王君麗徐彥飛李小莉徐曉妮皮丹

Th17/Treg細(xì)胞在支氣管哮喘患者外周血中的表達(dá)

王君麗①徐彥飛②李小莉①徐曉妮②皮丹②

目的：探討Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）在支氣管哮喘患者外周血中的表達(dá)及意義。方法：收集30例正常對(duì)照組，30例確診支氣管哮喘患者（哮喘組）在急性發(fā)作期及緩解期外周血，分別檢測(cè)Th17/Treg細(xì)胞的表達(dá)情況。結(jié)果：支氣管哮喘患者急性發(fā)作期間Th17較正常對(duì)照組明顯升高，而Treg細(xì)胞比例明顯下降，支氣管哮喘緩解期上述異常指標(biāo)均趨于正常，但比正常對(duì)照組仍有明顯改變（P<0.05）。Th17、Th17/Treg與支氣管哮喘患者ACQ評(píng)分呈正相關(guān)（P<0.05），Treg與ACQ評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），但Th17和Treg之間無明顯相關(guān)性（P>0.05）。結(jié)論：在支氣管哮喘患者體內(nèi)的存在Th17及Treg細(xì)胞的平衡失調(diào)，可能參與疾病的進(jìn)展，成為免疫調(diào)節(jié)治療的靶點(diǎn)。

支氣管哮喘； TH17； 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是最常見的呼吸道慢性疾病之一，近年來支氣管哮喘的發(fā)病有上升趨勢(shì)，隨著全球哮喘防治創(chuàng)議（GINA）指南的全面推廣，哮喘的防治較之前取得了很大的進(jìn)展，但依然不能得到根治，仍有部分患者未經(jīng)規(guī)范化治療，給患者和社會(huì)造成沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。這一現(xiàn)狀促使醫(yī)學(xué)工作者對(duì)哮喘的發(fā)病機(jī)制和干預(yù)措施需作進(jìn)一步地研究，從而找到新的治療靶點(diǎn)和方法。目前Th17/Treg細(xì)胞失衡作為免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制已受到研究人員的重視[1]。本研究針對(duì)支氣管哮喘外周血中Th17/Treg細(xì)胞失衡進(jìn)行研究，旨在為臨床治療重癥和難治性哮喘提供新的治療靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1-12月于深圳市南山醫(yī)院門診就診的已確診為支氣管哮喘的患者30例（含吸入糖皮質(zhì)激素者），排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）在抽血前3個(gè)月內(nèi)未使用口服或靜脈糖皮質(zhì)激素者；（2）合并肺部其他疾病者；（3）合并嚴(yán)重心肝腎臟等其他系統(tǒng)疾病者。另擇同期于深圳市南山醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的職工30例作為正常對(duì)照組，分別抽取兩組受試者2 mL×3支EDTA抗凝血。兩組一般年齡和性別比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見表1。本研究經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意且患者均簽署知情同意書。

表1　兩組一般資料比較（±s） 例（%）

表1　兩組一般資料比較（±s） 例（%）

性別組別　年齡≥50歲　<50歲　男　女哮喘組（n=30）　8（42.1） 22（53.7） 11（45.8） 19（52.8）對(duì)照組（n=30）　11（57.9） 19（46.3） 13（54.2） 17（47.2）字2值　0.580　0.792 P值　>0.05　>0.05

1.2方法

1.2.1血漿及外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的準(zhǔn)備 取兩組受試者的抗凝血6 mL，其中2 mL離心后，取上層血漿，置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫溆嗖糠钟肞BS液1∶3稀釋備用。將淋巴細(xì)胞分離液加入離心管內(nèi)，將稀釋好的外周抗凝血緩慢加在上層，2000 r/min×30 min離心，用吸管輕輕將PBMC層細(xì)胞緩慢吸出，用PBS緩沖液低溫離心洗滌PBMC 3次。查看細(xì)胞活力，確?；盍Υ笥?5%，用含有10%胎牛血清的RDMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞備用。

1.2.2PBMC Th17細(xì)胞的標(biāo)記 在PBMC培養(yǎng)基中分別加入莫能霉素、離子霉素及PMA，孵箱內(nèi)培養(yǎng)6 h，取出細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，分別標(biāo)記CD4-FITC，IL-17-PE，CD25-APC，每種標(biāo)記均設(shè)置陰性同型對(duì)照，相關(guān)試劑均購自eBioscience USA公司，按照說明書操作。

1.2.3外周血Treg細(xì)胞的標(biāo)記 直接取收集的外周血進(jìn)行CD4、CD25表面抗原的標(biāo)記，標(biāo)記好的細(xì)胞破膜后進(jìn)行Foxp3及其同型對(duì)照的標(biāo)記，每種標(biāo)記均設(shè)置陰性同型對(duì)照，相關(guān)試劑均購自eBioscience USA公司，按照說明書操作。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)分析標(biāo)記好的PBMC 流式細(xì)胞儀為美國(guó)Beckman-Coulter公司產(chǎn)品，以前向角（FS）和側(cè)向角（SS）散點(diǎn)圖設(shè)門區(qū)分PBMC，對(duì)門內(nèi)CD4+的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析，每管收集1×104個(gè)細(xì)胞，分析CD25+Foxp3+細(xì)胞和IL-17+細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中的比例。使用EXPO32 ADC Analysis 軟件分析結(jié)果。

1.2.5隨診要求 支氣管哮喘患者在慢性持續(xù)期隨診時(shí)，要求完成ACQ評(píng)分，在評(píng)分前需由經(jīng)治醫(yī)生詳細(xì)講解表格內(nèi)容。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 16.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，相關(guān)分析比較采用線性相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1外周血Th17/ Treg細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 支氣管哮喘急性發(fā)作期患者外周血Th17比例較正常對(duì)照組明顯升高，在恢復(fù)后即處于慢性持續(xù)期時(shí)較急性發(fā)作期明顯下降；Treg在急性發(fā)作期明顯下降，而在慢性持續(xù)期時(shí)又明顯上升，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2　外周血Th17/Treg細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果（±s）

表2　外周血Th17/Treg細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果（±s）

*與對(duì)照組比較，P<0.05；△與急性發(fā)作期比較，P<0.05

組別　Th17　Treg　Th17/Treg正常對(duì)照組（n=30）　2.09±0.31　8.39±1.54*0.26±0.05*△急性發(fā)作期（n=30）　2.54±0.23　6.03±1.31*0.44±0.11*△慢性持續(xù)期（n=30）　2.26±0.28　7.44±1.68*0.32±0.09*△

2.2慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者ACQ評(píng)分與Th17/ Treg相 關(guān) 性 分 析 Th17、Th17/Treg與ACQ評(píng)分 均 呈 正 相 關(guān)（r1=0.445，P1=0.014；r2=0.468，P2=0.009），Treg與ACQ評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.407，P=0.026），Th17與Treg之 間 無 明 顯 相 關(guān) 性（r=-0.339，P=0.067）。

3　討論

支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，目前尚未完全明確，經(jīng)典理論認(rèn)為氣道的炎癥機(jī)制是其中最主要的機(jī)制，T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失衡在其中起到了關(guān)鍵作用，輔助性T細(xì)胞1型（Th1）/輔助性T細(xì)胞2型（Th2）細(xì)胞失衡已明確在支氣管哮喘發(fā)病起重要作用，但目前很多研究證實(shí)支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制不能用單純的Th1/Th2細(xì)胞失衡來解釋[2-3]。研究證實(shí)Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其代表性細(xì)胞因子IL-17、IL-10等在免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制中起到重要作用，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病[4-5]。文獻(xiàn)[6-7]指出在兒童哮喘中，也存在Th17/Treg的平衡失調(diào)，本研究以成人支氣管哮喘為研究對(duì)象，主要研究支氣管哮喘外周血是否存在Th17/Treg免疫失衡，及其與疾病嚴(yán)重程度之間的關(guān)系。

首先筆者發(fā)現(xiàn)在成人支氣管哮喘患者急性發(fā)作期間Th17比例較正常對(duì)照組明顯升高，而Treg細(xì)胞比例明顯下降，這與之前在兒童哮喘中的研究結(jié)果一致，本研究還發(fā)現(xiàn)在支氣管哮喘緩解期，上述異常升高或下降的指標(biāo)均趨向正常。這說明Th17/ Treg免疫失衡在支氣管哮喘的急性發(fā)作中起到了關(guān)鍵的作用。

Th17細(xì)胞通過免疫調(diào)節(jié)在支氣管哮喘的炎癥反應(yīng)中起到重要作用。首先通過分泌IL-17，誘導(dǎo)上調(diào)IL-8的分泌，從而引起中粒細(xì)胞在氣管內(nèi)的聚集，并介導(dǎo)氣管的炎癥反應(yīng)。Cheung等[8]的研究表明，Th17細(xì)胞還可以通過分泌IL-17作用于嗜酸性粒細(xì)胞，刺激嗜酸性粒細(xì)胞釋放化學(xué)介質(zhì)，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。有研究表明在重癥哮喘的肺泡灌洗液及血漿中，兒童哮喘患者的外周血中均可檢測(cè)到升高的Th17細(xì)胞和IL-17細(xì)胞因子，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，有研究表明IL-17R缺失的小鼠不能被OVA激發(fā)成哮喘[9-10]。各種致敏原用不同方法誘導(dǎo)的哮喘動(dòng)物模型中，大多提示IL-17具有重要作用[11]。本文研究結(jié)果表明在成人支氣管哮喘疾病中，Th17細(xì)胞比例明顯升高，且與疾病的嚴(yán)重程度之間存在著正相關(guān)，與前人的研究結(jié)果一致。

Treg細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，可以負(fù)反饋調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化引起的免疫反應(yīng)，從而使其不會(huì)因過度免疫對(duì)機(jī)體造成損傷。國(guó)內(nèi)外許多研究證實(shí)在兒童哮喘和哮喘重癥患者外周血中的CD4+CD25+Treg細(xì)胞的數(shù)量和功能均受到抑制，主要表現(xiàn)為哮喘患者體內(nèi)的Treg細(xì)胞的FoxP3 mRNA表達(dá)下降，且分泌IL-10和TGF-β水平顯著下降[6，12]。因此推測(cè)Treg細(xì)胞可能參與哮喘氣道炎癥的發(fā)生。本研究結(jié)果亦表明在成人支氣管哮喘患者體內(nèi)也存在CD4+CD25+FoxP3+Treg數(shù)量的下降，與國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果一致，并證實(shí)Treg細(xì)胞的抑制與疾病的嚴(yán)重程度之間存在相關(guān)性。

由此可見，Th17及Treg細(xì)胞在支氣管哮喘體內(nèi)均有數(shù)量的異常，但是它們之間是否存在有相關(guān)性呢？本研究也對(duì)支氣管哮喘患者在哮喘慢性持續(xù)期的兩個(gè)指標(biāo)之間進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明兩者之間并不存在明顯的相關(guān)性，該結(jié)果與之前在兒童哮喘體內(nèi)的發(fā)現(xiàn)并不一致，考慮因?yàn)橹夤芟且粋€(gè)復(fù)雜的免疫疾病，各種細(xì)胞和細(xì)胞因子之間作用錯(cuò)綜復(fù)雜，僅僅幾個(gè)細(xì)胞亞群或細(xì)胞因子來解釋其免疫失衡遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠[13]。

本研究的結(jié)果表明，在支氣管哮喘患者外周血中確實(shí)存在Th17及Treg細(xì)胞的免疫紊亂，可能為支氣管哮喘的治療提供新的靶點(diǎn)。

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Expression of Th17/Treg Cells in Peripheral Blood of Patients with Bronchial Asthma

WANG J un-li，XU Yan-fei，LI Xiao-li，et al.

Medical Innovation of China，2016，13（24）：117-119

Objective：To investigate the expression of Th17/Treg cells in peripheral blood of patients with bronchial asthma.Method：A total of 30 cases of normal control group and 30 cases diagnosed with bronchial asthma in acute attack and remission of peripheral blood were collected，the expression of Th17/Treg cells were detected respectively.Result：Th17 in patients with bronchial asthma during acute attack was significantly higher than that in normal control group，the proportion of Treg cells decreased significantly，in the remission stage of bronchial asthma，the abnormal indexes tended to be normal，but there was still a significant change compared with the normal control group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Th17，Th17/Treg were positively correlated with bronchial asthma patients ACQ score（P<0.05），Treg was negatively correlated with ACQ score（P<0.05），but there was no significant correlation between Treg and Th17（P>0.05）.Conclusion：Th17/Treg cells in patients with bronchial asthma may be involved in the progression of disease，become the target of immune regulation therapy.

Bronchial asthma； TH17； Regulatory T cells

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.24.033

2016-05-18） （本文編輯：李穎）

①南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院 廣東 深圳 518101

②廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院

王君麗

First-author’s address：Shenzhen Hospital of Southern Medical University，Shenzhen 518101，China