劉青，賴杰仁，付輝政，王棟*

(1.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；3.九江市中醫(yī)院，江西 九江 332000)

·中藥工業(yè)·

活血復(fù)脈丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

劉青1，2，賴杰仁3，付輝政1，王棟1*

(1.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；3.九江市中醫(yī)院，江西 九江 332000)

目的：建立活血復(fù)脈丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法鑒別活血復(fù)脈丸中丹參、三七、延胡索；采用高效液相色譜法測(cè)定丹酚酸B的含量。結(jié)果：薄層鑒別色譜中特征斑點(diǎn)明顯，重復(fù)性較好。丹酚酸B在0.202 0～4.040 0 μg呈良好的線性關(guān)系，丹酚酸B的平均回收率為101.4% (n=6)，RSD=0.7% (n=6)。結(jié)論：通過研究建立了活血復(fù)脈丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

活血復(fù)脈丸；丹酚酸B；薄層色譜法；高效液相色譜法；質(zhì)量控制

活血復(fù)脈丸由丹參、三七、延胡索等八味中草藥組成，為九江市中醫(yī)院在多年治療心腦血管病臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上研制而成的心腦血管科協(xié)定處方。因其臨床療效較滿意，為便于臨床使用，故進(jìn)一步制成濃縮丸劑，并申請(qǐng)?jiān)簝?nèi)制劑?；钛獜?fù)脈丸具有活血化瘀、行氣通脈、通絡(luò)止痛的功能。臨床用于冠心病、腦動(dòng)脈硬化腦梗塞、冠狀動(dòng)脈介入手術(shù)(PCI)后再狹窄能防治等。為了有效地控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，保證安全性和有效性，本實(shí)驗(yàn)采用TLC法對(duì)活血復(fù)脈丸中丹參[1-3]、三七[1，4-5]、延胡索[1，6]進(jìn)行定性鑒別研究，并運(yùn)用HPLC法同時(shí)測(cè)定其中丹酚酸B的量[7-8]，為該制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫LC1100高效液相色譜，四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器、安捷倫色譜工作站；電子天平(Sartoris BS110S十萬分之一天平)。

1.2 試藥

活血復(fù)脈丸(九江中醫(yī)院藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為20140401，20140402，20140403，20140404)；丹參對(duì)照藥材、三七對(duì)照藥材、延胡索對(duì)照藥材、丹參酮ⅡA、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、延胡索乙素、丹酚酸B(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為120923-201415，120941-201410，120928-201208，110766200528，110703-201529，110745201318，110726-201213，111562-20154)；乙腈、甲醇為色譜純；水為娃哈哈飲用純凈水；其他試劑均為分析純。

2 薄層色譜鑒別

2.1 丹參薄層鑒別

取本品5 g，加乙醚10 mL，振搖，放置1 h，濾過，藥渣備用，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液[1-3]。另取丹參對(duì)照藥材同法制成對(duì)照藥材溶液。再取丹參酮ⅡA對(duì)照品，加乙酸乙酯制成質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同的暗紅色斑點(diǎn)。見圖1。

注：1.陰性；2、3、4.供試品；5.對(duì)照藥材；6.對(duì)照品。圖1 丹參薄層色譜鑒別

2.2 三七薄層色譜鑒別

取2.1項(xiàng)下備用藥渣，揮干，加甲醇50 mL，超聲處理30 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用水飽和正丁醇提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次60 mL，取正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液[1，4-5]。另取三七對(duì)照藥材0.2 g，加甲醇20 mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。再對(duì)照品加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖2。

注：1.陰性；2、3、4.供試品；5.對(duì)照藥材；6.對(duì)照品。圖2 三七薄層色譜鑒別

2.3 延胡索薄層色譜鑒別

取本品10 g，加甲醇50 mL，超聲處理30 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，加濃氨試液至堿性，用乙醚振搖提取3次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液[1，6]。另取延胡索對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取延胡索乙素對(duì)照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以環(huán)已烷-丙酮-甲醇(4.5∶1∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，置碘缸中約3 min后取出，揮盡板上吸附的碘后，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見圖3。

注：1.陰性；2、3、4.供試品；5.對(duì)照藥材；6.對(duì)照品。圖3 延胡索薄層色譜鑒別

3 丹酚酸B的HPLC含量測(cè)定

3.1 色譜條件

YMCC18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：以甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶5∶1∶64)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長：286 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。在上述色譜條件下，丹酚酸B與其他組分的色譜峰分離度良好。色譜圖見圖4。

注：A.缺丹參陰性對(duì)照溶液；B.丹酚酸B對(duì)照品溶液；C.活血復(fù)脈丸供試品溶液。圖4 HPLC含量測(cè)定色譜圖

3.2 對(duì)照品溶液的制備

取丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備

取本品適量，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[1，7-8]。

3.4 線性關(guān)系考察

取對(duì)照品丹酚酸B 20.20 mg，置100 mL量瓶中，加70%甲醇使溶解并定容，搖勻，得丹酚酸B(0.189 3 mg·mL-1)的對(duì)照品溶液，分別吸取1、2、4、6、8、10、20 μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：Y=506.13X+4.467 9(r=0.999 9)。丹酚酸B進(jìn)樣量在0.202 0～4.040 0 μg與峰面積呈良好線性關(guān)系。

3.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取按3.2項(xiàng)下方法項(xiàng)下方法制備的對(duì)照品溶液10 μL，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果丹酚酸B峰面積的RSD為0.2% (n=6)，表明儀器精密度良好。

3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批活血復(fù)脈丸6份，每份約0.5 g，精密稱定，按3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行分析測(cè)定，丹酚酸B的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.814 1 mg·g-1，RSD為2.1%，表明該方法有良好的重復(fù)性。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得丹酚酸B峰面積的RSD為1.4% (n=6)，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法，精密稱取已知含量(丹酚酸B質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.814 1 mg·g-1)的活血復(fù)脈丸6份，每份約0.25 g，加入甲醇25 mL，超聲提取30 min，精密量取10 mL，每份精密加入含丹酚酸B 0.193 0 mg·mL-1(精密稱取丹酚酸B對(duì)照品20.60 mg，置100 mL量瓶中，加70%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得)的對(duì)照品溶液15 mL，按3.3項(xiàng)下方法制備供試溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行分析測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果丹酚酸B的平均回收率(n=6)為101.4%，RSD為0.7%。見表1。

表1 丹酚酸B回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3.9耐用性試驗(yàn)

取本品照3.1項(xiàng)下方法試驗(yàn)，分別用A：YMC C18(150 mm× 4.6 mm，5 μm)、B：YMC C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、C：waters C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3 種品牌的色譜柱按正文中的色譜條件對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，含量測(cè)定結(jié)果無明顯差別。

3.10 樣品測(cè)定

分別取不同批號(hào)的活血復(fù)脈丸4批，每個(gè)樣品取3份，按3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算出丹酚酸B的含量，測(cè)定結(jié)果見下表2。

表2 活血復(fù)脈丸中丹酚酸B的含量(n=3)

4 討論

4.1 專屬性考察

本實(shí)驗(yàn)選擇的薄層色譜條件下，丹參、三七和延胡索供試品色譜與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同的顏色斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾。

4.2 檢測(cè)波長的選擇

采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)丹酚酸B對(duì)照品色譜峰進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果丹酚酸B在286 nm波長處有最大吸收，由于286 nm雜峰對(duì)目標(biāo)峰干擾少且穩(wěn)定，故選擇286 nm作為檢測(cè)波長。

4.3 提取方法的選擇

比較了甲醇加熱回流提取、甲醇超聲提取2種提取法，結(jié)果表明，超聲提取法提取效率大于加熱回流提取法。實(shí)驗(yàn)過程中比較了提取時(shí)間(30、60、90 min)和甲醇濃度(30%、50%、70%、90%、100%)，結(jié)果表明，提取為30 min可將丹酚酸B完全提取，甲醇濃度為70%時(shí)，提取效率高于其他比例。

4.4 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)通過摸索乙腈與甲酸水溶液、甲醇與甲酸水溶液以及甲醇、乙腈與甲酸水溶液按一定比例混合作為流動(dòng)相，考察其分離度，結(jié)果以甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶5∶1∶64)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃的色譜條件下供試品中丹酚酸B與其他共存組分峰能達(dá)到良好的分離。

本實(shí)驗(yàn)建立了活血復(fù)脈丸中丹酚酸B的HPLC含量測(cè)定方法，并對(duì)方中主要藥味丹參、三七、延胡索進(jìn)行了TLC定性鑒別。結(jié)果表明，所建立的方法操作簡便、結(jié)果可靠、重復(fù)性好。

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InvestigationonQualityStandardofHuoxueFumaiPills

LIUQing1，2，LAIJieren3，F(xiàn)UHuizheng1，WANGDong1*

(1.JiangxiProvincialInstituteforDrugandFoodControl，JiangxiProvincialEngineeringResearchCenterforDrugandMedicalDeviceQuality，Nanchang330029，China；2.JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330004，China；3.JiujiangHaspitalofTraditionalChineseMedicine,Jiujiang332000,China)

Objective：To establish a quality standard of Huoxue Fumai Pills.Methods：SalviamiltiorrhizaBge.，Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen andCorydalisyanhusuoW.T.Wang in Huoxue Fumai Pills were identified by TLC.Salviandic acid B in Huoxue Fumai Pills was determined by HPLC.Results：Characteristic spots could be detected by TLC and the method had good reproducibility.The linear range of salviandic acid B was 0.203 6 ～ 2.850 4 μg (r=0.999 9).The average recovery rate was 101.4% and RSD was 0.7% (n=6).Conclusion：The established method can be used for the quality control of Huoxue Fumai Pills.

Huoxue Fumai Pills；salviandic acid B；TLC；HPLC；quality control

] 王棟，主任藥師，研究方向：中藥活性成分及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究；Tel：(0791)86217386；E-mail：fhzfhz620@sohu.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.11.024

2016-01-04)

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