孫常磊，王召平，孫兆林，耿巖玲，李佳，楊鵬

(1.山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東 濟南 250355；2.山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；3.濟南三峰生物工程有限責任公司，山東 濟南 250014)

pH區(qū)帶逆流色譜結(jié)合制備液相分離制備大黃根化學成分△

孫常磊1，2，王召平1，孫兆林1，耿巖玲2*，李佳1，楊鵬3

(1.山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東 濟南 250355；2.山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；
3.濟南三峰生物工程有限責任公司，山東 濟南 250014)

目的：運用pH區(qū)帶逆流色譜和制備液相分離制備大黃根的化學成分。方法：本研究以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶1)作為溶劑系統(tǒng)，上相加入10 mmol·L-1三氟乙酸(TFA)作為固定相，下相加入20 mmol·L-1NaOH作為流動相，轉(zhuǎn)速為850 r·min-1，流速為2 mL·min-1，檢測波長為254 nm，進行初步分離；尾吹液經(jīng)制備液相進一步分離。結(jié)果：從750 mg大黃根粗提物中經(jīng)一次pH區(qū)帶逆流色譜分離得到反式桂皮酸(2) 85.8 mg和3個蒽醌類化合物：大黃酸(1)34.9 mg，蘆薈大黃素(3)52.5 mg和大黃素(4)50.4 mg；經(jīng)制備液相分離得到大黃酚(5)215.4 mg和大黃素甲醚(6)26.8 mg。經(jīng)HPLC分析，其純度分別為95.46%、97.28%、94.75%、95.02%、98.84%、98.12%。結(jié)論：大黃根中的化學成分具有有機酸的性質(zhì)，可以運用pH區(qū)帶逆流色譜進行分離，特別是與制備液相相結(jié)合，實現(xiàn)了不同酸性強度化合物的快速制備分離。

pH區(qū)帶逆流色譜；制備液相；大黃；化學成分

大黃屬于蓼科(Polygonaceae)大黃屬(Rheum)多年生草本植物?！吨腥A人民共和國藥典》收載了掌葉大黃RheumpalmatumL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim.ex Balf.和藥用大黃RheumofficinaleBaill.。大黃味苦、性寒，歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)。具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃之功效[1]。其主要藥效成分包括大黃素(emodin)、大黃素甲醚(physcion)、蘆薈大黃素(aloe-emodin)、大黃酚(chrysophanol)、大黃酸(rhein)等1，8-二羥基蒽醌類衍生物[2]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，大黃還具有保肝、利膽、強心、降壓、抗腫瘤、抗高脂血癥、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基等功能[3-4]。鑒于大黃生物活性的多樣性和藥物來源復雜性，建立一種高效的分離大黃根中藥效成分的方法，對于闡明其生物活性和作用機制，以及制訂大黃質(zhì)量控制標準都具有十分重要的意義。本研究建立了pH區(qū)帶逆流色譜結(jié)合制備液相分離制備大黃根中化學成分的方法。經(jīng)一次分離，得到6個高純度化合物，即反式桂皮酸、大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TBE-300B高速逆流色譜儀(上海同田生物技術有限公司)，該分離系統(tǒng)包括多層聚四氟乙烯螺旋管(直徑2.6 mm，分離體積300 mL)、TBP5002泵、8823B紫外檢測器(北京賓達英創(chuàng)科技有限公司)和3057-11記錄儀(重慶川儀總廠有限公司)；Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng)(配有光電二極管陣列檢測器(PDA)和自動進樣裝置，美國Waters公司)；普源高效液相色譜系統(tǒng)(配有紫外檢測器，北京普源精電科技有限公司)。

1.2 材料

石油醚、乙酸乙酯、甲醇、三氟乙酸(TFA)和氫氧化鈉等均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)，溶解和pH區(qū)帶逆流色譜溶劑系統(tǒng)用水為去離子水；高效液相色譜和制備液相色譜用甲醇為色譜純(山東禹王實業(yè)有限公司)，流動相的水為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

大黃藥材購于甘肅省，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學李佳教授鑒定為蓼科(Polygonaceae)大黃屬(Rheum)植物掌葉大黃RheumpalmatumL.的干燥根。

2 方法

2.1 總蒽醌制備

1.0 kg大黃根粉末，用20% H2SO4和三氯甲烷按體積比1∶5混合，加熱回流提取3次，每次提取2 h。過濾并合并提取液，減壓回收溶劑得到粗提物。將三氯甲烷粗提物用等體積5% NaOH溶液萃取3次，合并萃取液用20% H2SO4調(diào)節(jié)pH為2左右，將酸化后的溶液用三氯甲烷萃取3次，減壓回收三氯甲烷得大黃根的粗提物約30 g，用于pH區(qū)帶逆流色譜分離[5]。

2.2 兩相溶劑系統(tǒng)和樣品溶液的制備

pH區(qū)帶逆流色譜的溶劑系統(tǒng)為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶1)，總體積為2 L，按比例將各種溶劑置于分液漏斗中混合，震蕩后充分靜置使其分層。使用之前分取上下相，其中上相中加入10 mmol·L-1TFA作為固定相，下相中加入20 mmol·L-1NaOH作為流動相，超聲除去氣泡，備用。

取750 mg大黃根的粗提物，用加入TFA的上相和不加NaOH的下相各10 mL超聲溶解作為樣品溶液。

2.3 分離和鑒定

2.3.1 pH區(qū)帶逆流色譜分離過程 上相(固定相)以20 mL·min-1的流速高速注入高速逆流色譜儀的螺旋管中，待出口流出一定量的液體(約50 mL)，將上述溶解好的樣品溶液從進樣圈注入到高速逆流色譜儀中，啟動儀器，將轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)為850 r·min-1，待轉(zhuǎn)速穩(wěn)定后，以2 mL·min-1的流速泵入流動相，同時開啟檢測器和記錄儀，檢測器的檢測波長設置為254 nm，待有組分從出口流出時開始手動收集餾分，平均每5 min收集1管，待分離結(jié)束，用壓縮空氣吹出螺旋管中的液體，計算固定相的保留率。

2.3.2 制備液相色譜分離過程 pH區(qū)帶逆流色譜的尾吹液經(jīng)減壓濃縮后，用適量的甲醇溶解，樣品濃度約為30 mg·mL-1，根據(jù)大黃根粗提物的HPLC分析條件確定尾吹液中混合組分的制備液相條件：色譜柱為YMC-Pack ODS-A(250 mm ×10 mm，5 μm)，甲醇-水(85∶15)為流動相，流速為3 mL·min-1，柱溫為25 ℃，檢測波長為254 nm，進樣體積為250 μL，制備得到高純度的大黃酚和大黃素甲醚。

2.3.3 HPLC分析和結(jié)構(gòu)鑒定 大黃根粗提物以及經(jīng)pH區(qū)帶逆流色譜和制備液相分得的各組分分別用HPLC進行分析。色譜柱為YMC-Pack ODS-A(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長為254 nm；流動相為甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫[0～20 min，60%～100%(A)，20～30 min，100%～100%(A)]；流速為1.0 mL·min-1；進樣量為20 μL。pH區(qū)帶逆流色譜和制備液相色譜所分得的各組分的化學結(jié)構(gòu)根據(jù)ESI-MS和1H-NMR譜學數(shù)據(jù)進行鑒定。

3 結(jié)果與討論

3.1 HPLC條件的優(yōu)化

本研究考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液等作為流動相時，大黃根粗提物中各成分的分離效果。經(jīng)測試發(fā)現(xiàn)，當采用甲醇-水進行梯度洗脫[0～20 min，60%～100%(A)；20～30 min，100%～100%(A)]；流速為1.0 mL·min-1時，各成分能夠?qū)崿F(xiàn)基線分離，如圖1所示。

注：1.大黃酸；2.反式桂皮酸；3.蘆薈大黃素；4.大黃素；5.大黃酚；大黃素甲醚。圖1 大黃根粗提物的HPLC圖

pH區(qū)帶逆流色譜溶劑系統(tǒng)的選擇不僅要求能夠提供合適的KD值，而且要求對樣品有較好的溶解性[6]。根據(jù)本實驗室的分離經(jīng)驗[7]，結(jié)合大黃化學成分的極性和溶解性，本研究選擇石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水作為溶劑系統(tǒng)。另外，考慮到蒽醌類化合物的弱酸性，需要用強堿作為洗脫堿，因此，選用TFA作為保留酸，NaOH作為洗脫堿進行分離。我們考察了如下幾個溶劑系統(tǒng)：①石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶1)，上相加10 mmol·L-1TFA，下相加10 mmol·L-1NaOH；②石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶1)，上相加10 mmol·L-1TFA，下相加20 mmol·L-1NaOH；③石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶5∶5)，上相加10 mmol·L-1TFA，下相加10 mmol·L-1NaOH；④石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶5∶5)；上相加10 mmol·L-1TFA，下相加20 mmol·L-1NaOH。相比較而言，溶劑系統(tǒng)②和溶劑系統(tǒng)④能夠提供較為合適的KD值。經(jīng)實驗測試發(fā)現(xiàn)，溶劑系統(tǒng)④并沒有體現(xiàn)出較好的分離效果，反而增加了分離的時間，而溶劑系統(tǒng)②能夠在較短的時間內(nèi)完成分離，且分離效果沒有太大差別，綜合考慮選擇溶劑系統(tǒng)②[石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶1)，上相加10 mmol·L-1TFA，下相加20 mmol·L-1NaOH]進行大黃根中化學成分的分離。經(jīng)一次分離，從750 mg大黃根粗提物中分離得到反式桂皮酸(2)85.8 mg和3個蒽醌類化合物：大黃酸(1)34.9 mg，蘆薈大黃素(3)52.5 mg和大黃素(4)50.4 mg，分離效果如圖2所示。

圖2 大黃根粗提物的pH區(qū)帶逆流色譜圖

3.2 制備HPLC條件的優(yōu)化

根據(jù)3.1中選定的分析條件，分別考察了甲醇-水(80∶20)、甲醇-水(85∶15)和甲醇-水(90∶10)3個比例的流動相條件，經(jīng)測試發(fā)現(xiàn)，當甲醇-水(85∶15)時，分離效果較好，能夠?qū)崿F(xiàn)基線分離且進樣量可以擴大到250 μL，制備效果如圖3所示。

圖3 pH區(qū)帶逆流色譜尾吹組分的制備液相分析圖

3.3 化合物的純度檢測

利用優(yōu)化好的液相色譜條件對分得的各組分(反式桂皮酸、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚)進行檢測，純度分別為95.46%、97.28%、94.75%、95.02%、98.84%、98.12%，分析結(jié)果及相應的結(jié)構(gòu)式如圖4所示。

3.4 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：ESI-MSm/z：283[M-H]-；1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：7.36(1H，d，J=8.0 Hz，H-7)，7.69(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，7.78(1H，dd，J=8.0 Hz，8.0 Hz，H-6)，7.68(1H，s，H-2)，8.05(1H，s，H-4)。以上數(shù)據(jù)和文獻[5]報道的基本一致，確定化合物1為大黃酸。

圖4 從大黃根中分離得到化合物的HPLC圖

化合物2：ESI-MSm/z：147[M-H]-；1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：7.82(1H，d，J=16.0 Hz，H-7)，6.44(1H，d，J=16.0 Hz，H-8)，7.58(2H，m，H-2，H-6)，7.42(3H，m，H-3，H-4，H-5)。以上數(shù)據(jù)和文獻[8]報道的基本一致，確定化合物2為反式桂皮酸。

化合物3：ESI-MSm/z：269[M-H]-；1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：4.71(2H，s，-CH2-OH)，7.32(1H，d，J=8.0 Hz，H-7)，7.78(1H，d，J=6.0 Hz，H-5)，7.73(1H，dd，J=8.0，6.0 Hz，H-6)，7.82(1H，s，H-4)，7.37(1H，s，H-2)。以上數(shù)據(jù)和文獻[5]報道的基本一致，確定化合物3為蘆薈大黃素。

化合物4：ESI-MSm/z：269[M-H]-；1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：2.42(3H，s，-CH3)，6.59(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)，7.26(1H，d，J=2.0 Hz，H-4)，7.07(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，7.52(1H，d，J=2.0 Hz，H-5)。以上數(shù)據(jù)和文獻[5]報道的基本一致，確定化合物4為大黃素。

化合物5：ESI-MSm/z：253[M-H]-；1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：2.45(3H，s，-CH3)，7.12(1H，s，H-2)，7.63(1H，s，H-4)，7.31(1H，d，J=8.0 Hz，H-7)，7.64(1H，dd，J=8.0，8.0 Hz，H-6)，7.80(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)。以上數(shù)據(jù)和文獻[5]報道的基本一致，確定化合物5為大黃酚。

化合物6：ESI-MSm/z：283[M-H]-；1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：2.45(3H，s，-CH3)，3.92(3H，s，-OCH3)，6.71(1H，d，J=2.4 Hz，H-7)，7.12(1H，s，H-2)，7.31(1H，d，J=2.4 Hz，H-5)，7.64(1H，s，H-4)，7.80(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)。以上數(shù)據(jù)和文獻[9]報道的基本一致，確定化合物6為大黃素甲醚。

4 小結(jié)

本研究應用pH區(qū)帶逆流色譜技術分離出大黃根中酸性較強的化合物(反式桂皮酸、大黃酸、蘆薈大黃素和大黃素)；對于酸性較弱的化合物(大黃酚和大黃素甲醚)，通過制備HPLC進行了分離。從而實現(xiàn)了pH區(qū)帶逆流色譜與制備HPLC的結(jié)合，建立了一種快速、高效制備分離大黃根中化學成分的方法。這種結(jié)合技術同樣適合其他類化合物的分離與制備。

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SeparationandPurificationofAnthraquinonesfromRootofRheumpalmatumL.bypH-Zone-refiningCounter-currentChromatographyandPreparativeHPLC

SUN Changlei1，2，WANGZhaoping1，SUNZhaolin1，GENGYanling2*，LIJia1，YANGPeng3

(1.CollegeofPharmacy，ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China；2.ShandongAnalysisandTestCenter，Jinan250014，China；3.SanfengBiologicalEngineeringTechnologyCo.Ltd.，Jinan250014，China)

Objective：To separate and purify the compounds from the root ofRheumpalmatumL. by pH-zone-refining counter-current chromatography and preparative HPLC.Methods：The solvent system used in this separation was petroleum-ether-ethyl acetate-methanol-water (1∶1∶1∶1). 10 mmol·L-1TFA was added to the upper phase as stationary phase and 20 mmol·L-1NaOH was added to the lower phase as mobile phase. The revolution speed is 850 r·min-1and the flow rate is 2 mL·min-1. The effluent was continuously monitored by a UV monitor at 254 nm. The make-up fluid was further separated by preparative HPLC.Results： From 750 mg extract ofRh.palmatumL. root, 85.8 mg cinnamic acid (2) and three anthraquinones 34.9 mg rhein (1), 52.5 mg aloe-emodin (3) and 50.4 mg emodin (4) were obtained in a single run. And 215.4 mg of chrysophanol and 26.8 mg of physcion were obtained by the preparative HPLC. The purities of these compounds are 95.46%, 97.28%, 94.75%, 95.02%, 98.84% and 98.12% analyzed by HPLC.Conclusion：The compounds ofRh.palmatumL. root as weakly acidic compounds could be separated by pH-zone-refining counter-current chromatography. When combined with the preparative HPLC, an efficient method has been established for the separation of these compounds.

pH-Zone-refining counter-current chromatography; preparative HPLC;RheumpalmatumL.; compounds

2015-07-07)

山東省科技發(fā)展計劃項目(2014GZX219003)

*

耿巖玲，副研究員，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)；Tel：(0531)82605319，E-mail：gengyanling@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.003