張加一，劉 霞，胡芳芳，程永安

（西北農林科技大學園藝學院 陜西楊凌 712100）

隨著植物基因工程技術的迅速發(fā)展，運用生物技術進行種質創(chuàng)新、改良南瓜品種已經成為南瓜遺傳育種研究的新途徑。建立高效的南瓜再生體系是南瓜功能基因鑒定、轉基因等研究的基本條件之一。目前關于子葉節(jié)再生體系的研究主要集中在大豆[1-3]、黃瓜[4-6]、甜瓜[7-9]、西瓜[10-12]等作物上，有關南瓜子葉節(jié)離體培養(yǎng)的研究已有報道[13-14]，但再生體系并未完善，誘導出芽率不穩(wěn)定，生長緩慢。筆者對南瓜子葉節(jié)再生體系進行了優(yōu)化，以6種南瓜的子葉為試驗材料，進行誘導再生。目的是建立一套高效的南瓜子葉節(jié)再生體系，為進一步開展南瓜遺傳轉化和生物育種技術工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試南瓜品種為‘上桔’‘金栗’‘銀栗’‘貝栗灰’‘永安2號’‘永安5號’，均由西北農林科技大學園藝學院南瓜課題組提供。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加 30 g·L-1蔗糖，8 g·L-1瓊脂條，pH 值為5.8。1/2 MS培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基中大量元素減半，其他元素不變，pH值為5.8。其他激素如KT、6-BA、IBA，均配成母液于4℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 外植體的獲得 將浸泡1 h的種子在超凈工作臺上去殼，在70%酒精消毒30 s，再用0.1%HgCl2消毒10 min，無菌水沖洗4次。將種子接種于1/2 MS培養(yǎng)基上，在25℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3 d。在超凈工作臺上將外種皮剝去，再置于光照強度2 500 lx、光照16 h/d的條件下培養(yǎng)。

1.2.2 不定芽分化的誘導 選取日齡8～10 d、苗態(tài)為2片葉子斜向上伸展的無菌幼苗，用解剖刀切去部分下胚軸，留取3～5 mm連著2片子葉的下胚軸，將2片子葉分開，剔除中間的頂芽生長點，將子葉和3～5 mm下胚軸部位用無菌手術刀橫向劃多道傷口，然后將有傷口的一端垂直插入添加了不同濃度激素的培養(yǎng)基中。該試驗以MS基本培養(yǎng)基為對照，共設9種誘導培養(yǎng)基（表1）。每瓶接種4個外植體，每個處理6瓶。將接種好的子葉節(jié)置于光照強度2 500 lx、光照16 h/d的條件下培養(yǎng)。

表1 9種誘導不定芽的培養(yǎng)基 ρ（/mg·L-1）

1.2.3 子葉節(jié)不定芽增殖與生根 將愈傷組織分化出的不定芽，轉接到5號培養(yǎng)基（MS+1.0 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA+0.02 mg·L-1IBA）上進行繼代擴增。當芽叢生長到2～3 cm時，將芽叢取出，切分后接到MS培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照強度 2 500 lx、光照 16 h/d。

計算不定芽誘導率和生根率。數(shù)據(jù)用Excel 2007、SPSS 18.0軟件進行方差分析。

不定芽誘導率/%=（生長不定芽的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100

生根率/%=（誘導出根的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100

2 結果與分析

2.1 6-BA和IBA配比對南瓜不定芽誘導的影響

由表2可知，在MS培養(yǎng)基中加入不同濃度的6-BA和IBA均可以誘導南瓜子葉節(jié)形成不定芽，而不添加植物激素的培養(yǎng)基不能誘導不定芽。其中以添加1.0 mg·L-16-BA和0.02 mg·L-1IBA處理的不定芽誘導率最高，達到66.67%，出芽時間最短，為18 d。而隨著6-BA和IBA濃度的不斷升高，出芽時間增加，出芽數(shù)量減少，出芽率顯著降低，說明當6-BA和IBA的濃度過高時不易誘導出芽。

表2 6-BA和IBA配比對南瓜不定芽誘導的影響

2.2 不同KT濃度對南瓜不定芽誘導的影響

6-BA和IBA的質量濃度分別確定為1.0mg·L-1和0.02 mg·L-1，進一步確定KT的最佳濃度。由表3可知，除5號培養(yǎng)基外，其余添加了KT的培養(yǎng)基的出芽率均顯著高于無KT的1號培養(yǎng)基。說明KT能夠促進愈傷組織分化成芽。在一定范圍內隨KT濃度的增加，出芽率顯著增加，其中當KT質量濃度為2 mg·L-1和3 mg·L-1時誘導率最高均為100%。但當KT質量濃度超過3 mg·L-1時，出芽率顯著降低。且添加了KT的培養(yǎng)基出芽時間較短。

表3 不同KT濃度對南瓜不定芽誘導的影響

2.3 不同基因型對南瓜不定芽誘導的影響

由表4可知，這6組培養(yǎng)基均可以用來誘導南瓜不定芽。但不同基因型南瓜的誘導效果在不同培養(yǎng)基上表現(xiàn)不同?！惱趸摇?號和8號培養(yǎng)基上的誘導率均為100%，且顯著高于其他品種；但在1號培養(yǎng)基上的誘導率僅為37.5%，顯著低于其他品種。‘永安5號’在8號培養(yǎng)基上的出芽率顯著高于其他品種，但在1號培養(yǎng)基上的表現(xiàn)明顯不如其他品種。‘金栗’在5號培養(yǎng)基上的誘導率為100%，且顯著高于其他品種；但在6號培養(yǎng)基上低于‘永安2號’‘貝栗灰’和‘銀栗’。不同南瓜基因型在誘導率上也存在明顯差異，‘上桔’在所有培養(yǎng)基中的平均誘導率顯著低于其他品種。

表4 基因型對不定芽分化的影響%

2.4 不定芽的繼代擴增與生根

將子葉節(jié)不定芽接種在5號培養(yǎng)基（MS+1.0 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA+0.02 mg·L-1IBA）上繼代擴增（圖1-1、1-2），發(fā)現(xiàn)新形成的不定芽的數(shù)量不僅多，而且葉色濃綠、植株健壯，易形成芽叢（圖1-3），生根也較容易。當分化的幼苗長到2～3cm，將其接到生根培養(yǎng)基上（圖1-4）。發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)5 d后，幼苗莖基部切口處出現(xiàn)白色不定根；培養(yǎng)10 d后，均能生長出正常根系，生根率為100%。

圖1 南瓜子葉節(jié)再生體系

3 討論與結論

張玉園[13]等研究‘北觀’南瓜子葉節(jié)離體再生時發(fā)現(xiàn)，當6-BA質量濃度超過1.0 mg·L-1時，不定芽誘導率下降。肖守華等[14]在研究西瓜高效再生體系時發(fā)現(xiàn)，6-BA是西瓜外植體分化的關鍵因素，且再添加低濃度的IAA和IBA對不定芽的誘導有一定的促進作用。本試驗結果表明，6-BA和IBA的配比為1.0 mg·L-1和0.02 mg·L-1時培養(yǎng)基不定芽誘導率最高，而高濃度的6-BA和IBA則抑制了不定芽的發(fā)生。徐恒戩[15]在研究黑籽南瓜器官離體再生時發(fā)現(xiàn)，KT的添加對不定芽的發(fā)生是必需的，高濃度的KT能顯著提高出芽率，但當KT質量濃度大于 4 mg·L-1時，外植體玻璃化嚴重，影響其正常生長發(fā)育。崔波等[16]在研究中發(fā)現(xiàn)KT對幼芽的伸長起促進作用。本試驗在培養(yǎng)基中添加3 mg·L-1KT時誘導率最高，為83.33%。吳廷全等[17]研究發(fā)現(xiàn)在相同條件下，不同基因型的誘導率不同。任桂紅[18]的試驗表明，南瓜離體再生對基因型的依賴性很強，且不同的南瓜對各種激素的敏感性不同。本試驗所選的6個材料均可以誘導出不定芽，但不同品種的誘導率有顯著差異。其中‘銀栗’最易誘導出芽，誘導率為93.75%。

本研究中，不定芽繼代擴增在5號培養(yǎng)基中完整進行，效果較好，其他5個培養(yǎng)基對繼代擴增的效果如何，有待以后的試驗證明。

本研究結果表明，南瓜子葉節(jié)通過人工誘導培養(yǎng)，可以獲得再生植株，其最佳誘導培養(yǎng)基為：MS+3 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA+0.02 mg·L-1IBA，平均誘導率可達到 83.3%。6-BA 1.0 mg·L-1和 IBA 0.02 mg·L-1質量濃度組合是6-BA與IBA組合中不定芽誘導率最高的。KT可以顯著提高不定芽的誘導率；南瓜的基因型在子葉節(jié)誘導出芽方面有差異，南瓜品種‘銀栗’最易誘導出芽，誘導率為93.75%。本試驗中建立的南瓜子葉節(jié)再生體系采用器官直接發(fā)生途徑，不經過脫分化和再分化，直接誘導出苗，縮短了再生周期，且再生頻率較高，可以作為南瓜遺傳轉化的再生體系。