李盡哲，黃雅琴,2，葉兆偉

(1.信陽農(nóng)林學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，河南 信陽 464000； 2.鄭州大學(xué), 河南省離子束生物工程重點(diǎn)實驗室，河南 鄭州 450052)

蛹蟲草對紫外輻照果蠅子代生長發(fā)育的影響

李盡哲1，黃雅琴1,2，葉兆偉1

(1.信陽農(nóng)林學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，河南 信陽 464000； 2.鄭州大學(xué), 河南省離子束生物工程重點(diǎn)實驗室，河南 鄭州 450052)

為了研究蛹蟲草對果蠅的紫外輻照保護(hù)作用，以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛹蟲草人工飼料飼養(yǎng)經(jīng)不同時間紫外輻照的果蠅，觀察統(tǒng)計其子代的生長發(fā)育期及發(fā)育特征。研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2 %的人工飼料能有效縮短紫外輻照果蠅子代的全發(fā)育周期(P<0.01)，該人工飼料也能使紫外輻照40 min果蠅的子代性別比和畸變率均降低(P<0.01)、體長增加(P<0.05)、飛翔率升高(P<0.05)。蛹蟲草粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4 %的人工飼料不僅能使紫外輻照40 min果蠅的子代全發(fā)育周期縮短(P<0.01)，還能使紫外輻照20 min果蠅的子代的性別比和畸變率均降低(P<0.01)、體長增加(P<0.01)。由此可見，適宜質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛹蟲草粉能夠修復(fù)輻照損傷，對機(jī)體起到抗紫外保護(hù)作用。

蛹蟲草；紫外輻照；果蠅；生長發(fā)育期；子代發(fā)育

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)為子囊菌門(Ascomycota)、核菌綱(Pyrenomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、麥角菌科(Ciavieps purpurea (Fr.)Tul.)、蟲草屬(Cordyceps)的模式種，又名北冬蟲夏草、北蟲草等。它含有大量的蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖[1]，是國際醫(yī)學(xué)公認(rèn)的人體免疫增強(qiáng)劑，能提高肝臟解毒能力，還能清除自由基、擴(kuò)張血管、消除黃褐斑，抗衰防皺[2]?，F(xiàn)有的眾多研究也表明，多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗輻射、抗突變、抗衰老等多種藥理作用，多糖正作為一種天然有效的輻射防護(hù)劑被人們所關(guān)注[3]。

紫外線是一種由原子的外層電子受到激發(fā)后產(chǎn)生的電磁波，過量的紫外線照射能夠誘發(fā)白內(nèi)障，使皮膚老化粗糙[4-8]。已有研究表明，紫外線能對亞油酸[9]、脂質(zhì)體[10]、小白鼠血液免疫酶[11]、家兔皮膚[12]產(chǎn)生氧化性損傷。在真菌中，前人已研究過灰樹花[13]、香菇[14]、靈芝[15]、肉色迷孔菌[16]、銀耳[17]、滑子菇[18]的抗輻射保護(hù)作用，對于蛹蟲草，前人只做過體外抗氧化分析[19-20]和小鼠的抗氧化酶活性研究[21]，然而，將蛹蟲草作為抗輻射保護(hù)劑的開發(fā)探索，目前在國內(nèi)還是空白，它能否抗紫外線輻射以及抗輻射效果如何都有待探索。果蠅(Drosophilamelanogaster)因其生活史短、易飼養(yǎng)、繁殖快、染色體少、突變型多，而成為一種模式生物，其許多代謝途徑、生理學(xué)功能和發(fā)育階段同哺乳動物基本相似，因此利用果蠅來進(jìn)行抗輻射研究將對該領(lǐng)域有重要的理論和應(yīng)用意義。本試驗研究了蛹蟲草對輻射處理后的果蠅子代生長發(fā)育周期、性別比、體長、飛翔率、畸變率的影響，旨在為蛹蟲草作為輻射保護(hù)劑的開發(fā)利用提供科學(xué)的參考。

1 材料與方法

1.1材料

野生型果蠅(Drosophilamelanogaster)由信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)教研室提供。蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)采自信陽農(nóng)林學(xué)院應(yīng)用真菌實訓(xùn)基地。樣品的制備：將蛹蟲草40 ℃烘12 h至恒重，粉碎后過篩備用。

試劑：乙醇(99 %)、瓊脂粉、蔗糖、丙酸、酵母粉、乙醚，試劑均為國產(chǎn)分析純。

儀器：紫外透射反射儀(上?？等A生化儀器制造有限公司ZF系列)、電子天平、恒溫干燥箱、DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、電爐、燒杯等。

1.2方法

基本人工飼料按照每100 mL蒸餾水中添加玉米粉11.2 g、蔗糖8.9 g、瓊脂1.0 g、丙酸0.8 mL、干酵母粉1.0 g的比例配制。設(shè)基本人工飼料為對照(CK)，在CK的基礎(chǔ)上配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛹蟲草處理人工飼料，使蛹蟲草粉終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.2%、0.4%，分別命名為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ。收集8 h內(nèi)羽化的未交配的果蠅，乙醚麻醉后區(qū)分雌雄，分開培養(yǎng)，3 d后進(jìn)行紫外輻照。紫外透射反射儀的波長為302 nm，輻照根據(jù)時間長短分0、20、40 min共3個劑量，不分強(qiáng)度，然后轉(zhuǎn)移到基本人工飼料和3個處理人工飼料中，先在培養(yǎng)箱中(25±1) ℃暗培養(yǎng)48 h，再在光照培養(yǎng)箱(溫度為(25±1) ℃、自然光照、相對濕度50%～70%)中培養(yǎng)，3 d后放飛親本，觀察記錄子代果蠅從產(chǎn)卵到羽化成蠅，每一生長階段所經(jīng)歷的時間。卵期指從培養(yǎng)基表面出現(xiàn)卵到觀察有1齡幼蟲止的時間段；幼蟲期指從出現(xiàn)1齡幼蟲到出現(xiàn)蛹的時間段；蛹期指從出現(xiàn)蛹到出現(xiàn)成蠅的時間段；羽化期指從出現(xiàn)第1只成蠅到不再有成蠅羽化出所經(jīng)歷的時間段；全發(fā)育周期指從培養(yǎng)基表面出現(xiàn)卵到不再有成蠅羽化出所經(jīng)歷的時間段。收集子代果蠅，麻醉后在顯微鏡下觀察其表型，統(tǒng)計其體長、性別比和畸變率。蘇醒后繼續(xù)培養(yǎng)，飼養(yǎng)40 d后，在室外逐個放飛，凡能起飛的，計入“可飛翔”組內(nèi)，計算各組飛翔比率。所有試驗均重復(fù)3次，結(jié)果用SPSS 13.0數(shù)據(jù)處理軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行T-test，分析差異顯著性(0.001≤P<0.01表明差異極顯著；0.01≤P<0.05表明差異顯著；P>0.05表明無顯著差異)。

2 結(jié)果與分析

2.1蛹蟲草對紫外輻照果蠅子代發(fā)育期的影響

觀察果蠅經(jīng)紫外輻照后在蛹蟲草人工飼料上產(chǎn)下的子一代的生長發(fā)育周期，結(jié)果如圖1～圖3所示。由圖1可見，將未經(jīng)過紫外輻照的果蠅飼養(yǎng)在Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 3種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛹蟲草人工飼料上，人工飼料Ⅰ上的子代僅卵期延長，幼蟲期、蛹期、羽化期和全發(fā)育周期均縮短，其中與CK相比，全發(fā)育周期縮短1.16 d (P<0.01)；人工飼料Ⅱ上的子代卵期、幼蟲期和全發(fā)育周期縮短，蛹期和羽化期延長，其中與CK相比，卵期縮短0.4 d(P<0.01)，全發(fā)育周期縮短0.92 d(P<0.05)；人工飼料Ⅲ上的子代卵期、羽化期和全發(fā)育周期縮短，幼蟲期和蛹期延長，其中與CK相比，卵期和羽化期分別縮短0.36、0.56 d(P<0.01)，蛹期延長0.31 d(P<0.05)。

發(fā)育期12 h以下計為0.5 d，12 h以上記為1 d。每一生長階段均為各個處理人工飼料與相應(yīng)的基本人工飼料進(jìn)行T-test。 “*”表示差異顯著(P<0.05); “**”表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

The growth stage under 12 h,was marked as 0.5 d, and above 12 h,was marked as 1 d.The T-test was conducted between each treated artificial feed and corresponding basic artificial feed samples in each growth stage.“*”indicated significant difference (P<0.05);“**”showed extremely remarkable difference(P<0.01).The same as below.

圖1蛹蟲草對未輻照果蠅子代發(fā)育期的影響
Fig.1CordycepsmilitariseffectonDrosophilaoffspringgrowthstageswithoutUVradiation

由圖2可見，將經(jīng)過紫外輻照20 min的果蠅飼養(yǎng)在基本人工飼料上，其子代的各個發(fā)育期均延長，與未輻照基本人工飼料相比，卵期、幼蟲期和羽化期分別延長0.29、0.56、0.52 d(P<0.05)，蛹期和全發(fā)育周期分別延長0.64、1.52 d(P<0.01)。將經(jīng)過紫外輻照20 min的果蠅飼養(yǎng)在Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 3種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛹蟲草人工飼料上，與雖輻照20 min卻飼養(yǎng)在基本人工飼料上相比，每種人工飼料上的子代其卵期、幼蟲期、蛹期、羽化期和全發(fā)育周期均縮短，人工飼料Ⅱ上的子代發(fā)育期縮短最明顯，其中卵期、幼蟲期和全發(fā)育周期分別縮短0.36、0.57、2.35 d(P<0.01)。

每一生長階段的基本人工飼料均與圖1中相應(yīng)的基本人工飼料進(jìn)行T-test。下同。

The T-test was conducted between basic artificial feed samples of each growth stage and corresponding basic artificial feed samples in FIG.1.The same as below.

圖2蛹蟲草對紫外輻照20min果蠅子代發(fā)育期的影響
Fig.2CordycepsmilitariseffectonDrosophilaoffspringgrowthstagesafter20minUVradiation

由圖3可見，將經(jīng)過紫外輻照40 min的果蠅飼養(yǎng)在基本人工飼料上，其子代的各個發(fā)育期也均延長，與未輻照基本人工飼料相比，卵期、幼蟲期和全發(fā)育周期分別延長1.27、1.52、3.42 d(P<0.01)，蛹期延長0.52 d(P<0.05)。將經(jīng)過紫外輻照40 min的果蠅飼養(yǎng)在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛹蟲草人工飼料上，與雖輻照40 min卻飼養(yǎng)在基本人工飼料上相比，人工飼料Ⅱ和Ⅲ上的子代其全發(fā)育周期分別縮短2.09、2.31 d(P<0.01)。值得注意的是，3種人工飼料上的子代其幼蟲期均延長，人工飼料Ⅱ和Ⅲ分別延長1.1、1.45 d (P<0.01)。在觀察中還發(fā)現(xiàn)，這2組試驗，幼蟲生長緩慢，有的能順利進(jìn)入蛹期，有的死亡，因此，雖然順利完成一個正常生長發(fā)育周期的子代全發(fā)育周期比對照短，但是子代生成量卻比對照少。

可見，紫外輻照延長了果蠅子代生長發(fā)育期。利用蛹蟲草培養(yǎng)紫外輻照果蠅，子代生長發(fā)育期縮短，這可能是因為蛹蟲草能夠提高機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶活性，修復(fù)短時間輻射所產(chǎn)生的氧化損傷，而長時間的紫外輻照產(chǎn)生的遺傳損傷較大較多，蛹蟲草對這些損傷的修復(fù)能力弱，才出現(xiàn)幼蟲期延長，子代生成量少的情況。

圖3 蛹蟲草對紫外輻照40 min果蠅子代發(fā)育期的影響Fig.3 Cordyceps militaris effect on Drosophila offspring growth stages after 40min UV radiation

2.2蛹蟲草對紫外輻照果蠅子代生長發(fā)育特征的影響

觀察果蠅子代的性別比、體長、飛翔率和畸變率等生長發(fā)育特征，結(jié)果如表1所示。由表1可見，將經(jīng)過紫外輻照20 min和40 min的果蠅飼養(yǎng)在基本人工飼料上，子代均出現(xiàn)性別比升高、體長減少、飛翔率降低、畸變率升高的現(xiàn)象。與CK相比，輻照40 min的果蠅在這4項指標(biāo)上均差異達(dá)極顯著性水平，畸變率高達(dá)5.87 %。

表1 蛹蟲草對紫外輻照果蠅子代生長發(fā)育特征的影響Table 1 Cordyceps militaris effect on Drosophila offspring growth characteristics after UV radiation

注：*表示差異顯著(P<0.05); **表示差異極顯著(P<0.01)。

Note: *indicates significant difference (P<0.05);**shows extremely remarkable difference(P<0.01).

將未經(jīng)過紫外輻照的果蠅飼養(yǎng)在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛹蟲草人工飼料上，3種人工飼料上的子代均出現(xiàn)性別比降低、飛翔率升高的現(xiàn)象。與CK相比，人工飼料Ⅱ上的子代性別比和體長差異達(dá)顯著性水平，飛翔率增加19.8 %(P<0.01)，畸變率降低0.47 %(P<0.01)。

將經(jīng)過紫外輻照20 min的果蠅飼養(yǎng)在3種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛹蟲草人工飼料上，與雖輻照20 min卻飼養(yǎng)在基本人工飼料上相比，每種人工飼料上的子代均出現(xiàn)性別比降低、體長增加、畸變率降低的現(xiàn)象。人工飼料Ⅲ上的子代除了飛翔率差異不顯著，其他均差異極顯著(P<0.01)。

將經(jīng)過紫外輻照40 min的果蠅飼養(yǎng)在3種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛹蟲草人工飼料上，與雖輻照40 min卻飼養(yǎng)在基本人工飼料上相比，每種人工飼料上的子代均出現(xiàn)性別比降低、飛翔率升高、畸變率降低的現(xiàn)象。人工飼料Ⅱ上的子代性別比和畸變率分別降低0.43%、1.64 % (P<0.01)，體長和飛翔率分別增加0.12 mm 、8.2 %(P<0.05)。

由此可見，紫外輻照干擾了果蠅子代正常的生長發(fā)育；利用蛹蟲草培養(yǎng)紫外輻照果蠅，緩解了紫外輻照對子代果蠅的輻射毒性，證明了蛹蟲草的抗輻射功能。

3 討論

關(guān)于紫外線對果蠅的輻射生物學(xué)效應(yīng)，前人已經(jīng)做過許多相關(guān)的研究試驗，結(jié)果表明，紫外線輻照處理后果蠅的子代生長發(fā)育受到了抑制[22-23]，F(xiàn)1代出現(xiàn)畸形個體。本研究利用紫外線對果蠅分別照射20和40 min，結(jié)果表明，果蠅子代的生長發(fā)育期延長，性別比升高、體長減少、飛翔率降低、畸變率升高。這一結(jié)論和前人的研究是一致的。在本研究中，將未經(jīng)紫外輻照的果蠅在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛹蟲草人工飼料中培養(yǎng)，子代的全發(fā)育期縮短、性別比降低、飛翔率升高，以人工飼料Ⅱ效果顯著。該結(jié)果是對前人[24]研究的蛹蟲草延壽作用的一個補(bǔ)充。

分別將紫外輻照20 min和40 min的果蠅在蛹蟲草人工飼料中培養(yǎng)，一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛹蟲草人工飼料能夠縮短子代生長發(fā)育期，降低性別比、增加體長、升高飛翔率、降低畸變率。修復(fù)不同劑量的紫外輻照產(chǎn)生的損傷所需要的最佳蛹蟲草人工飼料濃度不同，但低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛹蟲草人工飼料效果差，提高蛹蟲草的質(zhì)量分?jǐn)?shù)才能起到抗輻射保護(hù)作用。同時研究發(fā)現(xiàn)，對短時間的紫外輻照，蛹蟲草的保護(hù)作用明顯，這說明適宜的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛹蟲草粉能夠修復(fù)短時間內(nèi)產(chǎn)生的輻照損傷，對生物體起到抗紫外保護(hù)作用。然而，長時間的紫外輻照，機(jī)體產(chǎn)生大量的氧化自由基，破壞了機(jī)體自身的抗氧化修復(fù)酶系統(tǒng)，蛹蟲草的抗輻射效果減弱，如果一味地增加蛹蟲草的量，不但不能修復(fù)損傷，反而會加重毒害。該結(jié)論對蛹蟲草的開發(fā)和利用具有指導(dǎo)意義。

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(責(zé)任編輯：朱秀英)

EffectsofCordycepsmilitarisagainstultravioletradiationondrosophilaoffspringgrowthanddevelopment

LI Jinzhe1,HUANG Yaqin1,2，YE Zhaowei1

(1.Department of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Xinyang College of Agriculture and Forestry,Xinyang 464000,China；2.Henan Provincial Key Laboratory of Ion Beam Bio-engineering,Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China)

In order to study the antioxidant protective effects ofCordycepsmilitarisagainst ultraviolet radiation,Drosophila was radiated by different times UV and fed with different mass fractions ofCordycepsmilitarismedium.Through observing and counting its growth and development characteristics of the offspring,we found thatCordycepsmilitarispowder of 0.2% quality score can effectively reduce the whole ultraviolet irradiation Drosophila progeny development cycle (P<0.01),this medium also made UV radiation 40 min Drosophila progeny sex ratio and distortion rate lower (P<0.01),body length and fly rate increased (P<0.05).Cordycepsmilitarispowder of 0.4% quality score not only can shorten the whole development cycle (P<0.01) of UV radiation 40 minDrosophilaprogeny,but also can lower the sex ratio and distortion rate (P<0.01),and increase the body length (P<0.01)of UV radiation 20 minDrosophilaoffspring.Thus,the appropriate concentration ofCordycepsmilitarispowder was able to repair radiation damage and play an anti-UV radiation role on the body.

Cordycepsmilitaris; ultraviolet radiation;Drosophila; growth and development; development of offspring

2015-12-01

河南省科技攻關(guān)項目(152102210222)；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項目(16A180051)；信陽農(nóng)林學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊項目(CXTD-201606)

李盡哲(1982-)，男，河南南陽人，講師，碩士，從事生物制藥技術(shù)方面的研究。

黃雅琴(1986-)，女，河南信陽人，講師。

1000-2340(2016)06-0767-06

Q969.4

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