張洪峰，王樂，張凱，劉燕娟

(1.河北省邯鄲市中心醫(yī)院 藥學(xué)部，河北 邯鄲 056001；2.河北醫(yī)科大學(xué) 第二醫(yī)院 藥學(xué)部，河北 石家莊 050000)

一測多評法測定冀南產(chǎn)柴胡中柴胡皂苷類成分

張洪峰1*，王樂1，張凱2，劉燕娟1

(1.河北省邯鄲市中心醫(yī)院 藥學(xué)部，河北 邯鄲 056001；2.河北醫(yī)科大學(xué) 第二醫(yī)院 藥學(xué)部，河北 石家莊 050000)

一測多評；冀南產(chǎn)柴胡；HPLC；柴胡皂苷；相對校正因子

中藥的質(zhì)量評價(jià)與控制是中藥現(xiàn)代化發(fā)展的關(guān)鍵問題之一，尋找科學(xué)合理的質(zhì)控方法也一直是中藥研究的難點(diǎn)。由于中藥所含成分較多、臨床適用于多種病癥等自身的特點(diǎn)，多成分綜合質(zhì)控模式已成為中藥質(zhì)量評價(jià)和控制研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。多成分分析需要的化學(xué)對照品由于價(jià)格昂貴或難以獲得等多種因素，限制了該方法的推廣。王智民等[1-2]借鑒經(jīng)典的內(nèi)標(biāo)法、校正因子法、主成分自身對照法等方法的優(yōu)勢，建立了“一測多評”(quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS)法，即采用一個(gè)廉價(jià)、有效的對照品，對中藥中多個(gè)成分進(jìn)行含量測定。目前，該方法在《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)標(biāo)準(zhǔn)中有所應(yīng)用[3-5]。

中藥柴胡為使用量較大的大宗中藥之一，其主要活性成分柴胡皂苷類化合物，是質(zhì)量評價(jià)的主要指標(biāo)性成分[6-7]。柴胡皂苷在酸性條件下穩(wěn)定性較差，對照品制備難度較高。冀南產(chǎn)柴胡為柴胡道地藥材，為更好地對其進(jìn)行質(zhì)量控制，本研究以冀南產(chǎn)柴胡為研究對象，以柴胡皂苷a(SSa)為對照品，確定SSa與柴胡皂苷c(SSc)、柴胡皂苷d(SSd)、柴胡皂苷f(SSf)的相對校正因子(relative correction factor，RCF)，建立了一測多評法測定其中4種柴胡皂苷的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀：島津LC-15C泵，SPD-15C型紫外檢測器、SIL-10AF自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-15C柱溫箱、島津高效液相色譜LC工作站；電子分析天平：TB-215、BSA224S-CW(德國 塞多利斯)，Heal Force SMART-N純水機(jī)(香港力康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán))。

1.2 試藥

柴胡皂苷a對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110777-201309)、柴胡皂苷d對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110778-201409)；柴胡皂苷c對照品(成都曼思特生物科技有限公司，純度：98.8%)；柴胡皂苷f對照品(南京森貝伽生物科技有限公司，純度：97.6%)；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

冀南產(chǎn)柴胡采自河北南部地區(qū)，經(jīng)本文第一作者鑒定為BupleurumchinenseDC.的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：島津Wondasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-水(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～20 min，35%→40% A；20～40 min，40%→63% A；40～45 min，63%→35% A；45～60 min，35% A)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃，檢測波長：210 nm。進(jìn)樣體積：20 μL。理論板數(shù)按柴胡皂苷a峰計(jì)算應(yīng)不低于10 000。色譜圖見圖1。

2.2 柴胡皂苷混合對照品溶液的制備

取柴胡皂苷a、c、d、f對照品適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每l mL含柴胡皂苷a 0.513 mg、柴胡皂苷c 0.382 mg、柴胡皂苷d 0.426 mg、柴胡皂苷f 0.408 mg的溶液，搖勻，作為柴胡皂苷混合對照品儲備液。分別精密量取上述儲備液0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，作為柴胡皂苷不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取本品粉末(過四號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入含5%濃氨試液的甲醇溶液25 mL，密塞，超聲處理30 min，濾過，用甲醇20 mL分2次洗滌容器及藥渣，洗液與濾液合并，回收溶劑至干。殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取不同濃度柴胡皂苷混合對照品溶液各20 μL，進(jìn)樣測定，以進(jìn)樣量(X)與峰面積(Y)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)回歸得柴胡皂苷a、c、d、f的回歸方程分別為：Ya=7.545 2×105Xa+8.274 6×102，r=0.999 7；Yc=5.538 4×105Xc+1.230 1×103，r=0.999 8；Yd=7.215 6×105Xd+1.002 1×103，r=0.999 6；Yf=7.986 7×105Xf+1.356 7×103，r=0.999 5。胡皂苷柴a、c、d、f分別在0.021～0.513、0.015～0.382、0.017～0.426、0.016～0.408 μg線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一柴胡皂苷混合對照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄柴胡皂苷a、c、d、f的峰面積，計(jì)算各對照品RSD分別為0.78%、1.12%、0.98%、1.09%，表明所用儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一冀南產(chǎn)柴胡供試品溶液20 μL，分別于0、2、4、8、12、18、24 h進(jìn)樣，記錄柴胡皂苷a、c、d、f峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果各對照品峰面積的RSD分別為1.25%、1.56%、1.72%、1.59%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按照2.3項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，分別精密吸取20 μL注入高效液相色譜儀，測定柴胡皂苷a、c、d、f峰面積。結(jié)果各成分含量的RSD值分別為1.29%、1.02%、1.15%，1.57%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.4.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取同一批樣品6份，每份約0.25 g，精密稱定，按樣品含量的100%的量加入相應(yīng)比例的對照品，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定并計(jì)算柴胡皂苷a、c、d、f的加樣回收率及RSD。結(jié)果各成分回收率分別為99.78%、102.56%、101.91%、98.68%，RSD分別為1.44%、1.25%、1.76%、1.57%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.5 校正因子確定及其耐用性試驗(yàn)

2.5.1 校正因子確定 取2.2項(xiàng)下不同濃度柴胡皂苷混合對照溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，測定柴胡皂苷a、c、d、f峰面積。參照王智民等提出相對校正因子計(jì)算公式計(jì)算待評價(jià)成分柴胡皂苷c(SSc)、柴胡皂苷d(SS d)、柴胡皂苷f(SSf)與內(nèi)參物柴胡皂苷a(SSa)間的相對校正因子[1]，結(jié)果見表1。

2.5.2 不同色譜柱考察 采用Shimadzu LC-15C高效液相色譜儀，考察了不同品牌色譜柱對柴胡皂苷相對校正因子的影響，結(jié)果表明SSc、SSd、SSf與內(nèi)參物SSa間的相對校正因子重現(xiàn)性良好(RSD<5%)，見表2。

2.5.3 不同儀器考察 采用Wondasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，考察了3種不同品牌高效液相色譜儀對柴胡皂苷相對校正因子的影響，結(jié)果表明SSc、SSd、SSf與內(nèi)參物SSa間的相對校正因子重現(xiàn)性良好(RSD<5%)，見表3。

表3 不同儀器對相對校正因子的影響

2.5.4 柱溫微小變化考察 采用Shimadzu LC15C高效液相色譜儀和Wondasil C18色譜柱，考察不同柱溫(30、35、40 ℃)對柴胡皂苷相對校正因子的影響，結(jié)果SSc、SSd、SSf與內(nèi)參物SSa間的相對校正因子重現(xiàn)性良好(RSD<5%)，見表4。

表4 不同柱溫對相對校正因子的影響

2.5.5 流速微小變化考察 采用Shimadzu LC15C高效液相色譜儀和Wondasil C18色譜柱，考察不同流速(0.9、1.0、1.1 mL·min-1)對柴胡皂苷相對校正因子的影響，結(jié)果SSc、SSd、SSf與內(nèi)參物SSa間的相對校正因子重現(xiàn)性良好(RSD<5%)，見表5。

表5 不同流速對相對校正因子的影響

2.5.6 檢測波長考察 采用Shimadzu LC15C高效液相色譜儀和Wondasil C18色譜柱，考察不同檢測波長(206、208、210、212、214 nm)對柴胡皂苷相對校正因子的影響，結(jié)果SSc、SSd、SSf與內(nèi)參物SSa間的相對校正因子重現(xiàn)性良好(RSD<5%)，見表6。

表6 不同檢測波長對相對校正因子的影響

2.6 QAMS法與外標(biāo)法測定結(jié)果比對

采用QAMS法及外標(biāo)法對所收集的12批冀南產(chǎn)柴胡中4種柴胡皂苷含量進(jìn)行測定并比較，驗(yàn)證所建立的QAMS法用于柴胡皂苷類成分質(zhì)量評價(jià)的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，與外標(biāo)法相比，QAMS法測得的柴胡皂苷類成分含量無明顯差異，表明所建立的方法可信度較高，見表7。采用SPSS 19.0軟件對QAMS法與外標(biāo)法得到的柴胡藥材SSc、SSd和SSf含量進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果表明兩種方法測得含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表7 冀南產(chǎn)柴胡4種柴胡皂苷含量測定結(jié)果 (%)

3 討論

柴胡皂苷a是柴胡中主要的有效成分[8]，對照品較容易獲得且來源有保證，選為內(nèi)參物，使得所建立QAMS法更容易推廣使用。課題組在前期冀南產(chǎn)柴胡指紋圖譜研究中，通過方法學(xué)及耐用性考察確定相對保留時(shí)間值tSSc/SSa=0.410、tSSd/SSa=1.656、tSSf/SSa=0.454，本研究采用相對保留時(shí)間對SSc、SSd和SSf色譜峰定位。本研究結(jié)果表明采用QAMS法與外標(biāo)法測定4種柴胡皂苷無顯著差異，說明本實(shí)驗(yàn)所得的SSa對SSc、SSd和SSf的相對校正因子具有普遍適用性。在本實(shí)驗(yàn)條件下，通過SSa對照品可同時(shí)測定4種柴胡皂苷含量，操作簡便、費(fèi)用較低，可在柴胡藥物制品中推廣應(yīng)用。

QAMS法是將內(nèi)標(biāo)法結(jié)合中藥指紋圖譜提出的含量測定方法，也是2015年版《中國藥典》品種修訂中重點(diǎn)推廣的技術(shù)[9]。建立QAMS法關(guān)鍵是考察在同一色譜條件下，供試品色譜峰的數(shù)量及保留時(shí)間受儀器、色譜柱填料及流動(dòng)相系統(tǒng)等多種因素影響，其中對各檢測成分峰準(zhǔn)確定位是核心問題。QAMS法作為一種較新的含量測定方法，在不同中藥的應(yīng)用及相對較正因子與所測化合物結(jié)構(gòu)之間的關(guān)聯(lián)等問題仍需深入研究。

[1] 王智民，錢忠直，張啟偉，等.一測多評法建立的技術(shù)指南[J].中國中藥雜志，2011，36(6)：657-658.

[2] 趙倩，馮偉紅，張啟偉，等.“一測多評”法用于梔子金花丸多成分含量測定的可行性研究[J].中國中藥雜志，2014，39(10)：1826-1833.

[3] 馮偉紅，楊菲，王智民，等.一測多評法與外標(biāo)法測定雙黃連制劑中黃酮類成分含量的比較分析[J].中國藥學(xué)雜志，2012，47(20)：1665-1669.

[4] 王超群，賈秀虹，陳季，等.中藥三七“一測多評”質(zhì)量控制方法的系統(tǒng)研究[J].中國中藥雜志，2012，37(22)：3438-3445.

[5] 陳靜，王淑美，孟江，等.一測多評法測定苦參中5 種生物堿的含量[J].中國中藥雜志，2013，38(9)：1406-1410.

[6] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：280.

[7] 張國松，張馨予，封傳華，等.高效液相色譜-紫外檢測法同時(shí)測定北柴胡中柴胡皂苷a、b2、c、d、f含量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2014，21(5)：74-77.

[8] 黃偉，孫蓉.柴胡皂苷類成分化學(xué)與藥理和毒理作用研究進(jìn)展[J].中藥藥理與臨床，2010，26(3)：71-74.

[9] 王鈺瑩，馮偉紅，楊菲，等.“一測多評”法測定三黃片中的大黃蒽醌類成分[J].中國中藥雜志，2012，37(2)：212-217.

DeterminationofFourSaikosaponinsinBupleurumchinenseofSouthHebeiProvincebyQAMS

ZHANG Hongfeng1*，WANGLe1，ZHANGKai2，LIUYanjuan1

(1.DepartmentofPharmacy，HandanCentralHospital，Handan056001，China；2.DepartmentofPharmacy，TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shajiazhuang050000，China)

Objective：To establish a quality evaluation method，quantitative analysis of multi-component with a single-marker(QAMS)to determine the contents of four saikosaponins inBupleurumchinenseof south Hebei province.Methods：Saikosaponin a(SSa)was used as the internal reference substance，the relative correlation factors(RCFs)of saikosaponin c(SSc)，saikosaponin d(SSd)and saikosaponin f(SSf)to SSa were calculated and evaluated.The contents of four saikosaponins were determined by the QAMS and external standard method.Rationality and repeatability of the QAMS method was verified by t-test between the results obtained from the two different methods.Results：Relative correction factors(RCFs)of SSC，SSd and SSf to SSa inB.chinenseof south Hebei province were 0.75，0.97 and 1.08.The both methods show no significant difference in results(P>0.05).Conclusion：The QAMS method can be used for quantity of saikosaponins inB.chinenseof south Hebei province.

QAMS；BupleurumchinenseDC.；HPLC；saikosaponins；relative correlation factor(RCF)

2015-12-17)

*

張洪峰，主任藥師，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)，E-mail：1388097@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.013