黃　超, 弓藝涓, 田　芳, 王玉柱, 孫　冰,2, 夏敏杰, 職瑞娜,2, 丁訓(xùn)誠, 周新初, 李衛(wèi)華（. 上海市計劃生育科學(xué)研究所, 國家計劃生育藥具重點實驗室, 上海 20002；2. 復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院, 上海 20002； . 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院, 上海, 200）

·論著·

壬苯醇醚-9誘導(dǎo)小型豬陰道黏膜免疫炎癥反應(yīng)模型的建立

黃超1, 弓藝涓1, 田芳1, 王玉柱1, 孫冰1,2, 夏敏杰1, 職瑞娜1,2, 丁訓(xùn)誠1, 周新初3, 李衛(wèi)華1
（1. 上海市計劃生育科學(xué)研究所, 國家計劃生育藥具重點實驗室, 上海 200032；2. 復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院, 上海 200032； 3. 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院, 上海, 201101）

目的探索建立廣西巴馬小型豬陰道黏膜免疫炎癥反應(yīng)模型的方法。方法將6只雌性小型豬隨機(jī)分為基質(zhì)對照組和壬苯醇醚-9（N-9）模型組（40 mg/mL）（每組3只）。肌肉注射苯甲酸雌二醇12 d后，各組陰道給藥5 mL/d，連續(xù)7 d。造模后取陰道黏膜組織進(jìn)行病理檢查，并根據(jù)上皮潰瘍、壞死、細(xì)胞浸潤、出血、充血、水腫等指標(biāo)進(jìn)行病理評分； 造模后24 h與72 h，采集陰道灌流液（CVL）, 采用流式細(xì)胞術(shù)對CVL沉淀細(xì)胞中的中性粒細(xì)胞比例和CD45+細(xì)胞百分率進(jìn)行分析； 免疫組織化學(xué)法（IHC）檢測陰道黏膜組織中CD45+細(xì)胞的表達(dá)及分布。結(jié)果組織病理學(xué)觀察顯示，N-9模型組陰道黏膜上皮損傷明顯，出現(xiàn)不同程度的潰瘍、壞死、炎性浸潤、出血、水腫等。病理評分結(jié)果顯示，N-9模型組病理總分值（18.0±3.2）與基質(zhì)對照組（3.3±0.2）相比明顯升高（P＜0.01）。N-9 模型組CVL的中性粒細(xì)胞比例為41.70%±1.63% （24 h）和51.17%±3.81% （72 h）， CD45+細(xì)胞比例為58.5%±4.73%（24 h）和88.0%±3.57 %（72 h），與基質(zhì)對照組相比均顯著增高（P＜0.01）。N-9模型組陰道黏膜CD45+細(xì)胞表達(dá)明顯增多，累積光密度值為33.95± 6.69，顯著高于基質(zhì)對照組（23.42±3.30）（P＜0.05）。結(jié)論陰道連續(xù)給予N-9凝膠7 d可以誘發(fā)小型豬陰道黏膜明顯的炎性反應(yīng)，符合陰道黏膜免疫炎癥反應(yīng)模型的特征。

小型豬； 壬苯醇醚-9（N-9）； 病理組織學(xué)； 陰道灌流液（CVL）； 免疫炎癥反應(yīng)；白細(xì)胞共同抗原CD45

美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）推薦的家兔陰道刺激性模型（RVI）是評價陰道外用藥物的局部黏膜刺激性的經(jīng)典模型［1］。然而, 隨著抗人類免疫缺陷病毒（HIV）陰道殺微生物劑的研發(fā), 對陰道外用藥物的臨床前安全性評價指標(biāo)提出了新的要求, 需要特別關(guān)注陰道黏膜炎癥因子和免疫細(xì)胞的活化情況［2］。因此亟需探索更為適宜的用于評價陰道黏膜炎癥反應(yīng)的動物模型［3］。

目前，評價抗HIV陰道殺微生物劑的動物模型主要有三類： 小鼠單純皰疹2病毒（HSV-2）感染模型［4］、家兔陰道刺激性模型［5］和非人靈長類模型。Patton等［6］利用非人靈長類模型對28種候選陰道殺微生物劑進(jìn)行了安全性評價?？紤]到非人靈長類動物昂貴的價格和有限的資源, 除猴模型外, 國外有報道采用小型豬模型代替短尾猴模型來評價候選藥物對陰道黏膜的促炎癥作用，檢測陰道免疫細(xì)胞活化狀態(tài)和細(xì)胞因子釋放［7,8］。由于小型豬和人類的生殖道在組織學(xué)、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)甚至滲透性方面都非常相似, 有望成為一種陰道免疫炎癥評價模型［9］。

壬苯醇醚-9（N-9）是一種非離子型表面活性劑,是目前使用最普遍的一種外用殺精子藥物。本研究選擇廣西巴馬小型豬作為陰道黏膜免疫炎癥反應(yīng)研究的實驗動物, 經(jīng)陰道連續(xù)給予N-9（200 mg/d）7 d 后, 觀察小型豬陰道組織病理損傷、陰道粘膜炎性細(xì)胞數(shù)目以及免疫細(xì)胞活化程度的變化, 探討N-9誘導(dǎo)小型豬陰道黏膜免疫炎癥反應(yīng)模型的特征。

1　材料與方法

1.1實驗動物、試劑與主要儀器

普通級成年雌性廣西巴馬小型豬6只, 35～40 kg,購自上海浦東新區(qū)華新物種實驗動物養(yǎng)殖場［SCXK滬）2012-0013］。飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)普通級動物房［SYXK（滬）2011-0128］，溫度22～28 ℃, 12 h/12 h明暗周期； 動物食用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水［動物實驗倫理審查編號： 2013-26］。

N-9膠凍劑40 mg/g（中國藥科大學(xué)制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H10930102）； 苯甲酸雌二醇注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司）； 兔抗豬CD45多抗抗體美國Abcame公司）； FITC標(biāo)記的CD45單克隆抗體美國BD公司）； SA1022-兔IgG 鏈霉親和素生物素過氧化物酶復(fù)合物（SABC）免疫組織化學(xué)染色試劑盒［帶二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液］（武漢博士德生物公司）； BA1003抗體（武漢博士德生物公司）。

FACS Calibur型熒光分選細(xì)胞儀, FORTESSA型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）； Olympus BX43型生物顯微鏡（日本Olympus公司）； Leica RM2235石蠟切片機(jī)（德國Leica公司）。

1.2模型制備及動物分組

雌性小型豬6只, 購入后適應(yīng)環(huán)境10 d, 根據(jù)本課題組有關(guān)黏膜刺激性試驗的分組及給藥量要求, 按體質(zhì)量隨機(jī)分成2組： 基質(zhì)對照組（給予無藥熱敏凝膠5 mL/d）； N-9 模型組（200 mg/d）, 每組3只。給藥前所有小型豬肌肉注射苯甲酸雌二醇400 μg/kg，肌肉注射后的12 d開始陰道給藥（以小型豬的發(fā)情期約8～10 d推算）5 mL/d，連續(xù)給藥7 d。末次給藥后72 h處死動物取陰道黏膜進(jìn)行HE染色檢查評分,按照D’Cruz等［10］的方法, 采用基質(zhì)對照組的平均分值 （）和標(biāo)準(zhǔn)差（s）95%參考值（±1.64 s）作為判定該藥是否可被臨床接受的標(biāo)準(zhǔn), 確定造模是否成功。

1.3陰道黏膜組織病理學(xué)檢查

末次給藥72 h后處死，解剖取完整陰道組織，縱向切開，肉眼觀察是否充血，水腫等異常表現(xiàn)，然后用體積分?jǐn)?shù)10%中性緩沖甲醛固定、包埋、切片，HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

陰道黏膜刺激性試驗組織病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)如下：按照D’Cruz等提出的小型豬陰道刺激性試驗方法和標(biāo)準(zhǔn), 通過對陰道黏膜上皮細(xì)胞病變（潰瘍/壞死）、炎癥細(xì)胞浸潤，黏膜固有層、血管和周圍組織的充血、出血和水腫幾個方面半定量計分來反映刺激的嚴(yán)重程度，用無變化“0”、輕微“1”、溫和“2”、中等“3”、嚴(yán)重“4”，五個等級表示，總分為3 2分。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測陰道灌流液（CVL）中的中性粒

細(xì)胞比例

末次給藥后24 h和72 h用10 mL無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH 7.2）對各組小型豬進(jìn)行陰道灌洗，收集CVL。300×g離心5 min，1.0 μmL PBS（含1%慶大霉素）重懸沉淀，-20 ℃保存。用流式細(xì)胞儀檢測，應(yīng)用CellQuest多功能分析軟件，計數(shù)10 000個CVL沉淀細(xì)胞。FlowJo軟件計算各門的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞占檢測細(xì)胞總數(shù)的百分比（%）。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測CVL中CD45+細(xì)胞比例

調(diào)節(jié)CVL沉淀細(xì)胞濃度約至5×106/mL, 加入1 000倍稀釋的兔抗豬CD45+多抗, 4 ℃放置30 min，以300×g, 離心5 min, 去上清后, 加入FITC標(biāo)記的二抗，混合置于暗處, 室溫孵育15 min后, 用流式細(xì)胞儀檢測, 結(jié)果用CD45+細(xì)胞百分率（%）表示。

1.6免疫組織化學(xué)法檢測CD45+在陰道黏膜中表達(dá)

石蠟切片常規(guī)脫蠟，水化，微波加熱進(jìn)行抗原熱修復(fù)，體積分?jǐn)?shù)3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，滴加100倍稀釋的兔抗CD45+多抗，4 ℃過夜，按照SA1022-兔IgG SABC免疫組織化學(xué)染色試劑盒說明操作，DAB室溫顯色，蘇木素輕度復(fù)染, 脫水, 透明, 封片后鏡檢, 在20×物鏡下所選視野內(nèi)用Image-Proplus 6.0病理圖像分析軟件定位,鎖定瀏覽框, 測定框內(nèi)CD45+表達(dá)累積光密度值。

1.7統(tǒng)計分析方法

2　結(jié)果

2.1陰道黏膜組織病理學(xué)結(jié)果

與基質(zhì)對照組（圖1A）的陰道黏膜上皮細(xì)胞層相比, N-9模型組（圖1B）的部分黏膜上皮發(fā)生潰瘍、壞死以及炎性細(xì)胞浸潤。與基質(zhì)對照組陰道固有層（圖1C, 1E）相比, N-9模型組（圖1D, 1F）可見多量中性粒細(xì)胞（Gra）、單核細(xì)胞浸潤、毛細(xì)血管充血、出血。

表1　小型豬陰道黏膜刺激性評分結(jié)果

2.2組織病理學(xué)評分結(jié)果

各處理組觀察6張病理切片，分別記錄評分。由表1可見，基質(zhì)對照組病變總分值為3.3±0.2，N-9 模型組總分值明顯升高為18.0±3.2（P＜0.01）。

圖1　小型豬陰道黏膜HE染色結(jié)果

2.3CVL沉淀細(xì)胞中Gra比例

由圖2和表2可見，給藥前各處理組小型豬CVL沉淀細(xì)胞中，Gra極少（圖2A、2D），組間無明顯差異（P＞0.05）。在末次給藥后24 h，與基質(zhì)對照組相比，N-9模型組Gra細(xì)胞比例明顯升高（圖2B和2E）（P＜0.01）。末次給藥后72 h，與基質(zhì)對照組相比，N-9模型組Gra細(xì)胞比例仍保持很高水平（圖2C和2F）（P＜0.01）。

表2　各處理組不同時間CVL液的中性粒細(xì)胞百分率　%

2.4CVL沉淀細(xì)胞中CD45+細(xì)胞百分率

圖3A顯示，給藥前小型豬CVL中CD45+細(xì)胞占27.4%； 而末次給藥后24和72 h CD45+細(xì)胞百分率分別可升高到55.1%和87.5%（圖3B和3C）。對各處理組CVL中CD45+細(xì)胞百分率進(jìn)一步分析（表3）,兩組小型豬給藥前CVL中CD45+細(xì)胞百分率無顯著性差異（P＞0.05）； 在末次給藥后24 h和72 h, N-9模型組CVL中CD45+細(xì)胞百分率均明顯升高（P＜0.01）。

2.5陰道黏膜組織中CD45+的定位表達(dá)

末次給藥72 h后，基質(zhì)對照組CD45+細(xì)胞有少量表達(dá)，主要位于黏膜固有層，呈顆粒狀或點狀，而在黏膜上皮表達(dá)極少（圖4A）； N-9 模型組可見大量CD45+細(xì)胞，集中表達(dá)于黏膜上皮，染色深且密度高（圖4B）。采用Image-Pro Plus圖像分析軟件, 測定各處理組累積光密度值表明, N-9模型組CD45+細(xì)胞表達(dá)的累積光密度值（33.95±6.69），顯著高于基質(zhì)對照組（23.42±3.30）（P＜0.05）。

圖2　小型豬陰道灌流液的流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞分析

圖3　小型豬陰道灌流液沉淀細(xì)胞CD45+細(xì)胞FACS分析典型直方圖（BD FITC標(biāo)記CD45抗體）

3　討論

表3　不同時間各處理組小型豬CVL液CD45+細(xì)胞百分率　　　　　　　　　　　　　　　%

本研究探討了運(yùn)用小型豬建立陰道外用藥物的陰道黏膜免疫炎癥反應(yīng)模型，用以評價新型陰道外用藥物是否會導(dǎo)致陰道黏膜刺激性及免疫炎癥反應(yīng)。女性生殖道外用藥物包括外用避孕藥、抗HIV性途徑傳播的殺微生物劑、陰道防御增強(qiáng)劑如益生菌制劑、陰道潤滑劑、以及生殖道抗感染藥物等，品種眾多，應(yīng)用廣泛。

圖4　小型豬陰道黏膜CD45表達(dá)結(jié)果

兔陰道刺激模型是用于評價生殖道外用藥物局部安全性的經(jīng)典模型［1］。本研究對傳統(tǒng)的兔陰道刺激模型進(jìn)行了改進(jìn)［11］，運(yùn)用小型豬，在原有病理和解剖學(xué)檢測指標(biāo)的基礎(chǔ)上，增加了分子水平上的檢測, 這樣不僅能夠反映出黏膜的炎癥情況，而且對免疫系統(tǒng)的激活情況可以有更全面的了解。

本研究結(jié)果顯示, 陰道給予40 mg/mL N-9凝膠連續(xù)7 d，N-9模型組可見部分黏膜上皮發(fā)生潰瘍、壞死以及炎性細(xì)胞浸潤； 陰道黏膜固有層可見多量Gra、單核細(xì)胞浸潤、毛細(xì)血管充血、出血； 半定量病理評分提示N-9模型組分值顯著高于基質(zhì)對照組,提示小型豬陰道黏膜免疫炎癥反應(yīng)模型造模成功。

國外研究［12］證實, N-9能引起陰道黏膜上皮的損傷和嚴(yán)重的組織炎癥反應(yīng)，激活白介素-1（IL-1）的分泌和核因子-κβ（NF-κβ）的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致細(xì)胞因子（IL-1，IL-6和TNFα）和趨化因子（IL-8、IL-10和吞噬細(xì)胞炎癥蛋白）等的釋放，大量炎癥細(xì)胞（特別是Gra和CD45+細(xì)胞）涌入陰道灌洗液中。CVL中的上述成分的升高與陰道黏膜損傷、免疫炎癥反應(yīng)甚至HIV感染增加可能相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，在末次給藥后24 h，與基質(zhì)對照組相比，N-9模型組CVL中性粒細(xì)胞比例明顯升高。

采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測白細(xì)胞共同抗原（leuckocyte common antigen, LCA）-CD45在小型豬陰道黏膜的表達(dá), 可以直觀地觀察到陰道黏膜炎性細(xì)胞的分布和免疫細(xì)胞的活化情況。若CD45+細(xì)胞表達(dá)較多則提示該部位的免疫炎癥反應(yīng)明顯, 候選藥物的局部刺激性明顯。本研究中CD45+細(xì)胞免疫組織化學(xué)結(jié)果表明, 基質(zhì)對照組陰道黏膜上皮呈現(xiàn)少量散在CD45+細(xì)胞, 而N-9 模型組CD45+細(xì)胞在黏膜上皮層大量表達(dá)。本研究中流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果亦提示CVL中CD45+細(xì)胞百分率顯著升高, 該結(jié)果與國外報道一致［13］。

綜上所述, 本研究采用廣西巴馬小型豬陰道黏膜免疫炎癥反應(yīng)模型, 通過流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化與病理學(xué)觀察相結(jié)合的檢測方法, 檢測CVL中的中性粒細(xì)胞比例、CD45+細(xì)胞分析以及陰道組織病理改變和組織黏膜中CD45免疫定位表達(dá), 結(jié)果均提示N-9誘導(dǎo)陰道黏膜組織的炎癥反應(yīng), 破壞了黏膜上皮屏障的完整性, 活化了大量免疫細(xì)胞, 顯現(xiàn)出小型豬可作為免疫炎癥反應(yīng)模型的潛在特點, 證實小型豬可成為一種良好的陰道免疫炎癥評價模型。本研究中關(guān)于陰道黏膜免疫炎癥反應(yīng)的檢測指標(biāo), 對擬定陰道殺微生物劑臨床前安全性評價體系具有一定的參考價值。今后, 還需進(jìn)一步探索建立能客觀全面評價抗HIV陰道殺微生物劑安全性的小型豬模型。

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Establishment of Vaginal Mucosal Immunoinflammatory Response Model in Minipig

HUANG Chao1, GONG Yi-juan1, TIAN Fang1, WANG Yu-zhu1, SUN Bing1,2, ZHI Rui-na1,2, XIA Min-jie1, DING Xun-cheng1, ZHOU Xin-chu3, LI Wei-hua1
（1. State Key Lab of Family Planning Drugs and Devices， Shanghai Institute of Planned Parenthood Research， Shanghai 200032， China； 2. School of Public Health， Fudan University， Shanghai 200032；3. Shanghai Jiao Tong University School of Agriculture and Biology， Shanghai 201101， China）

ObjectiveTo establish the vaginal mucosal immuno-inflammatory model response of minipig. MethodsSix female minipigs were randomly divided into the control and Nonoxynol-9 （N-9）model group （40 mg/mL）. After 12 days of estradiol benzoate intramuscular injection, the test drugs （N-9）were administered through vagina to minipigs at 5 mL/d for 7 consecutive days. On the 7th day, histopathological examination of vaginal mucosa was undertaken and the pathological scores were calculated based on histological indexes including epithelial ulceration/erosion, necrosis, cell infiltration, hemorrhage, congestion and edema. Cervicovaginal lavage （CVL） was collected at 24 h and 72 h after drug administration. The percentage of neutrophilic granulocytes and CD45+cells in the CVL deposited cells were detected by flow cytometry. The expression and location of CD45+cells in the vaginal mucosa were assessed by using immuno-histochemical （IHC） assay. ResultsHistopathological examination showed obvious lesions including inflammation, bleeding and edema in the vaginal epithelium of the N-9 group. Histological score of the N-9 group （18.0±3.2） was significantly higher than that of the control （3.3±0.2）（P＜0.01）. The percentage of neutrophilic granulocytes in the CVL cells of N-9 group was （41.70±1.63）% （24 h） and （51.17±3.81）% （72 h）, and the percentage of CD45+cells in the CVL cells of N-9 group was （58.5±4.73） % （24 h） and （88.0±3.57）% （72 h）, both showed significant increase compared to that of the control （P＜0.01）. CD45+cell expression increased significantly in the N-9 group. The IOD value of N-9 group was 33.95±6.69, which was significantly higher than that of the control group （28.42±8.96）（P＜0.05）. ConslusionThe vaginal mucosal immuno-inflammatory response model of mini-pigs could be induced by giving 40 mg/mL N-9 gel to the mini-pigs through vagina for 7 consecutive days.

Minipig； Nonoxynol-9 （N-9）； Histopathology； Cervicovaginal lavage（CVL）；Immuno-inflammation response； Leuckocyte common antigen-CD45

Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0081-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.02.001

2015-12-07

國家科技重大專項（2013ZX10001006-003-002）； 國家科技重大專項（2012ZX10001007-009-003）； 十二五國家科技支撐計劃（2012BAI31B04）； 上海市科委項目（13431900800）

黃超, 男, 本科, 主要從事新藥研發(fā)及生殖藥理評價研究。E-mail： 553026696@qq.com共同第一作者, 弓藝涓, 女, 碩士, 主要從事藥物研發(fā)。E-mail： gongyijuan@126.com

李衛(wèi)華, 女, 博士, 研究員, 主要從事生殖毒理和藥物安全評價研究。E-mail： iamliwehua@foxmail.com