何海霞， 張 宇， 王 萌， 李曉娜， 楊 葉， 鄭服叢

(1.海南大學環(huán)境與植物保護學院，海南 ?？?70228； 2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院科技信息研究所，海南 儋州571737)

巴西橡膠樹HbMlo1-1基因克隆及其表達

何海霞1， 張 宇1， 王 萌1， 李曉娜2， 楊 葉1， 鄭服叢1

(1.海南大學環(huán)境與植物保護學院，海南 ?？?70228； 2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院科技信息研究所，海南 儋州571737)

為探究Mlo基因在巴西橡膠樹(HeveabrasiliensisMuell. Arg.)中的功能，利用橡膠樹‘熱研7-33-97’的葉片轉(zhuǎn)錄組文庫，擴增得到橡膠樹Mlo基因，并對其進行基因表達分析。該基因推導的蛋白質(zhì)大小為57.76 kD，由510個氨基酸編碼組成。蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其具有一個Mlo蛋白特征性的Mlo Superfamily保守結(jié)構(gòu)域，含有7個跨膜結(jié)構(gòu)域，無信號肽，無核定位信號，定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。這與HbMlo1和AtMlo1的結(jié)構(gòu)相似性很高，被命名為HbMlo1-1。基因表達分析發(fā)現(xiàn)，該基因主要在橡膠樹的樹皮中表達，其表達量在機械傷害、白粉菌作用下顯著上調(diào)。干旱誘導HbMlo1-1基因表達水平顯著下降。IAA、ETH、JA、H2O2均能誘導HbMlo1-1基因上調(diào)表達。說明HbMlo1-1參與橡膠樹植物激素信號傳導途徑和抗逆響應機制，但不具有抗白粉病的功能。

巴西橡膠樹；HbMlo1-1；基因克??；基因表達；逆境

巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis)是一種非常重要的熱帶經(jīng)濟和能源作物，但在生長過程中受多種病蟲害的影響，中國橡膠生長過程中危害最為嚴重和普遍的是白粉菌病害。目前對它的防治主要依靠化學防治，但對于橡膠樹這一高大喬木而言，化學防治操作不便、成本高、環(huán)境污染嚴重。干旱和機械損傷對橡膠樹的生長影響較大，可導致巴西橡膠樹病蟲害發(fā)生率、死皮率增加，災害預報和管理成本增加[1-2]。作為植物激素，乙烯利(ETH)能夠刺激橡膠樹死皮率的增加[3]。茉莉酸(JA)信號途徑對植物生長發(fā)育和植物應對逆境的反應有重要的調(diào)節(jié)作用[4]。Mlo(Mildew resistance locus o)基因是植物中特有的一類與白粉病抗病相關(guān)的基因，具有負向調(diào)控防衛(wèi)功能[5]。該基因首先在大麥中發(fā)現(xiàn)[6]，隨后人們又陸續(xù)在擬南芥、煙草、水稻、高粱、小麥、黃瓜和葡萄等植物中找到相應的Mlo基因[7-8]。目前，Mlo基因的功能研究主要集中在大麥和擬南芥中，大麥Mlo蛋白具有7個跨膜結(jié)構(gòu)[5]，定位于細胞質(zhì)膜上，同時還含有一個由20個氨基酸組成的鈣調(diào)蛋白結(jié)合域(CaM-binding domain，CaMBD)[9-10]。研究表明，Mlo基因是大麥抗白粉病的負調(diào)控因子，其突變體mlo(純合體)表現(xiàn)出對大麥白粉菌的持久、廣譜抗病性[6]。此外，小麥Mlo基因家族成員還參與植物不同發(fā)育和生物、非生物應激反應相關(guān)通路[11]。橡膠樹中Mlo基因的功能研究未見報道。本研究利用橡膠樹‘熱研7-33-97’的葉片轉(zhuǎn)錄組文庫，通過RT-RCR進行克隆，獲得橡膠樹Mlo基因，并對其進行特征性分析和基因表達分析。研究具有負向防衛(wèi)調(diào)控功能的Mlo基因在橡膠樹中的功能對天然橡膠產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟發(fā)展具有重要的理論價值和實踐意義。

1 材料與方法

1.1材料

基因克隆和不同組織的基因表達分析使用海南大學環(huán)境與植物保護學院教學基地的巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis)無性系‘熱研7-33-97’的正常割膠的成齡樹為材料。白粉病侵染處理試驗使用海南大學環(huán)境與植物保護學院試驗基地種植的巴西橡膠樹GT1實生苗為材料。機械傷害、干旱、過氧化氫和植物激素的處理試驗，使用海南大學環(huán)境與植物保護學院試驗基地種植的巴西橡膠樹‘熱研7-33-97’芽接苗為材料。

1.2方法

1.2.1 總RNA的提取以及 cDNA 的合成 將收集好的不同處理下的葉片進行RNA提取[12]，獲得的RNA使用超微量核酸蛋白分析儀檢測其濃度和純度，再利用甲醛變性凝膠電泳檢測RNA的完整性[13]。再將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，方法依照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas)。

1.2.2 橡膠樹葉片Mlo1-1部分序列的EST克隆 根據(jù)GenBank上公布的擬南芥、木薯和蓖麻等物種的Mlo家族蛋白序列，在橡膠樹EST和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中做blastx搜索同源的EST片段，通過拼接得到橡膠樹Mlo1-1基因的cDNA序列。采用Primer5.0軟件設(shè)計基因特異引物HbMlo1-1-F(5′-AGGAGAACAAGGAAGAAGAAGAGAT-3′)和HbMlo1-1-R(5′-AAGCAAGCAAGCTATGATTACAAGT-3′)，用反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，擴增橡膠樹Mlo1-1的cDNA序列。

1.2.3 巴西橡膠樹HbMlo1-1基因結(jié)構(gòu)分析HbMlo1-1基因的編碼區(qū)序列以及氨基酸序列使用在線分析工具NCBI ORF Finder，該基因的蛋白相對分子質(zhì)量、等電點、親水性等理化性質(zhì)通過ExPASy 的ProtParam在線分析軟件進行分析。HbMlo1-1蛋白的結(jié)構(gòu)分析主要使用：NCBI Conserved Domains數(shù)據(jù)庫和SMART在線分析軟件分析其結(jié)構(gòu)保守域，TMHMM Server V.2.0分析其跨膜結(jié)構(gòu)，用SignalP 4.1 Server分析信號肽結(jié)構(gòu)，PSORT Prediction分析亞細胞定位。蛋白的同源性比對利用NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫blastp搜索，獲取其它物種的Mlo同源蛋白序列，再使用DNAMAN6.0軟件進行比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的建立。

1.2.4 巴西橡膠樹HbMlo1-1基因表達分析 收集‘熱研7-33-97’正常割膠的成齡樹上膠乳、花、葉和樹皮作為基因在不同組織中的表達的分析材料。在生長到兩蓬葉的巴西橡膠樹GT1實生苗上接種白粉菌，采集接種后白粉病菌盛發(fā)期(孢子大量萌發(fā))和后期(孢子死亡)時的葉片[14]。機械傷害的芽接苗分別在處理的0、0.5、1、2、6、12 h采集葉片[15]，在斷水處理的芽接苗上連續(xù)采集葉片11 d[16]。噴施200 μmol·L-1ABA體積分數(shù)，1.0% ETH、200 mmol·L-1JA和體積分數(shù)2% H2O2處理芽接苗，所有藥劑用體積分數(shù)0.05%乙醇進行溶解，對照植株噴施體積分數(shù)0.05%乙醇水溶液，在處理后0、0.5、2、6、10、24、48、72 h采集葉片[17]。將收集到的樣品置于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)HbMlo1-1序列設(shè)計熒光定量PCR的引物HbMlo1-1-QF(5′-AGGTAGTGACCTGTTTACAAGC-3′)和HbMlo1-1-QR(5′-ACCCTATTCACAAGAGAGGAAG-3′)，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，橡膠樹HbACTIN(F: GATGTGGATATCAGGAAGGA和R: CATACTGCTTGGAGCAAGA)、Hb18sRNA(F: GCTCGAAGACGATCAGATACC和R: TTCAGCCTTGCGACCATAC)和HbUBC4基因(F: TCCTTATGAGGGCGGAGTC和R: CAAGAACCGCACTTGAGGAG)為內(nèi)參，利用實時熒光定量PCR技術(shù)分析HbMlo1-1基因在不同組織中，以及機械傷害、干旱、白粉菌、激素和過氧化氫(H2O2)處理下的表達模式[18]。

1.2.5 統(tǒng)計分析 使用SAS9.1.3軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析和Duncan檢驗分析。Origin2015科技繪圖軟件和Adobe Photoshop CS5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1巴西橡膠樹HbMlo1-1基因克隆與生物信息學分析

利用木薯MeMlo和葡萄VvMlo蛋白序列在橡膠樹EST和轉(zhuǎn)錄組中做tblastn搜索后，克隆得到的cDNA序列全長為1 792 bp，5′端非編碼區(qū)長度為48 bp，3′端非編碼區(qū)長度為254 bp，編碼區(qū)1 533 bp，編碼510個氨基酸(圖1)。分子式為C2679H4126N690O709S13，總原子數(shù)為8 217，推導的氨基酸理論相對分子質(zhì)量為57.76 kD，等電點為9.08。根據(jù)HbMlo1-1基因的cDNA序列推導出來的蛋白與其他植物麻風樹JcMlo1(Jatrophacurcas，XP_012070330.1)、甜瓜CmMlo1(Cucumismelo，XP_008460095.1)、黃瓜Cs1Mlo(Cucumissativus，XP_004145008.1)、可可樹TcMlo(Theobromacacao，XP_007029886.1)和蓖麻RcMlo(Ricinuscommunis，XP_002523965.1)的蛋白進行同源性分析發(fā)現(xiàn)，它們的相似性分別為85%、75%、74%、74% 和82%(圖2)。該基因同7種植物的Mlo蛋白的聚類分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：該蛋白與HbMlo1，AtMlo1屬于同一分支(圖3)，因此，將該基因命名為HbMlo1-1。

植物的Mlo含有一個特征性結(jié)構(gòu)域(圖4-A)：Mlo Superfamily，從8-484位氨基酸。通過亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)HbMlo1-1蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔、質(zhì)膜和高爾基體中存在的幾率分別是0.685、0.100、0.640和0.460，表明HbMlo1-1主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上(圖4-B)。通過SMART和TMHMM Server V. 2.分析發(fā)現(xiàn)HbMlo1-1蛋白分別在第15-37,64-86,163-185,284-306,310-327,369-391,和411-433位氨基酸處形成7次跨膜(圖5)。通過TargetP 1.1和USC MLEG Group分析發(fā)現(xiàn)，HbMlo1-1蛋白無信號肽和核定位信號。

2.2HbMlo1-1基因的表達分析

HbMlo1-1基因在橡膠樹不同組織中的表達結(jié)果如圖6所示。HbMlo1-1基因在花、葉中表達量極少，在樹皮中表達量最高，相當于葉片中的120倍。表明HbMlo1-1基因主要在橡膠樹的樹皮中表達，具有組織表達特異性。

白粉菌侵染橡膠樹后，HbMlo1-1基因的表達情況如圖7所示。當白粉菌侵染達到1級病害時，橡膠樹HbMlo1-1基因顯著上調(diào)，達到處理前的4.6倍。橡膠樹達到3級病害時，HbMlo1-1基因表達量相對1級時的顯著下降，但相對處理前基因仍處于上調(diào)表達。隨著病害級別的升高，基因表達量沒有明顯變化。表明白粉菌侵染會導致HbMlo1-1基因表達量顯著性上升。

機械傷害作用下，HbMlo1-1基因在處理0.5 h，其表達水平顯著上調(diào)，是處理前的1.4倍。隨著機械傷害處理時間的延長，基因的表達水平呈現(xiàn)顯著下降的趨勢。說明HbMlo1-1基因在橡膠樹機械傷害的早期起到調(diào)節(jié)作用。

圖9為橡膠樹中HbMlo1-1基因在干旱處理的10 d中其表達量的變化規(guī)律。在干旱處理第3天HbMlo1-1基因表達量開始顯著下降。在處理的第5天，HbMlo1-1基因表達量達到最低，是處理前的0.18倍，且隨著干旱時間的延長，基因的表達量一直處于下調(diào)水平。

圖1 HbMlo1-1基因編碼的核酸及其氨基酸序列Fig.1 Nuclear and amino acid sequences of HbMlo1-1 coding area

圖2 HbMlo1-1氨基酸序列與其它植物Mlo氨基酸序列比對Fig.2 Sequence alignment of HbMlo1-1 deduced amino acid sequence with Mlo amino acid from other plants

圖3 HbMlo1-1與不同物種同源蛋白的系統(tǒng)進化關(guān)系分析Fig.3 Phylogenetic analysis of HbMlo1-1 withhomologous protein from various species

H2O2的作用下，橡膠樹HbMlo1-1基因在處理0.5 h表達量顯著上調(diào)，隨后顯著性下降，但仍高于處理前的表達量。在其處理72 h，HbMlo1-1基因再次顯著上調(diào)表達，表達量達到處理前的6.5倍。在脫落酸(ABA)、乙烯利(ETH)和茉莉酸(JA)作用下，橡膠樹HbMlo1-1基因的表達量在處理0.5 h均呈顯著上調(diào)現(xiàn)象。但隨后在ETH處理下，HbMlo1-1基因表達量便顯著下調(diào)，處理10 h達到表達量最低點。在ABA處理下，在0.5 h表達量達到處理前的3.8倍，隨后，表達水平在整體上保持不變。JA在處理的10 h前，HbMlo1-1基因持續(xù)顯著性上調(diào)，最高達到處理前的8.5倍。10 h后，HbMlo1-1基因表達量顯著下降(圖10)。表明HbMlo1-1基因的表達水平受ABA、JA、ETH和H2O2的誘導影響。

圖4 HbMlo1-1推導的氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域和亞細胞定位Fig.4 The conserved domain and subcellular localization of HbMlo1-1 deduced amino acid sequence

圖5 HbMlo1-1基因推導的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)Fig.5 transmembrane domians of HbMlo1-1 deduced amino acid sequence

注：不同大寫字母表示差異顯著P<0.01，下圖同。

圖7 HbMlo1-1在白粉菌侵染下表達分析Fig.7 HbMlo1-1 expression analysis underpowdery mildew infection

圖8 機械傷害處理下HbMlo1-1基因的表達分析Fig.8 HbMlo1-1 expresion analysis undermechanical wounding treatment

圖9 HbMlo1-1基因在干旱處理條件下的表達分析Fig.9 HbMlo1-1 expression analysisunder drought treatment

圖10 HbMlo1-1在不同激素和過氧化氫處理下的表達分析Fig.10 HbMlo1-1 expresion analysis under different hormones and H2O2 treatment

3 討論

Mlo基因是一個大家族，通過將擬南芥、葡萄、大麥和小麥等植物中的Mlo基因進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，可將它們劃分為7個不同的分支[19]。分析發(fā)現(xiàn)HbMlo1-1屬于第Ⅱ分支，與擬南芥AtMlo1和HbMlo1在同一支。該基因編碼的蛋白在8～484位氨基酸存在一個特征性結(jié)構(gòu)域，在這段序列中含有7次跨膜螺旋區(qū)。擬南芥AtMlo1(登錄號：NP_192169.1)和橡膠樹HbMlo1(登錄號：AIZ94062.1)分別編碼526個和516個氨基酸，在5～485位和12～504位分別存在一個保守區(qū)域，均存在7次跨膜螺旋區(qū)域。在對HbMlo1-1基因進行細胞定位時發(fā)現(xiàn)，其主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，而大多數(shù)Mlo家族成員定位在細胞質(zhì)膜上[20]，如大豆GmMlo和大麥HvMlo[5,11]。不同于大麥、小麥、水稻和番茄等作物[21]，HbMlo1-1蛋白無信號肽和核定位信號，同AtMlo1和HbMlo1的情況一致。

結(jié)構(gòu)決定功能。通過基因表達分析發(fā)現(xiàn)HbMlo1-1基因在樹皮中表達量最高，葉片中次之。AtMlo1主要在葉片的維管束、根的維管組織以及花粉粒中表達[22]。在用白粉菌侵染橡膠樹的研究中，發(fā)現(xiàn)橡膠樹在感染白粉病初期，HbMlo1-1基因顯著上調(diào)表達，表達量達到處理前的4.6倍，隨著病害程度的加重，其表達量顯著下調(diào)。這與AtMlo1和HbMlo1在受到白粉病菌侵染下基因的表達情況不同，它們的表達量并不受白粉菌的誘導[19,23]。白粉菌的侵染本身會導致葉片組織的結(jié)構(gòu)受損，進而引起H2O2的大量爆發(fā)。橡膠樹在機械傷害和H2O2處理下HbMlo1-1基因的表達量均呈現(xiàn)顯著上升，隨后又逐漸下降的現(xiàn)象，這與白粉菌侵染下基因的表達量變化趨勢相同，由此可以判斷HbMlo1-1基因在白粉菌作用下基因表達水平產(chǎn)生變化并不是由于白粉菌本身的誘導作用所引起的。干旱和機械傷害都能夠誘導HbMlo1-1基因顯著下調(diào)表達，推測該基因參與了橡膠樹的脅迫應答過程。JA處理下HbMlo1-1基因的表達量在初期顯著性上升，隨后顯著性下降，在ETH的作用下，橡膠樹HbMlo1-1基因的表達情況同JA作用下類似。推測HbMlo1-1基因可能參與JA、ETH在植物體內(nèi)的信號傳導過程。JA能夠調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育[4]，ETH在濃度過高時能夠刺激橡膠樹死皮率的增加[3]。研究HbMlo1-1基因同JA和ETH的關(guān)系，有利于促進橡膠樹更好的生長發(fā)育，提高經(jīng)濟發(fā)展。越來越多的證據(jù)表明，H2O2在植物面臨環(huán)境脅迫反應中發(fā)揮著重要的作用，比如應對逆境產(chǎn)生抗病防御反應、調(diào)控植物的生長發(fā)育、參與保衛(wèi)細胞氣孔運動等諸多生理過程[24]，ABA在植物干旱、高鹽、低溫和病蟲害等逆境脅迫反應中起重要作用[25]。本研究中發(fā)現(xiàn)H2O2和ABA能夠誘導HbMlo1-1基因的表達量顯著上升，推測HbMlo1-1基因可能參與植物體內(nèi)H2O2的產(chǎn)生和ABA的信號傳導過程，進而影響橡膠樹在逆境中的生長狀況。本研究為探究HbMlo1-1基因在橡膠樹的生長發(fā)育和脅迫應答中的功能奠定理論基礎(chǔ)，對天然橡膠產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟發(fā)展具有重要的理論價值和實踐意義。

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(責任編輯：蔣國良)

CloningandexpressionofHbMlo1-1geneinHeveabrasiliensisMuell.Arg.

HE Haixia1， ZHANG Yu1， WANG Meng1， LI Xiaona2， YANG Ye1， ZHENG Fucong1

(1.Environment and Plant Protection College, Hainan University, Haikou 570228，China; 2.Information Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou 571737， China)

In order to research the function ofMlogenes in rubber trees, we used transcriptome library of leaf of ‘Reyan 7-33-97 to cloneMlogene, then analyzed the expression of this gene. TheMlogene deduced a protein with a molecular mass of 57.76 kD, encoding by 510 amino acid. The protein structure analysis revealed that the protein had a characteristic Mlo superfamily conserved domain, seven transmembrane domains, no signal peptide, no nuclear localization signal, located on endoplasmic reticulum, and shared the highest similarity to theHbMlo1andAtMlo1. Therefore, the gene was namedHbMlo1-1. The expression analysis indicated thatHbMlo1-1 expressed mainly in the bark of the rubber tree. The expression level ofHbMlo1-1 was significantly upregulated under the wounding and powdery mildew infection treatment. Drought treatment induced the expression level ofHbMlo1-1 to have declined significantly. IAA, ETH, JA and H2O2can all induce the geneHbMlo1-1 to upregulate significantly. The results suggested thatHbMlo1-1 was involved in signal transduction pathway of plant hormones and response mechanisms of stress resistance, but didn’t have the function of the resistance to powdery mildew.

Heveabrasiliensis;HbMlo1-1; gene cloning; gene expression; stress environment

2016-04-29

國家自然科學基金項目(31460197)；國家天然橡膠產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-34-GW8)；海南省自然科學基金項目(314059)；海南省研究生創(chuàng)新科研項目(Hys2015-11)

何海霞(1991-)，女，安徽安慶人，碩士研究生，從事分子植物病理學研究。

張 宇(1974-)，女，河北昌黎人，副教授，博士。

1000-2340(2016)06-0739-09

S432.1

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