湯亞飛， 何自福*， 佘小漫， 林毓娥， 藍國兵

1廣東省農業(yè)科學院植物保護研究所，廣東 廣州 510640； 2廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣東 廣州 510640； 3廣東省農業(yè)科學院蔬菜研究所，廣東 廣州 510640

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黃瓜資源對黃瓜綠斑駁病毒廣東分離物的抗性水平鑒定

湯亞飛1,2， 何自福1,2*， 佘小漫1， 林毓娥3， 藍國兵1

1廣東省農業(yè)科學院植物保護研究所，廣東 廣州 510640；2廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣東 廣州 510640；3廣東省農業(yè)科學院蔬菜研究所，廣東 廣州 510640

【背景】黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus，CGMMV)是嚴重威脅葫蘆科作物生產的毀滅性病原之一，該病毒已入侵我國十多個省份，危害西瓜、黃瓜等作物并造成嚴重的經濟損失。早在2009年廣東即發(fā)現(xiàn)CGMMV為害西瓜和黃瓜，但黃瓜等葫蘆科作物對其抗性情況尚不清楚。【方法】采用人工機械摩擦接種方法，測定了14份黃瓜種質資源對CGMMV廣東分離物的抗性水平?！窘Y果】從廣東葫蘆病樣中分離獲得CGMMV，該病毒分離物MP基因序列與國內報道的各分離物同源率均在99%以上；14份黃瓜種質資源對該病毒分離物均表現(xiàn)為感病?！窘Y論與意義】廣東主要黃瓜資源對CGMMV均表現(xiàn)為感病，這為我省防控該病毒病提供了科學依據，也為黃瓜抗病育種提供了指導。

黃瓜綠斑駁花葉病毒； 黃瓜種質資源； 抗性水平

黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus，CGMMV)是一種大小為300 nm×18 nm的直桿狀、正單鏈RNA病毒，屬蕪菁花葉病毒科Tymoviridae煙草花葉病毒屬Tobamovirus(Hollingsetal.,1975)。CGMMV極易通過汁液傳播，也是典型的種傳病毒，種子帶毒是其主要的遠距離傳毒方式，也可通過嫁接、菟絲子傳播(馮蘭香等，2007)。該病毒自然寄主范圍較窄,主要包括黃瓜、西瓜、甜瓜、瓠子、南瓜、葫蘆、絲瓜、苦瓜等葫蘆科作物。田間癥狀表現(xiàn)為葉片斑駁、畸形、花葉、有綠色凸起、脈間黃化、葉脈呈綠帶狀，并伴隨植株矮化等，嚴重影響作物的品質和產量，是威脅葫蘆科作物生產的重要病毒之一(李小妮等，2009)。

Ainsworth(1935)首次報道在英國黃瓜上發(fā)生了CGMMV為害。目前，歐洲、亞洲、南美洲的20多個國家已有報道(陳京和李明福，2007)。在中國，Hseuetal.(1987)首次在中國臺灣的冬瓜、西瓜、甜瓜和黃瓜上分離鑒定出該病毒，表明該病毒正式入侵我國。隨后，在廣西(秦碧霞等，2005)、甘肅(李紅霞等，2007)、遼寧(陳紅運等，2009)、北京(田永蕾等，2009)、廣東(李小妮等，2009)、山東(田永蕾等，2009；王云等，2014)、云南(吳鑫等，2010)、湖北(湯少云等，2011)、浙江(林燚等，2012)、湖南(趙慧茹等，2013)、江蘇(任春梅等，2013)、上海(胡亞萍等，2013)、海南(王峰等，2014)、山西(杜江等，2015)、貴州(王莉爽等，2015)等地的棚室保護地及大田栽培的瓜類作物上陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該病毒。由于CGMMV已在我國部分地區(qū)造成大田瓜類作物的毀滅性損失，農業(yè)部發(fā)布了第788號公告，將其確定為全國農業(yè)植物檢疫性有害生物。

選育和種植抗病品種是防治植物病毒最有效、最經濟的措施，而篩選抗病材料和抗病基因是該措施的前提。筆者在調查廣東CGMMV的發(fā)生與為害基礎上，通過人工接種評價了主要黃瓜種質資源的抗性水平，以期為黃瓜抗病育種及CGMMV的綜合防控提供指導。

1　材料與方法

1.1材料

病源材料：葫蘆病葉于2014年1月采自廣東省佛山市三水區(qū)瓜類產區(qū)，病株主要表現(xiàn)為葉片嚴重花葉，有輕微泡狀凸起，田間發(fā)病率100%。

供試材料：14份黃瓜種質資源由廣東省農業(yè)科學院蔬菜研究所提供。

1.2毒原的檢測、鑒定與分離

1.2.1血清學檢測取葫蘆病葉100 mg，按1 g∶10 mL加入0.01 mol·L-1PBS(pH7.2)研磨，8000 r·min-1離心3 min，上清液為葫蘆病葉粗提液。參照董曉輝等(2009)的方法，用CMV、CGMMV單克隆抗體對葫蘆病葉粗提液進行Dot-ELISA血清學檢測。CMV、CGMMV單克隆抗體由浙江大學謝艷教授惠贈。

1.2.2RT-PCR檢測應用RNA提取試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)分別抽提葫蘆病樣葉片的總RNA，以提取的葫蘆病樣總RNA 4 μL作模板，用隨機引物(TaKaRa公司)逆轉錄合成cDNA。利用CGMMV MP基因的特異引物CGMMV-F(5′-CCACGAGTTGTTTCCTAATGC TG-3′)和CGMMV-R(5′-TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT-3′)進行PCR擴增，目的片段大小為870 bp，PCR產物在1%的凝膠電泳上檢測。PCR產物直接送上海生工生物技術有限公司測序，DNAStar軟件(DNASTAR Inc，Madison，USA)對所獲得的基因序列進行拼接，BLAST程序進行序列相似性搜索，DNAStar的MegAlign進行序列比較分析。

1.2.3毒原的分離將CGMMV葫蘆病樣人工摩擦接種到子葉期黃瓜上，接種后30 d，采集發(fā)病葉，應用RT-PCR方法對其再檢測與驗證。

1.3抗病性鑒定

對上述經過人工摩擦接種的子葉期的黃瓜苗進行繁殖，用于抗病性測定。待黃瓜苗長至子葉期，取繁殖的毒原病葉，按1 g病葉∶10 mL 0.01 mol·L-1磷酸緩沖液(pH7.2)進行研磨勻漿，用緩沖液再稀釋10倍后用于人工摩擦接種。每個處理40株，3次重復。接種后，每2周調查一次接種株的病情指數(shù)。接種后第8周，待各處理病株的病情基本穩(wěn)定，可根據此時的病情指數(shù)對待鑒定品種的抗病性水平進行評價。

1.4抗病性評價標準

病情指數(shù)分級標準：0級，無任何發(fā)病癥狀；1級，心葉明脈或輕花葉；3級，心葉及中部葉片花葉、斑駁；5級，多數(shù)葉片花葉，少數(shù)葉片畸形、產生泡狀凸起，植株輕度矮化；7級，重花葉，多數(shù)葉片產生濃綠泡狀凸起或葉脈綠帶、畸形、皺縮，植株矮化；9級，重花葉，葉片明顯畸形，植株嚴重矮化甚至死亡。

根據病情指數(shù)將參試材料的抗性水平分為5類：免疫(I)，DI為0；高抗(HR)，0

運用Excel對數(shù)據做統(tǒng)計分析。

2　結果與分析

2.1毒原的檢測、鑒定與分離

2.1.1病原血清學檢測結果Dot-ELISA檢測結果顯示，采集的葫蘆疑似病樣葉組織粗提取液與CGMMV單克隆抗體反應均為陽性，而與CMV單克隆抗體反應均為陰性，說明該葫蘆病樣受到CGMMV的侵染。

2.1.2病原RT-PCR檢測結果利用CGMMV MP基因的特異引物CGMMV-F/CGMMV-R進行RT-PCR檢測，從上述所有葫蘆疑似病樣的cDNA中均能擴增到1條預期大小870 bp的特異片段，而健康葫蘆樣品中未擴增出任何片段(圖1)。對PCR產物純化測序，在NCBI中進行BLAST比對發(fā)現(xiàn)，分離自廣東葫蘆病葉的CGMMV MP基因序列與中國其他地區(qū)報道的序列同源率均在99%以上，進一步證實該葫蘆病樣受到CGMMV的侵染。

圖1　葫蘆病樣RT-PCR檢測結果Fig.1　Detection result of the diseased cucurbit samples using RT-PCR M:2000 bp marker; 1～6: 葫蘆病樣; 7:健康葫蘆樣品。 M: 2000 bp marker; 1～6: Diseased samples; 7: Healthy sample.

2.1.3毒原的分離人工摩擦接種30 d后，黃瓜新出的真葉表現(xiàn)為花葉、有綠色泡狀凸起。RT-PCR檢測表明，這些接種發(fā)病的黃瓜樣品受到CGMMV的侵染，可作為CGMMV的毒原用于抗性評價。

2.2黃瓜種質資源抗性鑒定結果

應用人工摩擦接種方法將CGMMV廣東分離物分別接種到14份黃瓜上。接種后第8周，各處理病情基本穩(wěn)定，統(tǒng)計各處理的病情指數(shù)。結果顯示(表1)：G17的平均病情指數(shù)最高(100%)，YF的平均病情指數(shù)最低(71.54%)。方差分析顯示，YF與其余13份黃瓜種質的病情指數(shù)差異達到極顯著水平；K13與其余12份黃瓜種質的病情指數(shù)差異達到極顯著水平；A4*YF與G13、A8、B80、G13*G28、力豐及G17差異達到極顯著水平，與B35、N2、G6差異也達到顯著水平；82大與G13、A8、B80、G13*G28、力豐及G17差異達到極顯著水平，與G6差異達到顯著水平；A4與G17差異達到極顯著水平，與G13、A8、B80、G13*G28、力豐差異也達到顯著水平；其余種質病情指數(shù)間差異均未達到顯著水平。雖然參試的14份黃瓜種質的病情指數(shù)存在不同程度的差異，但這14份黃瓜種質對CGMMV抗性水平均表現(xiàn)為感病。

3　討論

將分離自葫蘆病樣上的CGMMV廣東分離物，通過人工摩擦接種方式，評價14份黃瓜種質的抗性水平。結果顯示，該病毒分離物對黃瓜具有強致病力，這些黃瓜均表現(xiàn)為感病，表明我省主要黃瓜育種資源缺乏抗CGMMV的材料，需要進一步廣泛收集和篩選，以滿足黃瓜抗病新品種選育及CGMMV綜合防控要求。

對CGMMV廣東分離物的MP基因進行克隆及序列分析，該序列與國內報道的各分離物同源率高達99%以上，說明侵染廣東葫蘆的病毒分離物是CGMMV的一個分離物。

自2005年首次在我國大陸報道發(fā)現(xiàn)CGMMV以來，全國有多個省份先后出現(xiàn)了CGMMV的疫情。吳元華等(2010)對CGMMV在我國的風險性進行了分析，認為CGMMV定殖、擴散的可能性極高，屬于高度危險性的有害生物。一旦瓜類作物被侵染，則防治較為困難，做好該病害的預防和控制刻不容緩。培育抗病品種是最經濟有效的預防和控制措施之一，而對種質資源的抗病性進行測定是培育抗病品種的前提和基礎。目前，國內僅見到砧木與西瓜品種對CGMMV耐病性比較的報道(葉建人等，2015)，未見到其他葫蘆科作物對CGMMV抗性的相關報道。

表1　14份黃瓜種質資源對CGMMV抗性水平鑒定結果Table 1　The resistance levels of 14 cucumber germplasms to cucumber green mottle virus

黃瓜是廣東省重要的蔬菜作物，目前正在遭受CGMMV的威脅。本文評價了收集到的14份黃瓜種質資源對CGMMV的抗性水平，雖然這些資源的病情指數(shù)存在不同程度的差異，但對CGMMV均表現(xiàn)為感病，說明我省主要黃瓜種質資源中缺少抗CGMMV的資源。下一步將收集更多黃瓜種質資源材料，評價其對CGMMV的抗病性，為黃瓜抗CGMMV育種提供抗源材料，也為我省CGMMV綜合防控提供指導。

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(責任編輯:郭瑩)

Identification of cucumber germplasm resistance toCucumbergreenmottlevirusGuangdong isolate

Ya-fei TANG1,2, Zi-fu HE1,2*, Xiao-man SHE1, Yu-e LIN3,Guo-bing LAN1

1PlantProtectionResearchInstitute,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,Guangzhou,Guangdong510640,China;2GuangdongProvincialKeyLaboratoryofHighTechnologyforPlantProtection,Guangzhou,Guangdong510640,China;3VegetableResearchInstitute,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,Guangzhou,Guangdong510640,China

【Background】Cucumbergreenmottlemosaicvirus(CGMMV) is one of the most devastating pathogens of cucurbit crops. The virus has invaded more than ten provinces of China and infected crops such as watermelon and cucumber, causing serious economic losses. CGMMV infected watermelon and cucumber in Guangdong Province in 2009, but the resistance of cucumber and other cucurbits was unknomn. 【Method】 The resistance of 14 cucumber germplasms to a CGMMV isolate was tested using artificial mechanical inoculation and nucleotide sequencing. 【Result】 The MP nucleotide sequence of CGMMV of Guangdong isolate from the diseased cucurbit samples was 99% similar to other isolates of CGMMV collected in China. All of 14 cucumber germplasms were susceptible to the isolate of CGMMV. 【Conclusion and significance】 The main cucumber germplasms from Guangdong are not resistant to CGMMV. This result provides a scientific basis for control of CGMMV, and some guidance for cucumber breeding to resist CGMMV in Guangdong.

Cucumbergreenmottlemosaicvirus； cucumber germplasm； resistance levels

2016-05-11接受日期(Accepted)： 2016-06-27

國家公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201303028)； 廣東省科技計劃項目(2014B070706017、2014B020202004)

湯亞飛， 女， 碩士研究生。 研究方向: 植物病毒。 E-mail: yf.tang1314@163.com

Author for correspondence), E-mail: hezf@gdppri.com

10. 3969/j.issn.2095-1787.2016.03.010