)［3］，在氣道反應(yīng)中起主導(dǎo)作用，H2R則有一定的舒張作用［4］。本實(shí)驗(yàn)中，模型組肺組織中H1R表達(dá)量上升，與模型氣道反應(yīng)敏感的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。模型組肺組織中H2R表達(dá)量上升，但仍然不能夠改變本實(shí)驗(yàn)中模型組氣道反應(yīng)敏感的表現(xiàn)。免疫組織化學(xué)分析表明，H1R和H2R主要分布在肺部氣管和血管的平滑肌上，H1R的表達(dá)量明顯多于H2R，外界刺激可能通過(guò)H1R和H2R作用于模型組支氣管，從而引起肺功能的改變。

哮喘的本質(zhì)是炎癥反應(yīng), 在反應(yīng)的早發(fā)相階段,肥大細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞釋放出組胺，類胰蛋白酶等介質(zhì)［8］。組胺可以與分布于肺部支氣管的H1R和H2R結(jié)合發(fā)揮作用。H1R和H2R通過(guò)G蛋白偶聯(lián)傳遞胞外信號(hào)到胞內(nèi)，H1R可以促進(jìn)核因子-κB （NF-κB）信號(hào)分子的表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)［9］，H1R基因敲除小鼠氣道炎癥反應(yīng)明顯減弱［10］。有學(xué)者認(rèn)為在不同的細(xì)胞發(fā)展階段或者生理狀態(tài)HR的水平可能不同［11］。本實(shí)驗(yàn)中，速發(fā)型哮喘模型組的H1R和H2R的表達(dá)都出現(xiàn)了明顯的增加。模型組中，Zmu-1∶DHP品系H1R的表達(dá)量略高于DHP品系（P＞0.05），可能是Zmu-1∶DHP品系激發(fā)試驗(yàn)時(shí)氣道更加敏感的重要原因。

［1］ Anderson GP. Endotyping asthma： new insights into key pathogenic mechanisms in a complex, heterogeneous disease［J］. Lancet, 2008, 372： 1107-1119.

［2］ 謝強(qiáng)敏, 方理本, 張洪泉. 哮喘和COPD的新概念及新藥［M］. 上海： 科學(xué)出版社, 2003：353-359.

［3］ Tohda Y, Kubo H, Haraguchi R, et al. Roles of histamine receptor in a guinea pig asthma model［J］. Int J Immunopharmacol, 1998, 20（10）：565-571.

［4］ Foreman JC, Rising TJ, Webber SE. A study of the histamiine H2-receptor mediating relaxation of the parenchymal lung strip preparation of the guinea-pig［J］. Br J Pharmacol, 1985, 86（2）：465-473.

［5］ 魏偉, 吳希美, 李元建, 等. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］. 北京： 人民衛(wèi)生出版社, 2010：1190.

［6］ XIE QM, CHEN JQ, SHEN WH, et al. Comparison of bronchodilating and anti-inflammatory activities of oral formoterol and its （R,R）-enantiomers［J］. Acta Pharmacol Sin, 2003, 24（3）：277-282.

［7］ 衛(wèi)振, 董新威, 沈亮亮, 等. Zmu-1∶DHP和DHP兩個(gè)品系豚鼠組胺激發(fā)試驗(yàn)氣道反應(yīng)性的比較［J］. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 23（9）：52-56.

［8］ Wang M, Takeda K, Shiraishi Y, et al. Peanut-induced intestinal allergy is mediated through a mast cell-IgE-FcepsilonRI-IL-13 pathway［J］. J Allergy Clin Immunol, 2010, 126（2）：306-316.

［9］ Leurs R, Church MK, Taglialatela M, et al. H1-antihistamines：inverse agonism, anti-inflammatory actions and cardiac effects［J］. Clin Exp Allergy, 2002, 32（4）：489,498.

［10］ Miyamoto K, Iwase M, Nyui M, et al. Histamine type 1 receptor deficiency reduces airway inflammation in a murine asthma model［J］. Int Arch of Allergy Immunol, 2006, 140（3）：215-222.

［11］ Nikola Stojkovi, Sne ana Ceki, Milica Ristov, et al. Histamine and antihistamines［J］. Acta Facultatis Medicae Naissensis, 2015, 32（1）：7-22.

Histamine Receptor Expression and Their Effect on Pulmonary Function in Immediate Asthma Model of Two Guinea Pig Strains

WEI Zhen, LOU Hui-fang, WU Kai, CHEN Yan-hong, XIE Min, LIU Di-wen, XIE Qiang-min
（Laboratory Animal Center of ZheJiang University， HangZhou 310058， China）

ObjectiveTo establish immediate asthma model in two strains of guinea pigs （Zmu-1∶DHP and DHP） with ovalbumin （OVA）, and find out histamine receptor （H1R, H2R） gene expression difference and their effect on pulmonary function. MethodsTwo strains of Zmu-1∶DHP and DHP guinea pigs were divided into two model groups （MW and MP） and two control groups （BW and BP）respectively. Guinea pigs of model groups were sensitized with OVA, as control groups were treated with normal saline. on the first and 14th day, each guinea pig of model groups were given OVA. On the 28th day,dynamic lung compliance （Cdyn） and airwayresistance （Raw） of every guinea pig were recorded from 0 to 8 minutes after exposure to OVA. Then guinea pigs were sacrificed, lung tissue were examined by H1R, H2R mRNA expression test and immuohistochemistry （IHC） analysis. ResultsAfter exposure to OVA, guinea pigs of Zmu-1∶DHP and DHP model groups （MW and MP） had lower Cdynand higher Raw changes than control groups （BW and BP） from 0 to 8 minutes and with the maximum Cdyn and Raw change at third minute. Group BW had more sensitive reaction than Group BP. QPCR analysis revealed, group MW had higher mRNA expression of H1R and H2R than group BW （P＜0.05）. Obvious inflammatory cell infiltration of lung tissues were observed by HE staining in model groups （MW and MP）, but didn’t in control groups （BW and BP）. By IHC, the H1R and H2R expression were observed in smooth muscle of bronchus and vessel. ConclusionIn immediate asthma model, H1R and H2R express mainly in smooth muscle of bronchus, its sensitive may have high relation to expression of H1R.

Asthma； Ovalbumin （OVA）； Histamine receptor； Pulmonary function； Guinea pig

Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0101-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.02.004

2015-12-08

浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃（2012C37085）

衛(wèi)振（1982-）, 男, 碩士。研究方向, 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。E-mail：mudi001@126.com

劉迪文, 研究員。研究方向, 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。E-mail： liudiwen2004@163.com