郭天芳, 王 璞, 陳保文, 王國(guó)治, 羅永艾, 徐 苗, 沈小兵, 蘇 城
·論著·
莢膜組織胞漿菌病診斷及與結(jié)核病鑒別診斷方法的實(shí)驗(yàn)研究
郭天芳1, 王 璞2, 陳保文3, 王國(guó)治3, 羅永艾2, 徐 苗3, 沈小兵3, 蘇 城3
目的 探討莢膜組織胞漿菌病(HP)診斷及其與結(jié)核病鑒別診斷的方法。方法 提取莢膜組織胞漿菌素純蛋白衍生物(P-HTPM),以P-HTPM、莢膜組織胞漿菌素國(guó)外參考品和結(jié)核菌素純蛋白衍生物(TB-PPD)為研究試劑,以莢膜組織胞漿菌和結(jié)核分枝桿菌免疫的豚鼠和小鼠及其血清為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用皮膚試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、膠體金免疫層析試驗(yàn)(GICA) 3種方法進(jìn)行HP診斷及與結(jié)核病鑒別診斷的研究。結(jié)果 成功提取P-HTPM,蛋白純度為85.8%;P-HTPM與國(guó)外參考品的皮膚反應(yīng)結(jié)果一致(P>0.05),1 mg/L 的P-HTPM與國(guó)外參考品等效,P-HTPM與TB-PPD對(duì)致敏豚鼠皮膚試驗(yàn)無(wú)交叉反應(yīng);包被P-HTPM的ELISA檢測(cè)小鼠抗莢膜組織胞漿菌血清全為陽(yáng)性,檢測(cè)抗結(jié)核分枝桿菌血清和正常小鼠血清結(jié)果均為陰性(P< 0.01);以P-HTPM抗原為檢測(cè)線的GICA試紙條檢測(cè)小鼠抗莢膜組織胞漿菌血清靈敏度為100%(14/14),特異度為93.8%(15/16)。結(jié)論 以P-HTPM為抗原的動(dòng)物皮膚試驗(yàn)、ELISA和GICA對(duì)HP的診斷及其與結(jié)核病的鑒別診斷有重要價(jià)值。
莢膜組織胞漿菌??; 結(jié)核病; 診斷與鑒別診斷
莢膜組織胞漿菌?。℉istoplasmosis,HP)是一種世界范圍內(nèi)流行的傳染性系統(tǒng)性真菌病,可引起肺部和全身感染,臨床表現(xiàn)無(wú)特異性,誤診率高,尤其是慢性肺型HP與肺結(jié)核病在臨床表現(xiàn)和X線表現(xiàn)上都很相似。我國(guó)為結(jié)核病高發(fā)國(guó),痰菌陰性結(jié)核越來(lái)越多,國(guó)內(nèi)也有關(guān)于莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)感染致肺型HP誤診為肺結(jié)核的臨床病例報(bào)道。加強(qiáng)對(duì)HP診斷及其與結(jié)核病鑒別診斷方法的研究成為必要。最近,中國(guó)食品藥品檢定研究院成功研制出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的莢膜組織胞漿菌素純蛋白衍生物(purified protein derivative of histoplasmin,P-HTPM),本研究以該P(yáng)-HTPM為基礎(chǔ),分別采用皮膚試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和膠體金免疫層析試驗(yàn)(GICA),對(duì)HP進(jìn)行診斷方法的系統(tǒng)研究以及其與結(jié)核病的鑒別診斷研究。
1.1 材料
莢膜組織胞漿菌:購(gòu)自美國(guó)組織培養(yǎng)物保藏所(ATCC),編號(hào)12700;莢膜組織胞漿菌素(Histoplasmin, HIMN)國(guó)外參考品(以下簡(jiǎn)稱“ 國(guó)外參考品”): 1∶100稀釋液(Histoplasmin,Diluted),美國(guó)PARK-DAV公司生產(chǎn);結(jié)核菌素純蛋白衍生物(TB-PPD):批號(hào)990624,北京祥瑞生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn);兔IgG(10 g/L):購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司;葡萄球菌蛋白A(SPA):由上海奧普生物醫(yī)藥有限公司贈(zèng)與。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:Balb/C小鼠,8~10周齡,雌性;白色雌性豚鼠,體重400~600 g/只,均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
1.2 方法
1.2.1 P-HTPM提純 將莢膜組織胞漿菌菌種接種于葡萄糖甘油液體培養(yǎng)基25 ℃靜置培養(yǎng)8周以上。培養(yǎng)物經(jīng)高壓滅菌后離心除去菌體,收集培養(yǎng)濾液,參考胞內(nèi)分枝桿菌變態(tài)反應(yīng)原提取方法發(fā)明專利技術(shù)[1],采用三氯醋酸和硫酸銨沉淀法進(jìn)行提純,再經(jīng)透析、過(guò)濾除菌,即為P-HTPM母液,經(jīng)蛋白質(zhì)含量測(cè)定后將母液稀釋至1 g/L,為本研究中所用P-HTPM原液,分裝,4 ℃保存。按2005年版《中華人民共和國(guó)藥典·三部》進(jìn)行蛋白純度,即蛋白含量/(蛋白+多糖+核酸總含量)測(cè)定。
1.2.2 豚鼠皮膚試驗(yàn) ①比較P-HTPM與國(guó)外參考品對(duì)致敏豚鼠皮膚反應(yīng)的效價(jià)。將P-HTPM原液稀釋成1、 2、 4、 8 mg/L,作為皮膚變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)樣品,國(guó)外參考品作為陽(yáng)性對(duì)照。經(jīng)莢膜組織胞漿菌致敏的豚鼠6只,每只豚鼠皮內(nèi)注射上述5個(gè)樣品各0.2 mL,去毛后以輪圈法注射于豚鼠背部?jī)蓚?cè)。記錄48 h皮膚局部硬結(jié)直徑大小,皮試結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):局部硬結(jié)直徑≥5 mm判為陽(yáng)性。計(jì)算硬結(jié)平均值。②P-HTPM與TB-PPD對(duì)致敏豚鼠的皮膚反應(yīng)以17只結(jié)核分枝桿菌致敏豚鼠和12只莢膜組織胞漿菌致敏豚鼠為試驗(yàn)對(duì)象,5只正常豚鼠為空白對(duì)照。每只豚鼠皮內(nèi)注射國(guó)外參考品、 P-HTPM(1 mg/L)及TB-PPD(50 U/mL)各0.2 mL。記錄48 h皮膚局部硬結(jié)直徑,結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)同1.2.2①,計(jì)算硬結(jié)直徑平均值,了解兩種變態(tài)反應(yīng)原對(duì)機(jī)體有無(wú)皮膚交叉反應(yīng)。
1.2.3 ELISA檢測(cè)小鼠免疫血清抗體 ①ELISA檢測(cè)小鼠莢膜組織胞漿菌免疫血清抗體方法的建立。用結(jié)核分枝桿菌和莢膜組織胞漿菌菌體抗原分別免疫小鼠,每2周1次,共2~4次,制備小鼠莢膜組織胞漿菌和結(jié)核分枝桿菌免疫血清。以P-HTPM為包被抗原,采用方陣滴定法,梯度稀釋P-HTPM為40、 20、 10、 5 mg/L的溶液,分別包被96孔板(100 μL/孔);稀釋小鼠莢膜組織胞漿菌免疫血清為1∶100、1∶1 000、1∶10 000待檢樣品,加入不同抗原濃度包被的96孔板(100 μL/孔),自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光密度(D)值,確定抗原抗體最適工作濃度。判斷標(biāo)準(zhǔn):D值≤2.1倍陰性血清D值判為陰性;D值>2.1倍陰性血清D值判為陽(yáng)性。②包被P-HTPM與TB-PPD抗原檢測(cè)免疫血清效價(jià)。分別包被最適劑量的P-HTPM和TBPPD,以正常小鼠血清為陰性對(duì)照,用ELISA檢測(cè)13份小鼠結(jié)核分枝桿菌免疫血清和8份莢膜組織胞漿菌免疫血清的效價(jià),觀察有無(wú)交叉反應(yīng)。結(jié)果判斷同1.2.3①。
1.2.4 GICA檢測(cè)小鼠免疫血清抗體 ①GICA檢測(cè)小鼠莢膜組織胞漿菌免疫血清抗體方法的建立。首先制備膠體金,再用10 mg/L SPA在弱酸下致敏膠體金形成免疫膠體金復(fù)合物,制備好檢測(cè)時(shí)需用的免疫膠體金。用自動(dòng)噴膜機(jī)在硝酸纖維素膜(NC,Millipore公司)上噴P-HTPM抗原作為檢測(cè)線(T線),噴4 g/L兔IgG作為質(zhì)控線(C線)。分別噴膜1、 2、 5 g/L(均含2% BSA)的P-HTPM以確定抗原最適劑量。將上述NC膜配以玻璃纖維,組裝切割制備層析法試紙條。檢測(cè)時(shí)在試紙條上先后滴加小鼠莢膜組織胞漿菌免疫血清和免疫膠體金, 20 min內(nèi)觀察結(jié)果。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):T線和C線均呈現(xiàn)紅色為陽(yáng)性;只有C線呈紅色為陰性,只有T線呈紅色則結(jié)果不可靠,需重新檢測(cè)。②GICA檢測(cè)14份小鼠莢膜組織胞漿菌免疫血清。制備最適抗原量的免疫層析試紙條,檢測(cè)免疫血清中抗體。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)同 1.2.4①。③GICA檢測(cè)16份小鼠結(jié)核分枝桿菌免疫血清,用 1.2.4②中的試紙條檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌免疫血清,結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)同 1.2.4①。
1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Minitab軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩組間的比較用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 P-HTPM原液蛋白純度
用Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量為0.97 g/L、蒽酮法測(cè)定多糖含量為0.15 g/L、紫外分光光度法測(cè)定核酸含量為0.01 g/L,計(jì)算蛋白純度為85.8 %。
2.2 P-HTPM效價(jià)
與國(guó)外參考品皮膚反應(yīng)的效價(jià)比較:P-HTPM對(duì)莢膜組織胞漿菌致敏豚鼠皮膚試驗(yàn)均呈陽(yáng)性反應(yīng),1、 2、 4、 8 mg/L的 P-HTPM及國(guó)外參考品硬結(jié)平均直徑分別為(9.8±0.2)、(10.2±0.2)、(11.5±0.3)、(12.5±0.3)、(9.9±0.2) mm,P-HTPM與國(guó)外參考品皮膚反應(yīng)結(jié)果一致(P>0.05),其中1 mg/L 的P-HTPM與國(guó)外參考品等效。
2.3 P -HTPM與TB-PPD的皮膚交叉反應(yīng)情況
P-HTPM對(duì)莢膜組織胞漿菌致敏豚鼠皮膚反應(yīng)均為陽(yáng)性,硬結(jié)平均值為(10.6±0.2)mm,對(duì)結(jié)核分枝桿菌致敏豚鼠皮膚反應(yīng)均為陰性,兩者比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);TB-PPD對(duì)莢膜組織胞漿菌致敏豚鼠皮膚反應(yīng)均為陰性,對(duì)結(jié)核分枝桿菌致敏豚鼠皮膚反應(yīng)均為陽(yáng)性,硬結(jié)平均直徑(12.7±0.5)mm,兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示P-HTPM與TB-PPD這兩種變態(tài)反應(yīng)原皮膚試驗(yàn)無(wú)交叉反應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 P-HTPM與TB-PPD變態(tài)反應(yīng)原對(duì)豚鼠的皮膚反應(yīng)(硬結(jié))Table 1 The skin reaction in guinea pigs using purified protein derivative of histoplasmin and tuberculin purified protein derivative as allergen [diameter of induration, mm (%)]
2.4 ELISA方法檢測(cè)血清抗體
①P-HTPM和血清最適工作濃度為10 mg/L、1∶1 000。②分別包被P-HTPM和TB-PPD的ELISA檢測(cè)小鼠免疫血清中抗體,無(wú)交叉反應(yīng)出現(xiàn),結(jié)果見(jiàn)表2。 P-HTPM檢測(cè)8份小鼠莢膜組織胞漿菌免疫血清全部為陽(yáng)性,D值為0.993 ± 0.216,檢測(cè)13份小鼠結(jié)核分枝桿菌免疫血清和8份正常血清全為陰性,P<0.01;TB-PPD檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌免疫D值為1.606 ± 0.263,而檢測(cè)莢膜組織胞漿菌免疫血清結(jié)果全為陰性,P<0.01。③PHTPM包被的ELISA檢測(cè)小鼠血清莢膜組織胞漿菌抗體,靈敏度8/8,特異度100 %(13/13)。
2.5 GICA檢測(cè)血清抗體
①分別用在T線處噴膜1、 2、 5 g/L的P-HTPM制備的試紙條檢測(cè)莢膜組織胞漿菌免疫血清時(shí),3種試紙條的T線和C線均呈現(xiàn)紅色,全部檢出結(jié)果為陽(yáng)性。T線顏色隨噴膜抗原濃度的增加而加深,但三者間肉眼觀察無(wú)顯著差別,弱陽(yáng)性標(biāo)本用1 g/L試紙條檢測(cè)時(shí)呈色相對(duì)較弱,故選擇2 g/L為最適噴膜抗原濃度。②噴2 g/L的P-HTPM為T線的試紙條檢測(cè)14份小鼠莢膜組織胞漿菌免疫血清結(jié)果,見(jiàn)圖1,全部血清標(biāo)本結(jié)果均為陽(yáng)性,靈敏度100 %(14/14)。T線呈色的強(qiáng)弱與抗體效價(jià)高低呈正相關(guān),與ELISA檢測(cè)結(jié)果相一致,D值越大的血清標(biāo)本呈色越明顯。用該試紙條檢測(cè)16份小鼠結(jié)核分枝桿菌免疫血清結(jié)果,見(jiàn)圖2,其中15份為陰性,1份為陽(yáng)性,特異度93.8 %(15/16);檢測(cè)8份正常小鼠血清,結(jié)果全為陰性。
表2 P-HTPM和TB-PPD為包被抗原ELISA檢測(cè)血清效價(jià)(D值)Table 2 Antibody titer in ELISA detection of antibodies to P-HTPM-coated and TB-PPD-coated antigen (D value )
圖1 GICA試紙條檢測(cè)14份小鼠抗莢膜組織胞漿菌血清結(jié)果Figure 1 Results of gold immunochromatography assay for antibodies to Histoplasma capsulatum in the sera of 14 mice
圖2 GICA試紙條檢測(cè)16份小鼠抗結(jié)核分枝桿菌血清結(jié)果Figure 2 Results of gold immunochromatography assay for antibodies to Mycobacterium tuberculosis in the sera of 16 mice
約95 % HP為無(wú)癥狀型, HP在我國(guó)的高漏診率和高誤診率應(yīng)當(dāng)引起臨床醫(yī)務(wù)人員的高度重視。HP確診依據(jù)為真菌的培養(yǎng)分離,但至少需4個(gè)月,且陽(yáng)性率低[2]。國(guó)外發(fā)展了一些如ELISA、PCR等比較快速的輔助診斷方法,國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)到關(guān)于HP診斷的系統(tǒng)研究的報(bào)道。根據(jù)機(jī)體抗真菌免疫作用與分枝桿菌相似,均可引起細(xì)胞免疫和體液免疫這一理論,我們?cè)谧灾餮兄频腜-HTPM的基礎(chǔ)上,開(kāi)展了皮膚試驗(yàn)、ELISA及GICA檢測(cè)血清抗體等多種方法對(duì)HP的診斷及其與結(jié)核病的鑒別診斷進(jìn)行探索。
目前,在HP診斷中使用最廣泛、時(shí)間最長(zhǎng)的國(guó)外皮膚反應(yīng)制品為HMIN,是由莢膜組織胞漿菌培養(yǎng)物經(jīng)洗滌、振蕩和過(guò)濾所得的濾液制品,類似于舊結(jié)核菌素(OT)[3]。該HMIN未以化學(xué)方法提純,含培養(yǎng)基成分且菌體雜質(zhì)較高,容易引起非特異性反應(yīng)及不良反應(yīng),無(wú)法以化學(xué)定量法測(cè)定有效物質(zhì)含量,量效關(guān)系難以確定,其靈敏度與特異度均不理想。我們用化學(xué)方法成功研制出P-HTPM,其蛋白純度高達(dá)85.8 %,豚鼠皮膚試驗(yàn)顯示其1 g/L劑量與國(guó)外參考品所誘導(dǎo)的機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)等效,P-HTPM和TB-PPD對(duì)致敏豚鼠無(wú)皮膚交叉反應(yīng),其檢測(cè)靈敏度為100 %,特異度為100 %。P-HTPM的成功研制有望成為診斷人體莢膜組織胞漿菌感染與HP的體內(nèi)診斷試劑,為HP大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查和診斷技術(shù)的研究奠定了基礎(chǔ);P-HTPM和TB-PPD同時(shí)使用時(shí),具有鑒別HP和結(jié)核分枝桿菌感染及結(jié)核病的重要價(jià)值。
近年來(lái),國(guó)外研究報(bào)道用于診斷HP的ELISA包被抗原主要有3種[4]:HMIN、pHMIN(純化莢膜組織胞漿菌素)和ptHMIN(處理后的純化莢膜組織胞漿菌素)。P-HTPM制備方法與HMIN國(guó)外參考品不同,主要成份為蛋白質(zhì)(85.8 %),另含少許多糖(13.3 %)和核酸(0.9 %)。以P-HTPM為包被抗原的ELISA檢測(cè)小鼠結(jié)核分枝桿菌免疫血清無(wú)一例陽(yáng)性結(jié)果(0/13);而用HMIN作包被抗原的ELISA檢測(cè)結(jié)核患者血清時(shí),出現(xiàn)29 %陽(yáng)性結(jié)果[5],這可能與HMIN蛋白純度低,含多糖較多,其多糖抗原決定族與結(jié)核分枝桿菌發(fā)生交叉反應(yīng)有關(guān)。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,以p-HTPM及pt-HTPM為抗原的ELISA檢測(cè)血清中莢膜組織胞漿菌抗體,特異度為100 %,且其靈敏度也較HMIN提高[6],可能成為HP與結(jié)核病一種有效的診斷和鑒別診斷方法。
免疫膠體金技術(shù)是一種以膠體金為示蹤標(biāo)志物的新型免疫標(biāo)記技術(shù),可用于抗原抗體檢測(cè),它克服了ELISA的步驟繁瑣及時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn),具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn),在各種生物學(xué)研究中廣泛應(yīng)用[7-10],目前應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的主要有2種方法: GICA和滲濾法。本研究采用GICA,在T線處噴P-HTPM為抗原檢測(cè)血清抗體,我們?cè)趪娔た乖瓡r(shí)加入2 % BSA,封閉T線處NC膜上未被抗原結(jié)合的空白位,從而減少非特異性反應(yīng)。制備免疫膠體金時(shí)常選擇蛋白質(zhì)和其他生物大分子如SPA、PHA、ConA等與膠體金結(jié)合,因SPA能與人、小鼠、豚鼠、家兔和狗等多種動(dòng)物來(lái)源IgG的Fc段相結(jié)合,將血清中的抗體隨膠體金流動(dòng)帶至T線和C線處呈色或(和)不呈色,適用于多種物種來(lái)源的血清檢測(cè),故我們選擇SPA來(lái)標(biāo)記膠體金。免疫膠體金試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性主要依賴于噴膜抗原的特異性,其次是盡量減少非特異性反應(yīng)引起的假陽(yáng)性,本試驗(yàn)特異度為93.8 %,較ELISA方法低,說(shuō)明噴膜抗原有待于進(jìn)一步純化及進(jìn)一步采取減少非特異性反應(yīng)的措施。
以上3種試驗(yàn)診斷方法僅僅是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果,初步顯示出對(duì)HP診斷及結(jié)核病鑒別診斷的價(jià)值。關(guān)于P-HTPM應(yīng)用于人體皮膚試驗(yàn)臨床研究已獲國(guó)家藥監(jiān)局批文,我們將進(jìn)行相關(guān)臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證上述方法的有效性和可行性。
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Experimental study on the diagnosis of histoplasmosis and its differential diagnosis with tuberculosis
GUO Tianfang, WANG Pu, CHEN Baowen, WANG Guozhi, LUO Yongai, XU Miao, SHEN Xiaobing, SU Cheng. (Department of Respiratory Diseases, Jinan Central Hospital, Jinan 250013, China)
Objective To evaluate and compare the utility of several methods for diagnosis of histoplasmosis and its differential diagnosis with tuberculosis. Methods Purified protein derivative of histoplasmin (P-HTPM) was prepared. We developed a skin test in immunized guinea pigs using P-HTPM as allergen to detect the skin reaction, comparing with the reference histoplasmin made in the US and tuberculin purified protein derivative (TB-PPD). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed for detection of anti-Histoplasma antibodies to P-HTPM in the sera of immunized mice. We developed a colloidal gold immunochromatography assay (GICA)to detect anti-Histoplasma antibodies to P-HTPM in the same sera. Results P-HTPM was extracted successfully, the purity of which was 85.8%. P-HTPM at 1 mg/L was equivalent to the reference histoplasmin in inducing the same skin reaction in immunonized guinea pigs (P > 0.05), while P-HTPM did not induce cross reaction with TB-PPD. ELISA showed that all the sera from the mice immunized with Histoplasma had positive reaction to P-HTPM but negative to TB-PPD, and also negative in the sera of normal control mice (P< 0.01). The sensitivity of GICA test strip was 100% (14/14)in detecting the antibodies to P-HTPM antigen in the sera from the mice immunized with Histoplasma. The specificity of the method was 93.8% (15/16). Conclusions P-HTPM-based skin test in animals, ELISA and GICA are useful in the diagnosis of histoplasmosis and its differential diagnosis with tuberculosis.
histoplasmosis; tuberculosis; diagnosis and differential diagnosis
R519.8
A
1009-7708(2016)02-0200-05
10.16718/j.1009-7708.2016.02.013
2015-04-26
2015-09-01
國(guó)家“863”項(xiàng)目(2004AA2Z3452)。
1. 濟(jì)南市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科 ,濟(jì)南 250013。
2. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院;
3. 中國(guó)食品藥品檢定研究院菌苗室。
郭天芳(1989—),女,碩士,住院醫(yī)師,主要從事呼吸道感染性疾病的研究。
王璞,E-mail:miss_miao@163.com。