陳靜，孫云超，冉小庫，袁穎，竇德強(qiáng)

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

白術(shù)利尿作用研究△

陳靜，孫云超，冉小庫，袁穎，竇德強(qiáng)*

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

目的：研究白術(shù)及其拆分組分對(duì)大鼠的利尿作用。方法：采用多模式聯(lián)用的方法對(duì)白術(shù)化學(xué)組分進(jìn)行拆分；通過預(yù)先胃水負(fù)荷模型，以6 h尿量為指標(biāo)考察白術(shù)及其拆分組分對(duì)水負(fù)荷大鼠利尿作用；進(jìn)一步測(cè)定紅細(xì)胞和腎髓中Na+-K+-ATP酶活力、血尿素氮濃度、腎髓中碳酸酐酶水平和Na+、K+、Cl-排出量，研究其相關(guān)機(jī)理。結(jié)果：高劑量白術(shù)水煎液和白術(shù)揮發(fā)油組分對(duì)大鼠有一定的抗利尿作用；與空白組相比，白術(shù)水煎液及其拆分組分組紅細(xì)胞中Na+-K+-ATP酶活力、腎髓中Na+-K+-ATP酶和碳酸酐酶水平無顯著變化。結(jié)論：白術(shù)對(duì)正常動(dòng)物無利尿作用，相反表現(xiàn)出一定的抗利尿作用，且首次研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)揮發(fā)油有一定的抗利尿作用。

白術(shù)；拆分組分；利尿作用

白術(shù)為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖，性溫，味甘、苦，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功能，用于脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗、胎動(dòng)不安[1]。近年來關(guān)于白術(shù)藥理作用有較多報(bào)道，如補(bǔ)脾作用[2]、抑制胃腸功能作用[3]、抗炎作用[4]等。然而文獻(xiàn)報(bào)道中關(guān)于白術(shù)利尿作用有一定差異，有文獻(xiàn)報(bào)道白術(shù)具有利尿作用[5]；也有文獻(xiàn)報(bào)道白術(shù)無利尿作用，而在高劑量呈現(xiàn)一定的抗利尿作用[6]。目前關(guān)于白術(shù)拆分組分利尿作用無相關(guān)報(bào)道。前期我們對(duì)白術(shù)的化學(xué)組分進(jìn)行拆分，并對(duì)拆分組分間的差異度及化學(xué)成分進(jìn)行表征[7-8]。本實(shí)驗(yàn)以消化道水負(fù)荷模型大鼠為對(duì)象，觀察大鼠6 h內(nèi)排尿量，并測(cè)定部分生化指標(biāo)，研究白術(shù)及其拆分組分的利尿作用及相關(guān)機(jī)理，為白術(shù)藥理作用研究及臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

雄性SD大鼠，體重200～220 g(遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司)，合格證號(hào)：SCXK(遼)2010-0001。

1.2 藥物與試劑

白術(shù)于2012年11月采自浙江于潛，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室王冰教授鑒定為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的根莖(批號(hào)：20121101)。稱取白術(shù)藥材400 g，冷水充分浸泡，煎煮2次后，合并藥液過濾，濃縮為0.72 g·mL-1的白術(shù)水煎液，4 ℃保存?zhèn)溆?。白術(shù)的給藥劑量按照《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)中規(guī)定的飲片成人服用量折算大鼠的給藥劑量作為1倍量，同時(shí)大鼠每天按1 mL·(100g)-1灌胃給藥，折算白術(shù)1倍給藥濃度為0.12 g·mL-1。

氫氯噻嗪(山西云鵬制藥有限公司，批號(hào)：A130702)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；0.9%氯化鈉溶液(黑龍江科倫制藥有限公司，批號(hào)：12060201-2)；血紅蛋白測(cè)定試劑盒(長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：2014013)；超微量ATP酶(Na+/K+)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20140627)；ATP酶不高速測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20140627)；考馬斯亮藍(lán)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20140619)；大鼠碳酸酐酶(CA)Elisa測(cè)試盒(R&D，批號(hào)：201406)；尿素氮(BUN)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20140629)。

1.3 儀器

代謝籠；UV-2100紫外分光光度計(jì)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；SUNRISE型酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；7600-020全自動(dòng)生化分析儀，Na+、K+、Cl-電極配套標(biāo)準(zhǔn)液、稀釋液和比較電極液(日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)有限公司)。

2 方法

采用Aston方法[9-11]對(duì)大鼠進(jìn)行篩選，將大鼠置于代謝籠中適應(yīng)3 d，禁食不禁水18 h后，按2.5 mL·(100 g)-1劑量灌胃去離子水，收集2 h尿液，排尿質(zhì)量大于灌胃離子水質(zhì)量40%的大鼠，即為合格。

2.1 不同劑量白術(shù)水煎液對(duì)大鼠利尿作用研究

選取合格大鼠50只，分為空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組(氫氯噻嗪)、白術(shù)1倍劑量組、白術(shù)3倍劑量組和白術(shù)6倍劑量組，每組10只。

采用代謝籠法[9-11]，各組按規(guī)定劑量灌胃給藥，連續(xù)給藥9 d。末次給藥前禁食不禁水24 h，各組按5 mL·(100g)-1劑量灌胃0.9%氯化鈉溶液，可使動(dòng)物細(xì)胞外液增加，模擬水鈉潴留狀態(tài)。20 min后，按1 mL·(100g)-1劑量灌胃給藥，空白組給予同體積的水。給藥后，輕壓大鼠的下腹部使膀胱中尿液排盡，然后置于代謝籠內(nèi)，每隔3 h收集尿液1次，共收集2次，最后一次收集前輕壓大鼠的下腹部使膀胱中尿液排盡，記錄給藥后各組大鼠6 h內(nèi)的尿量。室溫控制在(20±1)℃為宜。

2.2 白術(shù)拆分組分利尿作用研究

鑒于2.1項(xiàng)下的結(jié)果可知，白術(shù)6倍劑量水煎液有較弱的抗利尿作用，因此對(duì)白術(shù)6倍拆分組分進(jìn)行利尿?qū)嶒?yàn)研究。選出合格大鼠80只，隨機(jī)分為空白組(NO)、陽性組(PO)、白術(shù)6倍量組(WD)、白術(shù)6倍揮發(fā)油組(VOF)、白術(shù)6倍石油醚組(PEF)、白術(shù)6倍樹脂醇洗組(AEF)、白術(shù)6倍樹脂水洗組(WEF)和白術(shù)6倍粗多糖組(CPF)，每組10只。

2.2.1 白術(shù)化學(xué)組分拆分 參照文獻(xiàn)[7-8]，通過多模式(溶劑分配、大孔樹脂)聯(lián)用的化學(xué)成分拆分方法，對(duì)白術(shù)中化學(xué)拆分組分進(jìn)行穩(wěn)定、有效制備，得到揮發(fā)油組分、石油醚組分、樹脂醇洗組分、樹脂水洗組分和粗糖組分。并通過HPLC等法對(duì)各組分代表性成分進(jìn)行分析，結(jié)果表明揮發(fā)油組分主要為蒼術(shù)酮、萜及倍半萜類成分；石油醚組分主要為白術(shù)內(nèi)酯類成分；樹脂醇洗組分主要為一些聚炔類化合物；樹脂水洗組分含有5-羥甲基糠醛和小分子糖等化合物；粗糖組分主要成分為低聚果糖。

2.2.2 白術(shù)拆分組分對(duì)大鼠利尿作用研究 按其文獻(xiàn)中白術(shù)各拆分收率，用0.5%的CMC-Na混懸液將白術(shù)各拆分組分混懸至相應(yīng)濃度即可[7]。各組按規(guī)定劑量灌胃給藥，連續(xù)給藥9 d。第9天給藥前禁食不禁水24 h，按照2.1項(xiàng)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 紅細(xì)胞和腎髓中Na+-K+-ATP酶活力測(cè)定 末次給藥后，取血，3000 r·min-1離心15 min，取下層紅細(xì)胞200 μL，0.9%氯化鈉溶液吹洗3次，加入800 μL雙蒸水，37 ℃水浴 1 h，制備溶血液，備用。紅細(xì)胞Na+-K+-ATP酶活性的測(cè)定根據(jù)血紅蛋白測(cè)定試劑盒(疊氮高鐵法)和超微量ATP酶(Na+-K+)測(cè)試盒使用說明，分別測(cè)定血紅蛋白含量和Na+-K+-ATP酶活性。

將大鼠處死后，解剖，取整個(gè)右腎內(nèi)髓部分，用0.9%氯化鈉溶液勻漿處理得2%腎髓組織液，3000 r·min-1離心10 min，吸取上清液。根據(jù)考馬斯亮藍(lán)測(cè)定試劑盒和不高速ATP酶測(cè)試盒使用說明，分別測(cè)定2%組織液總蛋白含量和Na+-K+-ATP酶活性。

2.2.4 尿液中Na+、K+、Cl-排出量測(cè)定 采集6 h內(nèi)尿液，離心，得上清液，待測(cè)。采用日立7600全自動(dòng)生化儀的電解質(zhì)分析模塊，用所配標(biāo)準(zhǔn)液定標(biāo)，測(cè)定各配質(zhì)控品，結(jié)果處于質(zhì)控?cái)?shù)值范圍內(nèi)。通過離子選擇電極法(ISE)測(cè)定Na+、K+、Cl-濃度，再通過換算得到各組大鼠的Na+、K+、Cl-排出量。

2.2.5 血尿素氮含量測(cè)定 末次給藥后，取血，室溫靜置30 min，3000 r·min-1離心15 min，制備血清，按照尿素氮試劑盒說明書操作步驟測(cè)定尿素氮。

2.2.6 碳酸酐酶的測(cè)定 將大鼠處死后，解剖，取左腎的髓部，用0.9%氯化鈉溶液洗凈，吸干水分稱重，按照1∶9加入0.9%氯化鈉溶液，于組織勻漿機(jī)制作勻漿，3000 r·min-1離心20 min，吸取上清液，-20℃保存，待測(cè)CA。按照CA Elisa試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行測(cè)定。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 不同劑量白術(shù)水煎液對(duì)大鼠利尿作用結(jié)果

由表1知，與空白對(duì)照組相比，白術(shù)1、3倍劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而白術(shù)6倍劑量組在0～3 h內(nèi)尿量顯著性降低(P<0.05)，該結(jié)果提示白術(shù)6倍水煎液有一定的抗利尿作用。

3.2 白術(shù)拆分組分對(duì)大鼠利尿作用結(jié)果

由表2可知，與空白對(duì)照組相比，白術(shù)6倍揮發(fā)油組在0～3h及6 h內(nèi)總尿量均顯著降低(P<0.01)；該結(jié)果提示白術(shù)6倍揮發(fā)油組分對(duì)大鼠有一定抗利尿作用；其余各白術(shù)6倍拆分組分組在0～3、3～6 h及總尿量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表1 不同劑量白術(shù)水煎液對(duì)大鼠利尿作用結(jié)果 /mL

注：與空白對(duì)照相比，*P<0.05，**P<0.01；下同。

表2 白術(shù)拆分組分對(duì)大鼠利尿作用結(jié)果 /mL

3.3 白術(shù)拆分組分對(duì)紅細(xì)胞和腎髓中Na+-K+-ATP酶活力的影響

由圖1知，與空白對(duì)照相組比，白術(shù)及其各拆分組中大鼠的紅細(xì)胞和腎髓中Na+-K+-ATP酶活力無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

圖1 白術(shù)拆分組分對(duì)紅細(xì)胞和腎髓Na+-K+-ATP酶活力的影響

3.4 白術(shù)拆分組分對(duì)大鼠尿液6 h內(nèi)Na+、K+、Cl-排出量的影響

由圖2知，與空白對(duì)照組相比，在K+排量上，白術(shù)6倍粗多糖組顯著增加(P<0.05)，白術(shù)6倍劑量組顯著增加(P<0.01)；在Na+排量上，白術(shù)6倍揮發(fā)油組顯著增加(P<0.05)，白術(shù)6倍劑量組、白術(shù)6倍樹脂水洗組和白術(shù)6倍粗多糖組顯著增加(P<0.01)；在Cl-排量上，白術(shù)石油醚組、白術(shù)6倍樹脂水洗組和白術(shù)6倍粗多糖組顯著增加(P<0.05)，白術(shù)6倍劑量組顯著增加(P<0.01)；在Na+/K+上，白術(shù)6倍揮發(fā)油組顯著增加(P<0.05)。

圖2 白術(shù)拆分組分對(duì)大鼠尿液6 h內(nèi)Na+、K+、Cl-排出量的影響

3.5 白術(shù)拆分組分對(duì)血清中尿素氮的影響

由圖3知，與空白對(duì)照組相比，白術(shù)及其各拆分組對(duì)大鼠血液中尿素氮含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，該結(jié)果提示白術(shù)及其拆分組分對(duì)大鼠腎小球?yàn)V過功能無明顯影響。

3.6 白術(shù)拆分組分對(duì)腎髓中CA水平的影響

由圖4知，與空白對(duì)照相組比，白術(shù)及各拆分組分組中大鼠腎髓中碳酸酐酶濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

圖3 白術(shù)及其拆分組分對(duì)血清中尿素氮的影響

圖4 白術(shù)拆分組分對(duì)大鼠CA水平的影響

4 討論

白術(shù)為常用中藥，素有“十方九用”、“南術(shù)北參”之稱。作者以大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究表明連續(xù)灌胃給藥時(shí)，相當(dāng)于生藥1.2 g·kg-1(相當(dāng)于臨床成人用藥1倍量)和3.6 g·kg-1白術(shù)水煎液組中大鼠排尿量無顯著變化，而相當(dāng)于生藥7.2 g·kg-1白術(shù)水煎液組中大鼠尿量顯著降低。該結(jié)果提示高劑量白術(shù)(7.2 g·kg-1)對(duì)正常大鼠有一定的抗利尿作用。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了施文榮等[6]報(bào)道的白術(shù)低、高劑量水煎液連續(xù)給藥時(shí)對(duì)小鼠有一定的抗利尿作用。我們進(jìn)一步研究了白術(shù)高劑量(7.2 g·kg-1)下各拆分組分的利尿作用，以探究白術(shù)利尿作用的有效物質(zhì)。結(jié)果尚未證實(shí)如陳敏珠等[5]報(bào)道的白術(shù)利尿作用的有效成分可能為兩部分，一部分為脂溶性的揮發(fā)油，一部分為水溶性的有機(jī)物，相反作者發(fā)現(xiàn)白術(shù)揮發(fā)油對(duì)正常大鼠有一定的抗利尿作用。

Na+-K+-ATP酶是對(duì)細(xì)胞內(nèi)外鈉和鉀離子進(jìn)行交換的酶，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)Na+、K+濃度的相對(duì)恒定、保持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境適當(dāng)?shù)臐B透壓平衡等具有重要意義。紅細(xì)胞Na+-K+-ATP酶活力和腎髓Na+-K+-ATP酶活力測(cè)定結(jié)果研究表明白術(shù)及其拆分組分對(duì)Na+-K+-ATP酶活力沒有顯著影響，提示白術(shù)并非通過抑制Na+與K+交換從而影響細(xì)胞內(nèi)外滲透壓產(chǎn)生抗利尿作用。尿液的形成包括腎小球?yàn)V過、腎小管和集合管的重吸收及分泌。筆者對(duì)血中尿素氮濃度測(cè)定結(jié)果表明白術(shù)及其拆分組分對(duì)腎小球的濾過率無顯著影響。碳酸酐酶主要作用為H+-Na+交換，碳酸酐酶抑制時(shí)H+排出量減少，Na+量排出量增多而產(chǎn)生利尿作用。腎髓碳酸酐酶濃度檢測(cè)結(jié)果表明白術(shù)及其拆分組分對(duì)碳酸酐酶濃度無顯著影響。同時(shí)我們對(duì)各組大鼠6 h內(nèi)Na+、K+、Cl-排出量進(jìn)行了檢測(cè)，鑒于白術(shù)及其拆分組分對(duì)大鼠6 h內(nèi)尿量作用結(jié)果顯示白術(shù)6倍劑量組和揮發(fā)油組呈現(xiàn)抗利尿作用，因此我們主要討論白術(shù)6倍劑量組和揮發(fā)油組Na+、K+、Cl-排出量與空白對(duì)照組和陽性對(duì)照組的差別。氫氯噻嗪為Na+-Cl-同向轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑，主要作用于遠(yuǎn)曲小管近端的Na+-Cl-同向轉(zhuǎn)運(yùn)體，減少Na+、Cl-的重吸收，主要的利尿機(jī)制為增加尿鈉、鉀、氯等離子排泄，這一點(diǎn)在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也得到證實(shí)。白術(shù)6倍劑量對(duì)Na+、K+、Cl-排出量顯著增加，與氫氯噻嗪相比，其白術(shù)6倍量對(duì)K+排出量作用更強(qiáng)。揮發(fā)油組分對(duì)Na+排出量顯著增加，而K+、Cl-排出量無明顯影響，與氫氯噻嗪相比，在Na+/K+比值上作用更強(qiáng)。由此我們可知白術(shù)6倍量和揮發(fā)油與氫氯噻嗪對(duì)大鼠Na+、K+、Cl-排出量具有一定相似性，都能促進(jìn)電解質(zhì)的排泄，且揮發(fā)油能顯著增加Na+/K+比值，但白術(shù)水煎液和揮發(fā)油組分藥理作用表現(xiàn)為抗利尿作用而非利尿作用；這可能與白術(shù)藥理作用較多有關(guān)，雖對(duì)機(jī)體電解質(zhì)具有一定促進(jìn)作用，但并非通過促進(jìn)電解質(zhì)排泄產(chǎn)生利尿或抗利尿作用。以上結(jié)果我們可推斷白術(shù)的抗利尿作用并非通過影響Na+-K+-ATP酶的活性、尿液的生成和電解質(zhì)的排泄而實(shí)現(xiàn)，可能是通過調(diào)節(jié)消化液的分泌、胃腸運(yùn)動(dòng)、消化道水的吸收、糞便排泄等其他間接途徑實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本文首次對(duì)白術(shù)各拆分組分的利尿作用研究，尚未證實(shí)白術(shù)的利尿作用，相反得出白術(shù)對(duì)正常大鼠有一定的抗利尿作用，且首次研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)揮發(fā)油有一定的抗利尿作用；白術(shù)抗利尿作用的相關(guān)機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

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StudyonDiureticEffectofAtractylodisMacrocephalaeRhizoma

CHEN Jing,SUNYunchao，RANXiaoku，YUANYing,DOUDeqiang*

(CollegeofPharmacy,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Dalian116600,China)

Objective:To study the diuretic effect of the Atractylodis macrocephalae rhizoma and its fractions.Methods:Multi-mode separation methods were adopted to split the components of Atractylodis macrocephalae rhizoma.The indictor of urine excretion in 6 h was used to study the diuretic effect of Atractylodis macrocephalae rhizoma and its splitted fractions in the water loaded rats.Further, the activity of Na+-K+-ATPase in red cell and renal medulla, the level of carbonic anhydrase in renal medulla and the output of Na+, K+, Cl-in urinewere measured to elucidate the related mechanization.Results:The anti-diuretic effect was observed in the high dosage of Atractylodis macrocephalae rhizoma water decoction and volatile oil fraction groups. Versus the control group, the activity of Na+-K+-ATPase in red cell and renal medulla and the level of carbonic anhydrase in renal medulla were not significantly changed in Atractylodis macrocephalae rhizoma water decoction and its fractions groups.Conclusion:The diuretic effect of Atractylodis macrocephalae rhizoma was not observed, instead, the weak antidiuretic effect was presented and it is for the first time that antidiuretic effect of Atractylodis macrocephalae rhizoma volatile oilwas found.

Atractylodis macrocephalae rhizoma; splitted fraction; dieresis

2015-07-05)

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(973計(jì)劃)(2013CB531803)；2013遼寧省高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)課題(LT2013020)

*

竇德強(qiáng)，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向：中藥化學(xué)；Tel：(0411) 87406497，E-mail：deqiangdou@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.005