王文軍郭建紅張楊韓德五

內(nèi)毒素在高糖高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎大鼠中的作用機(jī)制研究*

王文軍①郭建紅①?gòu)垪睥夙n德五①

目的：觀察高糖高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）大鼠肝臟巨噬細(xì)胞、血漿腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表達(dá)及肝細(xì)胞凋亡變化特點(diǎn)，探討內(nèi)毒素（LPS）在大鼠NASH發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。方法：雄性SD大鼠隨機(jī)分為9周組：Synthetic diet+saline組、Synthetic diet+LPS組、Regular diet+LPS組和Regular diet+saline組；以及5周組：Synthetic diet組和Regular diet組，并在第5周末處死以觀察高糖高脂飲食對(duì)大鼠肝臟影響。自第6周開(kāi)始，9周組大鼠隔日皮下注射LPS 0.5 mg/kg或相同劑量的0.9%氯化鈉注射液，在9周末處死檢測(cè)其血漿LPS、ALT與TNF-α水平，并觀察肝臟病理變化、測(cè)定肝臟CD68的表達(dá)與肝細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果：5周Synthetic diet組肝臟有輕度脂肪變性。9周Synthetic diet+LPS組與其對(duì)照組Synthetic diet+saline組和Regular diet+LPS組相比，血漿LPS、ALT與TNF-α表達(dá)水平、CD68表達(dá)與細(xì)胞凋亡率均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Synthetic diet+saline組和Regular diet+saline組相比血漿LPS、ALT及TNF-α顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CD68陽(yáng)性表達(dá)與TNF-α水平呈顯著正相關(guān)（r=0.64，P＜0.05）結(jié)論：高糖高脂飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠模型體內(nèi)形成了LPS血癥，LPS可對(duì)肝臟形成第二次打擊，當(dāng)CD68增加，TNF-α的表達(dá)也明顯提高，兩者呈現(xiàn)明顯正相關(guān)，同時(shí)細(xì)胞凋亡率也明顯增多，推斷LPS可能通過(guò)激活巨噬細(xì)胞分泌促炎因子TNF-α介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步促進(jìn)NASH的發(fā)展。

內(nèi)毒素； 非酒精性脂肪性肝炎； 巨噬細(xì)胞； TNF-α； 凋亡

目前肥胖及其相關(guān)疾病在全球呈現(xiàn)流行趨勢(shì)，是醫(yī)學(xué)界面臨的一大挑戰(zhàn)，非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一臨床和病理學(xué)術(shù)語(yǔ)，疾病范圍包括從簡(jiǎn)單的甘油三酯在肝細(xì)胞積累，肝脂肪變性和炎癥、纖維化和肝硬化，常見(jiàn)于肥胖患者［1］。非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoho lic steatohepatitis，NASH）是NAFLD的一種，為發(fā)達(dá)國(guó)家引起慢性肝臟疾病的最常見(jiàn)原因，它會(huì)導(dǎo)致肝硬化和肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)增加［2-4］。因此明確NASH發(fā)病機(jī)制，阻止其病情進(jìn)一步惡化，已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界研究熱點(diǎn)。

近年來(lái)的許多研究已證實(shí)腸源性?xún)?nèi)毒素（LPS）血癥在NASH的形成發(fā)展中有著重要作用［5］，在前期研究筆者發(fā)現(xiàn)在NASH中肝細(xì)胞凋亡率隨病情加重而升高，提示肝細(xì)胞凋亡在NASH的病理發(fā)展過(guò)程中是一個(gè)極為重要的因素［6］，但是目前LPS引起肝細(xì)胞凋亡機(jī)制尚不明確，本研究旨在通過(guò)高脂高糖飲食誘導(dǎo)建立NASH大鼠模型，多次小劑量注射LPS觀察肝臟巨噬細(xì)胞與腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-a，TNF-α）的表達(dá)及肝細(xì)胞凋亡變化特點(diǎn)來(lái)探討LPS在NASH大鼠中的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠30只，體重200～250 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；LPS測(cè)定鱟試劑盒（上海伊華臨床醫(yī)學(xué)科技公司）；TNF-α放免試劑盒（解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所）；CD68小鼠抗大鼠單克隆抗體（Abcame公司），二抗免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），TUNEL檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型建立 30只雄性SD大鼠均給予標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)飼料，自由進(jìn)食飲水3d后，設(shè)立9周組：Synthetic diet+saline 組、Synthetic diet+LPS組、Regular diet+LPS組、Regular

diet+saline組， 每組5只。 另外設(shè)立5周組，Synthetic diet組與Regular diet組，每組5只，在第5周末麻醉處死該組大鼠以觀察高糖高脂對(duì)大鼠肝臟影響。Synthetic飲食配方為含68.75%普通飼料+20%豬油+10%蔗糖+1%膽固醇+0.25%膽酸。自第6周開(kāi)始，9周組大鼠在相同條件下隔天皮下注射LPS 0.5 mg/kg或相同劑量的0.9%氯化鈉注射液，所有大鼠自由進(jìn)食與飲水。在實(shí)驗(yàn)第9周末，1%戊巴比妥鈉3 mL/kg腹腔注射麻醉動(dòng)物，無(wú)菌無(wú)熱原條件下取腹主動(dòng)脈血，3500 rpm離心后取血漿備用，取肝左葉10%福爾馬林固定，石蠟包埋5 μm切片備用，余肝組織置于-70 ℃冰箱備用。

1.3.2 病理學(xué)檢查 石蠟切片做HE染色，在光鏡下觀察肝組織病理變化。

1.3.3 生化指標(biāo)檢測(cè) 放免法測(cè)定血漿TNF-α水平；賴(lài)氏2、4-二硝基苯肼比色法測(cè)定血漿ALT活性，鱟試劑法測(cè)定血漿LPS水平，實(shí)驗(yàn)過(guò)程均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 免疫組織化學(xué)方法 石蠟切片免疫組化檢測(cè)肝組織中CD68（巨噬細(xì)胞分子標(biāo)記物）的表達(dá)，在400倍光鏡下，每組取5張，每張隨機(jī)選取取5個(gè)視野，運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行光密度值的測(cè)定。CD68表達(dá)陽(yáng)性為光鏡下細(xì)胞腺呈棕黃色顆粒。

1.3.5 TUNEL染色法 在400倍光鏡下，每組取5張，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)比值，測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Pearson’s相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 肝臟組織學(xué)觀察 光鏡下5周Regular diet組大鼠正常肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞核圓位于中央，呈條索狀排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)脂滴（圖1A）；而5周Synthetic diet組肝細(xì)胞體積增大，胞漿內(nèi)可見(jiàn)小泡脂滴，肝細(xì)胞呈輕度脂肪變性，細(xì)胞輪廓模糊（圖1B）。

圖1　5周組大鼠肝組織病理變化（HE，×100）

2.2 各組生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較 Synthetic diet+LPS組血漿LPS、ALT、TNF-α水平均顯著高于Regular diet+LPS組和Synthetic diet+saline組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），血漿LPS、ALT、TNF-α表達(dá)水平分別為后兩者的1.4～3倍、1.2～4倍、1.3～2倍。Synthetic diet+saline組與Regular diet+saline組相比血漿LPS、ALT、TNF-α均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而Regular diet+LPS組血漿LPS、ALT與TNF-α水平與Regular diet+saline組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1　9周組大鼠各生化指標(biāo)的比較（x-±s）

2.3 各組免疫組化檢測(cè)結(jié)果比較 Regular diet+saline組肝組織較少見(jiàn)CD68陽(yáng)性單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，Regular diet+LPS組陽(yáng)性表達(dá)量也無(wú)明顯變化，與Regular diet+saline組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Synthetic diet+saline組CD68陽(yáng)性表達(dá)量與Regular diet+saline組比較明顯增多（P＜0.05）；而在Synthetic diet+LPS組可見(jiàn)大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，Synthetic diet+LPS組（1.24±0.36）與Synthetic diet+saline 組（0.76±0.18）、Regular diet+LPS組（0.41±0.11）比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2～3。

圖2　各組大鼠肝組織中CD68的表達(dá)（IHC，X400）

圖3　各組大鼠CD68陽(yáng)性表達(dá)平均光密度值比

2.4 各組肝細(xì)胞凋亡變化比較 在光鏡下，正常肝細(xì)胞細(xì)胞核為藍(lán)色，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核為棕黃色，正常對(duì)照組（Regular diet+saline組）偶見(jiàn)少量的肝細(xì)胞凋亡，Regular diet+LPS組可以看到肝細(xì)胞凋亡數(shù)量無(wú)明顯變化，凋亡率與Regular diet+saline組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而在Synthetic diet誘導(dǎo)建立的NASH大鼠模型中，肝細(xì)胞凋亡率明顯升高，Synthetic diet+LPS組肝細(xì)胞凋亡率達(dá)到最高值，與Synthetic diet+saline組、Regular diet+LPS組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4～5。

圖4　各組大鼠肝細(xì)胞凋亡的變化（TUNEL，X400）

圖5　各組大鼠TUNEL染色陽(yáng)性凋亡細(xì)胞變化

2.5 相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson’s相關(guān)性分析，CD68陽(yáng)性表達(dá)與TNF-α水平呈顯著正相關(guān)（r=0.64，P＜0.05）。

3　討論

本研究采用高脂高糖飲食誘導(dǎo)建立大鼠非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）模型，在喂飼5周高脂高糖飲食的基礎(chǔ)上，自第6周開(kāi)始隔天皮下注射內(nèi)毒素（LPS）0.5 mg/kg或相同劑量的0.9%氯化鈉注射液，來(lái)觀察肝臟細(xì)胞凋亡變化特點(diǎn)。研究結(jié)果顯示Regular diet+LPS組大鼠肝臟并無(wú)明顯脂肪病變，血漿LPS水平和肝損傷指標(biāo)血漿ALT表達(dá)與Regular diet+saline組相比亦無(wú)顯著變化；Synthetic diet+LPS組血漿LPS水平進(jìn)一步升高、ALT表達(dá)亦明顯進(jìn)一步增加，肝功能受損加重，與Synthetic diet+saline組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示同樣劑量的LPS對(duì)正常肝臟不具損傷作用，而對(duì)在高糖高脂飲食的作用下發(fā)生輕度脂肪變性的肝臟造成了進(jìn)一步損傷，使肝臟原有疾病加重，對(duì)肝臟形成第二次大擊，促進(jìn)了大鼠NASH的病情進(jìn)展。

CD68是巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，能較好的反映巨噬細(xì)胞在組織中的浸潤(rùn)程度，通常采用免疫組化檢測(cè)CD68陽(yáng)性表達(dá)［7-8］。Mita等［9］的研究顯示，肝內(nèi)過(guò)多表達(dá)的巨噬細(xì)胞在暴發(fā)性肝衰竭患者發(fā)病機(jī)制中會(huì)起到關(guān)鍵性作用。本研究顯示，Regular diet+saline組肝組織較少見(jiàn)CD68標(biāo)記的陽(yáng)性單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，經(jīng)LPS處理后Reyular+diet+LPS組數(shù)量并無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而Synthetic diet+LPS組肝內(nèi)CD68標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯高于Synthetic diet+saline組及Regular diet+LPS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示CD68分子標(biāo)記的肝臟巨噬細(xì)胞在NASH的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了一定的作用。

腫瘤死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）具有促炎活性和免疫調(diào)節(jié)作用，是機(jī)體免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)［10-11］，可由激活的肝臟巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生。革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的主要成分LPS是腸源性?xún)?nèi)毒素的主要成分，是肝臟巨噬細(xì)胞最敏感的活化劑。據(jù)研究報(bào)道TNF-α的高表達(dá)與肝細(xì)胞凋亡具有顯著的相關(guān)性［12］，Kudo等［13］的研究顯示LPS 上調(diào)了TNF-α 在NASH小鼠中的表達(dá)，并表明由TNF-α誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡增多。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Regular diet+LPS組與Regular diet+saline組比較，TNF-α的表達(dá)無(wú)明顯變化，凋亡率也無(wú)明顯差異，而在Synthetic diet+LPS組TNF-α的表達(dá)達(dá)到最大值，同時(shí)凋亡率也升到最高值，與Synthetic diet+saline組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），本研究結(jié)果與Kudo等［13］的研究結(jié)果相一致，并進(jìn)一步證實(shí)了在NASH中LPS會(huì)上調(diào)TNF-α表達(dá)，由TNF-α介導(dǎo)引起的肝細(xì)胞凋亡在NASH大鼠的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。

筆者認(rèn)為在NASH大鼠中，因腸道黏膜屏障受損等原因，腸源性?xún)?nèi)毒素很容易進(jìn)入全身血液循環(huán)，研究結(jié)果顯示，Synthetic diet+LPS組血漿LPS水平與Synthetic diet+saline組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示NASH模型大鼠體內(nèi)形成了LPS血癥。據(jù)Rivera等［14］的研究報(bào)道，在NASH小鼠模型中CD14 mRNA的表達(dá)增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)LPS的敏感性，從而使LPS的生物活性大大增強(qiáng)［15-16］，LPS進(jìn)入血循環(huán)后，其脂質(zhì)A部分與LPS結(jié)合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）形成復(fù)合物，通過(guò)與表達(dá)在巨噬細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，激活單核-巨噬細(xì)胞釋放大量的TNF-α［17］，與表達(dá)在肝細(xì)胞膜的TNF受體結(jié)合導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，并由此介導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡，最終促進(jìn)NASH的發(fā)展。

在對(duì)TNF-α水平的表達(dá)和CD68標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)進(jìn)行Pearson’s相關(guān)性分析后，筆者發(fā)現(xiàn)在NASH中TNF-α的表達(dá)與CD68的表達(dá)呈明顯的正相關(guān)［18-19］，推測(cè)NASH中LPS可激活巨噬細(xì)胞釋放大量TNF-α，從而增強(qiáng)了TNF-α介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡［20-21］，未來(lái)還需要做進(jìn)一步研究來(lái)探討LPS在NASH中的確切機(jī)制，為治療NASH和肝硬化等疾病提供理論依據(jù)。

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Pathogenesis Study of Lipopolysaccharide on High Fat and High Sugar-induced Non-alcoholic

Steatohepatitis in Rats

/WANG Wen-jun，GUO J ian-hong，ZHANG Yang，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（25）：019-023

Objective：To observe liver macrophages，tumor necrosis factor-α（TNF-α） expression of high-sugar high-fat diet-induced non-alcoholic steatohepatitis （NASH） rat and liver changes of cell apoptosis，to explore LPS development mechanism occurs in the rat NASH.Method：SD rats were randomly divided into nine weeks group：Synthetic diet+saline group，Synthetic diet+LPS group，Regular diet+LPS group and Regular diet+saline group.The establishment of five additional weeks group：Synthetic diet group and the Regular diet group，and in the fifth week were sacrificed in order to observe the effects on the liver Synthetic diet.Since the first 6 weeks，the 9 weeks group of rats injected subcutaneously every other day LPS 0.5 mg/kg or the same dose of saline，were killed in the weekend 9 detected in plasma LPS，ALT and TNF-α levels and liver pathology observed，measured liver CD68 expression and the level of apoptosis.Result：The 5 weeks Synthetic diet group had mild liver steatosis.The 9 weeks Synthetic diet+LPS group compared to the control group Synthetic diet+saline group and Regular diet+LPS，plasma LPS、ALT and TNF-α expression levels，CD68 expression and cell apoptosis rate significantly increased，and were statistically significant（P＜0.05）.Synthetic diet+saline group compared to Regular diet+saline group，plasma LPS，ALT and TNF-α significantly increased，with statistical significance（P＜0.05）.CD68 positive expression and TNF-α levels were positively related（r=0.64，P＜0.05）. Conclusion：High-sugar high-fat diet-induced rat model of NASH in vivo formation of endotoxemia，LPS can form “two-hit” to the liver，when CD68 increased expression of TNF-α are also significantly improved，both show significant positive correlation，while apoptosis rate is significantly increased，we infer that LPS can activated macrophages to secrete TNF and induced apoptosis in liver cells，further promote the development of NASH.

Lipopolysaccharide； Non-alcoholic steatohepatitis； Macrophage； Tumor necrosis factor-α； Apoptosis

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.25.006

2016-04-26） （本文編輯：蔡元元）

山西省基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（2013011054-2）

①山西醫(yī)科大學(xué) 山西 太原 030001

郭建紅

First-author’s address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China