王曉星，崔艷艷，菅復(fù)春，張忠義，寧建峰，張龍現(xiàn)，王榮軍，寧長申

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.宜陽縣動物疫病預(yù)防控制中心，河南 宜陽 471600)

羊附紅細(xì)胞體巢式PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

王曉星1，崔艷艷1，菅復(fù)春1，張忠義2，寧建峰2，張龍現(xiàn)1，王榮軍1，寧長申1

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.宜陽縣動物疫病預(yù)防控制中心，河南 宜陽 471600)

為了建立一種更加準(zhǔn)確、敏感的羊附紅細(xì)胞體檢測方法，根據(jù)GenBank上發(fā)表的羊附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列(登錄號：AF338268)，設(shè)計內(nèi)、外2對特異性引物，建立了巢式PCR檢測方法。篩選該方法的最佳反應(yīng)條件，并進行了特異性、敏感性、重復(fù)性試驗及臨床樣本檢測。結(jié)果表明，該方法能擴增出大小為506 bp的羊附紅細(xì)胞體特異性片段，與GenBank收錄的相關(guān)參考序列同源性為97.8%～99.6%；與豬附紅細(xì)胞體、嗜吞噬細(xì)胞無漿體、綿羊無漿體、莫氏巴貝斯蟲、呂氏泰勒蟲基因組DNA均無交叉反應(yīng)；DNA最低檢測量為0.654 fg·μL-1；具有良好的重復(fù)性；對77份羊臨床血液樣品檢測結(jié)果表明，羊附紅細(xì)胞體感染率為71.43%，高于常規(guī)PCR和已報道的巢式PCR檢測結(jié)果。

羊附紅細(xì)胞體; 16S rRNA; 巢式PCR

附紅細(xì)胞體病(Eperythrozoonosis)是由附紅細(xì)胞體(HemotropicMycoplasma)寄生在多種動物及人的紅細(xì)胞表面、血漿及骨髓內(nèi)的一種人畜共患病，該病的主要臨床表現(xiàn)為紅細(xì)胞壓積降低、血紅蛋白濃度下降、白細(xì)胞增多、貧血、黃疸、發(fā)熱等[1-3]。1934年，NEITZ等在綿羊的紅細(xì)胞及周圍發(fā)現(xiàn)有多形態(tài)的微生物寄生，命名為綿羊附紅細(xì)胞體(Eperythrozoonovis)。根據(jù)其形態(tài)和生物學(xué)特性，最初把附紅細(xì)胞體歸類為立克次氏體類微生物(Rickettsiales)。近年來，分子生物學(xué)研究結(jié)果表明，附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列與柔膜體綱支原體屬高度同源，多數(shù)學(xué)者同意將其分類于柔膜體綱(Mollicutes)，支原體目(Mycoplasmatales)，支原體科(Mycoplasmataceae)，嗜血性支原體屬(HemotropicMycoplasma)[4-6]。目前，世界上已有30多個國家和地區(qū)報道過該病[7]，中國是附紅細(xì)胞體病流行最為嚴(yán)重的國家之一。國內(nèi)外各地區(qū)報道該病感染率高低不一，這種感染率的差異可能與調(diào)查地區(qū)環(huán)境、采樣季節(jié)不同以及檢測方法敏感性的高低有較大關(guān)系。目前，該病的診斷方法包括形態(tài)學(xué)檢查、動物試驗、血清學(xué)檢測、PCR技術(shù)檢測等，但前三者受不明微生物、染料顆粒、感染時間、抗體水平等多種因素的影響，極易造成假陽性。本試驗旨在建立靈敏度高、特異性好的巢式PCR檢測方法，為羊附紅細(xì)胞體的快速診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器

LATaqDNA聚合酶、rTaqDNA聚合酶、基因

工程菌大腸桿菌DH5α、pMDTM18-T Vector Cloning Kit、DNA Marker DL2000購自TaKaRa公司；Genonmic DNA Purification Kit、Gel Extraction Kit 購于Promega公司；哺乳動物血液基因組DNA提取試劑盒購于上海萊楓生物科技有限公司。9700型PCR擴增儀購于Bio-Rad公司；凝膠成像分析系統(tǒng)購于Syngene公司。

1.2樣品來源

77份羊血液樣品采自河南省宜陽縣某養(yǎng)殖戶，采取頸靜脈無菌采血，其中部分羊只以高熱、貧血、黏膜黃染、流產(chǎn)(5只)等為主要臨床癥狀。嗜吞噬細(xì)胞無漿體、綿羊無漿體、莫氏巴貝斯蟲和呂氏泰勒蟲陽性血液樣品由河南省人獸共患病國際聯(lián)合實驗室保存，豬附紅細(xì)胞體陽性樣品由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所饋贈，羊附紅細(xì)胞體陽性樣品由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)饋贈。

1.3DNA的提取

所有樣品基因組DNA按照哺乳動物血液基因組DNA提取試劑盒(上海萊楓生物科技有限公司)的說明書步驟抽提DNA。

1.4引物設(shè)計與合成

利用Clustal X 2.1序列分析軟件，將GenBank中的羊附紅細(xì)胞體16S rRNA序列(登錄號：AF338268)與其他物種同源序列進行比對，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計2對引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物詳情見表1。

1.5巢式PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

第一輪PCR以A1/A2為引物，對羊全血DNA進行PCR擴增，反應(yīng)體系為10× LA PCR BufferⅡ(Mg2+plus) 2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP Mixture 4.0 μL，引物A1/A2(25 μmol·L-1)各0.5 μL，模板1.0 μL，LATaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)0.25 μL，用雙蒸水補至25 μL。上述反應(yīng)混合物于94 ℃預(yù)變性5 min后，94 ℃變性30 s、61 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后72 ℃總延伸7 min，4 ℃保存，預(yù)擴增產(chǎn)物為1 060 bp。第二輪PCR以B1/B2為引物，以相對應(yīng)的第一輪PCR產(chǎn)物1.0 μL(1∶10倍稀釋)為模板進行PCR，其中10 × PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP Mixture 2.0 μL，引物B1/B2(25 μmol·L-1)各0.5 μL，rTaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)0.15 μL，用雙蒸水補至25 μL，94 ℃預(yù)變性5 min后，94 ℃變性30 s、59 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)，最后72 ℃總延伸7 min，4 ℃保存，預(yù)擴增產(chǎn)物為506 bp。

表1 M. ovis 16S rRNA基因PCR擴增引物序列Table 1 Pairs of primers used for amplification of the 16S rRNA gene of M. ovis.

1.6最適退火溫度的篩選

為優(yōu)化巢式PCR反應(yīng)，對最適退火溫度進行篩選。對外引物進行溫度梯度PCR，退火溫度范圍為53～62 ℃。在外引物退火溫度的基礎(chǔ)上對內(nèi)引物進行溫度梯度PCR，退火溫度范圍為53～62 ℃。根據(jù)不同退火溫度下目的條帶的亮度及有無非特異性條帶及交叉二聚體進行綜合分析，確定該反應(yīng)體系的最適退火溫度。

1.7產(chǎn)物的回收、克隆及測序

用DNA凝膠回收試劑盒將PCR產(chǎn)物回收，將回收產(chǎn)物與pMDl8-T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH50α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選得到陽性菌斑擴大培養(yǎng)，陽性菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。應(yīng)用DNAStar 7.1軟件和BLAST工具將測得的核苷酸序列與GenBank中的相關(guān)序列進行同源性比較。

1.8特異性試驗

分別提取豬附紅細(xì)胞體、嗜吞噬細(xì)胞無漿體、綿羊無漿體、莫氏巴貝斯蟲和呂氏泰勒蟲的基因組DNA，測定其質(zhì)量濃度，并以羊附紅細(xì)胞體基因組DNA質(zhì)量濃度(65.4 ng·μL-1)為基準(zhǔn)進行稀釋后，作為特異性試驗的模板。

1.9敏感性試驗

將測定的羊附紅細(xì)胞體基因組DNA質(zhì)量濃度(65.4 ng·μL-1)按1∶10比例連續(xù)稀釋后作為模板進行PCR擴增，檢測最低DNA檢測量。

1.10重復(fù)性試驗

用建立的巢式PCR方法對2次采集的羊血樣分別進行不同批內(nèi)、批間的重復(fù)性試驗，檢驗該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.11臨床樣本檢測

應(yīng)用建立的巢式PCR方法對河南省宜陽縣某養(yǎng)殖戶散養(yǎng)的77份(2014年7月49份、2015年4月28份)羊血樣進行檢測，并與Crazziotin等[8]建立的常規(guī)PCR方法，趙曉薇等[9]建立的巢式PCR方法進行比較。檢測結(jié)果通過測序排除假陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1巢式PCR擴增

羊全血基因組DNA經(jīng)外引物A1/A2，內(nèi)引物B1/B2共擴增得到1條約506 bp的特異性條帶(圖1)，與預(yù)期目的片段大小一致。

M. DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2000； 1,2. PCR 產(chǎn)物；3. 陽性對照；4. 陰性對照。M. DNA Marker DL 2000；1，2. PCR products；3. Positive control；4. Negative control.

2.2最適退火溫度的篩選

2.2.1 外引物溫度梯度PCR擴增 從圖2可以看出，隨著退火溫度的變化，產(chǎn)物量基本沒有變化，第一輪擴增在53～60 ℃之間均出現(xiàn)非特異性條帶，當(dāng)退火溫度在61～62 ℃時，無非特異性條帶，故以61 ℃作為外引物的最適退火溫度。

M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1. 53 ℃; 2. 54 ℃; 3. 55 ℃; 4.56 ℃; 5. 57 ℃; 6. 58 ℃; 7. 59 ℃; 8. 60 ℃; 9. 61 ℃; 10.62 ℃；11. 陰性對照。M. DNA Marker DL2000；1. 53 ℃; 2. 54 ℃; 3. 55 ℃; 4.56 ℃; 5. 57 ℃; 6. 58 ℃; 7. 59 ℃; 8. 60 ℃; 9. 61 ℃; 10.62 ℃；11. Negative control.

2.2.2 內(nèi)引物溫度梯度PCR擴增 從圖3可以看出，第二輪擴增在53～62 ℃之間均出現(xiàn)特異性條帶，但當(dāng)退火溫度低于57 ℃時，有少量拖尾現(xiàn)象，高于57 ℃時無拖帶且當(dāng)退火溫度在59 ℃時條帶最亮，故以59 ℃作為內(nèi)引物的最適退火溫度。

2.3序列測定及同源性分析

將測序結(jié)果與GenBank中登錄號AF338268同源性為99.6%，與其他相關(guān)參考序列同源性為97.8%～99.6%。

2.4特異性試驗

以A1/A2為引物進行第一輪PCR擴增后，羊附紅細(xì)胞體基因組DNA和豬附紅細(xì)胞體均出現(xiàn)1 060 bp左右的條帶，而嗜吞噬細(xì)胞無漿體、綿羊無漿體、莫氏巴貝斯蟲和呂氏泰勒蟲則未出現(xiàn)條帶(圖4)。以B1/B2為引物進行第二輪PCR擴增后，只有羊附紅細(xì)胞體基因組DNA出現(xiàn)506 bp左右的條帶，而豬附紅細(xì)胞體、嗜吞噬細(xì)胞無漿體、綿羊無漿體、莫氏巴貝斯蟲和呂氏泰勒蟲基因組DNA均未出現(xiàn)條帶(圖5)。

M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1. 53 ℃; 2. 54 ℃; 3. 55 ℃; 4.56 ℃;5. 57 ℃; 6. 58 ℃; 7. 59 ℃; 8. 60 ℃; 9. 61 ℃; 10. 62 ℃；11. 陰性對照。M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1. 53 ℃; 2. 54 ℃; 3. 55 ℃; 4.56 ℃; 5. 57 ℃; 6. 58 ℃; 7. 59 ℃; 8. 60 ℃; 9. 61 ℃; 10. 62 ℃；11. Negative control.

M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1. 羊附紅細(xì)胞體；2. 豬附紅細(xì)胞體； 3. 嗜吞噬細(xì)胞無漿體；4. 綿羊無漿體；5. 莫氏巴貝斯蟲； 6. 呂氏泰勒蟲；7. 雙蒸水。M. DNA Marker DL2000; 1. M. ovis; 2.E. suis; 3. Anaplasma phagocytophilum; 4. A. ovis; 5. Babesia motasi; 6. Theileria luwenshuni; 7. ddH2O.

2.5敏感性試驗

用紫外分光光度計測定提取的M.ovisDNA含量為65.4 ng·μL-1，D260/D280=1.84，說明所提取的DNA無蛋白和RNA污染。取M. ovis基因組DNA(含量65.4 ng·μL-1)按1∶10倍比稀釋后作為模板進行PCR擴增，第一輪PCR可檢測M.ovis基因組DNA的最大稀釋倍數(shù)為1×10-4，即最低

M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1. 羊附紅細(xì)胞體；2. 豬附紅細(xì)胞體；3. 嗜吞噬細(xì)胞無漿體；4. 綿羊無漿體；5.莫氏巴貝斯蟲；6. 呂氏泰勒蟲；7. 雙蒸水。M. DNA Marker DL2000; 1. M. ovis; 2.E. suis; 3. A. phagocytophilum; 4. A. ovis; 5. B. motasi; 6. T. luwenshuni; 7. ddH2O.

可檢測到6.54 pg·μL-1(圖6)；第二輪PCR可檢測M.ovis基因組DNA的最大稀釋倍數(shù)為1×10-8，即最低可檢測到0.654 fg·μL-1(圖7)。

M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1. 65.4 ng·μL-1；2. 6.54 ng·μL-1；3. 654 pg·μL-1；4. 65.4 pg·μL-1；5. 6.54 pg·μL-1；6. 654 fg·μL-1；7. 65.4 fg·μL-1；8. 6.54 fg·μL-1；9. 0.654 fg·μL-1；10. 0.065 4 fg·μL-1；11. 0.006 54 fg·μL-1；12. 陰性對照。M. DNA Marker DL2000；1. 65.4 ng·μL-1；2. 6.54 ng·μL-1；3. 654 pg·μL-1；4. 65.4 pg·μL-1；5. 6.54 pg·μL-1；6. 654 fg·μL-1；7. 65.4 fg·μL-1；8. 6.54 fg·μL-1；9. 0.654 fg·μL-1；10. 0.065 4 fg·μL-1；11. 0.006 54 fg·μL-1；12. Negative control.

M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1. 65.4 ng·μL-1；2. 6.54 ng·μL-1；3. 654 pg·μL-1；4. 65.4 pg·μL-1；5. 6.54 pg·μL-1；6. 654 fg·μL-1；7. 65.4 fg·μL-1；8. 6.54 fg·μL-1；9. 0.654 fg·μL-1；10. 0.065 4 fg·μL-1；11. 0.006 54 fg·μL-1；12. 陰性對照。M. DNA Marker DL2000；1. 65.4 ng·μL-1；2. 6.54 ng·μL-1；3. 654 pg·μL-1；4. 65.4 pg·μL-1；5. 6.54 pg·μL-1；6. 654 fg·μL-1；7. 65.4 fg·μL-1；8. 6.54 fg·μL-1；9. 0.654 fg·μL-1；10. 0.065 4 fg·μL-1；11. 0.006 54 fg·μL-1；12. Negative control.

2.6重復(fù)性試驗結(jié)果

用建立的巢式PCR方法，通過對不同批內(nèi)、批間的羊血樣進行檢測，重復(fù)性檢測結(jié)果均一致，說明該方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性(圖8)。

2.7臨床樣本的檢測

抽提77份羊血液樣本DNA為模板進行常規(guī)PCR[8]、巢式PCR[9]擴增，比較檢測結(jié)果(表2)。本試驗建立的巢式PCR方法對羊附紅細(xì)胞體的陽性檢出率為71.43%(55/77)，均高于趙曉薇等[9]建立的巢式PCR方法的檢出率48.05%(37/77)和常規(guī)PCR方法檢出率10.39%(8/77)。通過對陽性PCR產(chǎn)物測序結(jié)果分析，均為M.ovis。

M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1～3. PCR產(chǎn)物；4. 陰性對照。M. DNA Marker DL 2000; 1 to 3. PCR products; 4. Negative control.

檢測方法Detectionmethods陽性樣本數(shù)/個Positivesamplenumbers總樣本數(shù)/個Totalsamplenumbers陽性率/%Positiverate巢式PCR(本試驗)NestedPCR(thestudy)557771.43常規(guī)PCR[8]ConventionalPCR[8]87710.39巢式PCR[9]NestedPCR[9]377748.05

3 討論

關(guān)于本病的診斷方法，國內(nèi)外報道的有顯微鏡檢查法(鮮血壓片法、血涂片染色法)、血清學(xué)檢測以及分子生物學(xué)診斷技術(shù)等方法[9～14]。目前國內(nèi)對附紅細(xì)胞體的診斷方法主要以顯微鏡檢法為主，而該方法在操作過程中常常會引起紅細(xì)胞的變形而導(dǎo)致假陽性結(jié)果。當(dāng)免疫水平較高或藥物治療時，血液中的附紅細(xì)胞體大多會被清除，鏡下可見的附紅細(xì)胞體很少或找不到，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。本試驗建立的PCR方法擴增產(chǎn)物序列與GenBank中相關(guān)參考序列比較同源性為97.8%～99.6%；通過提取豬附紅細(xì)胞體、嗜吞噬細(xì)胞無漿體、綿羊無漿體、莫氏巴貝斯蟲和呂氏泰勒蟲的基因組DNA并進行擴增，結(jié)果均為陰性；且該方法DNA最低檢測量為0.654 fg·μL-1，表明本試驗建立的PCR方法具有良好的特異性和敏感性。

用本試驗建立的巢式PCR、文獻報道的巢式PCR[9]和常規(guī)PCR[8]方法分別檢測77份羊臨床血液樣品，本試驗建立的巢式PCR方法檢出率最高(71.43%)，明顯高于巢式PCR[9](48.05%)和常規(guī)PCR[8](10.39%)的檢出率；對陽性PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果分析表明，3種PCR的檢測結(jié)果均是可靠的。不同檢測方法陽性率差異較大的原因，可能是其敏感性存在差異所致，因此臨床診斷中應(yīng)選用敏感性較高的檢測方法。

本檢測77份羊血樣的巢式PCR陽性檢出率高達71.43%(55/77)，說明羊群存在羊附紅細(xì)胞體感染，與部分羊表現(xiàn)明顯臨床癥狀相一致，而有的羊未呈現(xiàn)臨床癥狀，可能與隱性感染狀態(tài)或感染強度較低有關(guān)，因此，臨床工作中應(yīng)重視該病的防治。

附紅細(xì)胞體病是一種人獸共患傳染病。近年來，人感染附紅細(xì)胞體的報道不斷增多，可感染人的嗜血性支原體(附紅細(xì)胞體)包括Mycoplasmahaemofelis-like、M.suis-like、M.ovis、“CandidatusMycoplasmahaemohominis”、“CandidatusMycoplasmahaematoparvum” 和M.ovis-like[15]，M.ovis為感染人的優(yōu)勢種[16]。另據(jù)報道，M.haemofelis可感染艾滋病患者[17]；目前，中國肉羊業(yè)快速發(fā)展，做好肉羊人獸共患附紅細(xì)胞體病的監(jiān)測與防控，為保障人畜健康和公共衛(wèi)生安全具有重大意義。本試驗建立的巢式PCR方法具有特異性強、敏感性高和重復(fù)性好等優(yōu)點，對于M.ovis的流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷具有重大意義。

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(責(zé)任編輯：蔣國良)

Establishmentandapplicationofanested-PCRassayfordetectionofMycoplasmaovis

WANG Xiaoxing1, CUI Yanyan1, JIAN Fuchun1, ZHANG Zhongyi2，NING Jianfeng2ZHANG Longxian1, WANG Rongjun1, NING Changshen1

(1.Engineering College of Animal Husbandry and Veterinary Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2. Yiyang Animal Disease Control Center, Yiyang 471600, China)

To establish a nested PCR assay for detection ofMycoplasmaovis, according to the publishedMycoplasmaovis16S rRNA gene sequence in GenBank (Accession number: AF338268), two pairs of primers were designed inside and outside to establish nested PCR assay for detecting the disease caused byMycoplasmaovis. The optimum reaction conditions were screened,and the specificity, sensitivity and reproducibility of test and detection of clinical samples were carried out. The results of verification experiments showed that the targeted gene fragment was 506 bp in length and homology of nested PCR product was 97.8% to 99.6%, and this detection method had no cross reaction withEperythrozoonsuis,Anaplasmaphagocytophilum,Anaplasmaovis,Babesiamotasi,andTheilerialuwenshuni. The sensitivity reached 0.654 fg·μL-1. This method had good repeatability. The 71.43% positive rate in 77 clinical samples by the nested PCR assay was higher than that by the conventional PCR and the reported nested PCR test results.

Mycoplasmaovis; 16S rRNA; nested PCR

2016-03-01

農(nóng)業(yè)部國家現(xiàn)代肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金項目(nycytx-39)；河南省教育廳現(xiàn)代畜牧業(yè)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心

王曉星(1990-), 女, 河南鞏義人, 碩士研究生, 主要從事人獸共患寄生蟲病研究。

寧長申(1958-), 男, 河南郾城人, 教授。

1000-2340(2016)03-0506-06

S855. 99

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