李一鳴，王平

(湖北中醫(yī)藥大學(xué) 老年醫(yī)學(xué)研究所 湖北省老年病中藥新產(chǎn)品協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430065)

·基礎(chǔ)研究·

當(dāng)歸補(bǔ)血湯作用于四膜蟲抗氧化基因
——抗氧化藥物篩選新方法初探△

李一鳴，王平*

(湖北中醫(yī)藥大學(xué) 老年醫(yī)學(xué)研究所 湖北省老年病中藥新產(chǎn)品協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430065)

目的：以經(jīng)典方當(dāng)歸補(bǔ)血湯對四膜蟲生長曲線和抗氧化酶基因的作用探討篩選抗氧化藥物的新方法。方法：將不同劑量的當(dāng)歸補(bǔ)血湯接種于嗜熱四膜蟲的培養(yǎng)液中，以無菌蒸餾水為空白對照，觀察嗜熱四膜蟲的生長曲線，另外，對上述不同培養(yǎng)液中的嗜熱四膜蟲采用Real Time-PCR法測定嗜熱四膜蟲體內(nèi)的谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx4)、硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxin reductases，TxnRd2)的基因表達(dá)。結(jié)果：當(dāng)歸補(bǔ)血湯干預(yù)組生長曲線與空白組相比有明顯的提高。與空白組相比，嗜熱四膜蟲的GPx4、TxnRd2基因表達(dá)均顯著升高。結(jié)論：當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠明顯改善四膜蟲生長曲線，促進(jìn)GPx4、TxnRd2基因mRNA表達(dá)，提示生物體生長曲線可能與抗氧化酶基因表達(dá)有關(guān)。

當(dāng)歸補(bǔ)血湯；抗氧化；嗜熱四膜蟲；GPx4；TxnRd2

嗜熱四膜蟲Tetrahymenathermophila是一種單細(xì)胞真核生物[1]，隸屬于纖毛門寡膜綱膜口目四膜蟲科四膜蟲屬。嗜熱四膜蟲被廣泛用于污染物毒理學(xué)研究的模式生物，近年來常常被用作評估生態(tài)毒性以及生態(tài)風(fēng)險評估，以超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)等抗氧化相關(guān)酶作為觀察指標(biāo)用以探究毒物對嗜熱四膜蟲的影響?；蚪M學(xué)研究表明四膜蟲和人類基因有較高程度的相似性，因此以四膜蟲作為分子生物學(xué)研究對象，探明藥物或者毒物對高等生物作用機(jī)理有較為可靠的理論依據(jù)。有研究用抗菌劑三氯生(triclosan，TCS)和三氯卡班(triclocarban，TCC)干預(yù)四膜蟲，發(fā)現(xiàn)TCS和TCC在環(huán)境相關(guān)濃度下均可干擾嗜熱四膜蟲的抗氧化機(jī)制，分別表現(xiàn)為SOD、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)的活力增加，LDH活力的降低[2]。還有研究抗紫外濾光片的作用，以四膜蟲為對象觀測其細(xì)胞內(nèi)SOD、GPx抗氧化酶的活性[3]。課題組基于四膜蟲這種模式生物特點，利用竹節(jié)參、六味地黃丸、金貴腎氣丸等具有補(bǔ)益作用的單味藥物以及方劑，對嗜熱四膜蟲生長曲線、氧化酶及其相關(guān)基因進(jìn)行研究[4-5]。本研究根據(jù)其生長曲線相關(guān)基因表達(dá)方便快捷的特點，前期篩選了多種中藥，以經(jīng)典方劑當(dāng)歸補(bǔ)血湯作用于四膜蟲為研究對象，觀察補(bǔ)益類方劑對四膜蟲生長曲線、SOD及體內(nèi)GPx4和TxnRd2基因表達(dá)的影響。

1 材料與儀器

1.1四膜蟲

嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)(SB210株系)，由中國科學(xué)院水生生物研究所提供。

1.2試劑

朊蛋白胨(Proteose Peptone，Difco)，酵母提取物(yeast extract，Oxide)，葡萄糖、檸檬酸鐵、碘化鉀、冰醋酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，碘晶體(廣州化學(xué)試劑廠)，TRIZOL試劑(Invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)，熒光定量試劑盒(TaKaRa)。

1.3儀器

INCO153型CO2培養(yǎng)箱(Memmert)，CX31顯微鏡(Olympus)，TGL20M 臺式高速冷凍離心機(jī)(長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)，QL-901漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，DU730核酸-蛋白分析儀(BeckMan Coulter)，CFX96熒光實時定量PCR儀器(Bio-rad)。

1.4藥物制備

1.4.1四膜蟲培養(yǎng)基2%朊蛋白胨、0.1%酵母提取物、0.2%葡萄糖、0.003%檸檬酸鐵，溶于雙蒸水，經(jīng)121℃滅菌20min。

1.4.2藥物 黃芪、當(dāng)歸(湖北天際中藥飲片有限公司，批號：20150318)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯方由黃芪、當(dāng)歸組成，取黃芪25g、當(dāng)歸5g，用300mL雙蒸水充分煎煮2次，趁熱抽濾，合并藥液，濃縮為0.25g·mL-1藥液，然后用0.22μm微孔濾膜過濾3遍，得到藥液，備用。

1.4.3魯哥試劑 取碘化鉀20.0g、碘晶體10.0g、冰醋酸20.0mL，充分溶解后，去離子水定容至200mL，避光保存。

2 方法

2.1培養(yǎng)及給藥

取長勢良好的對數(shù)生長期四膜蟲，按培養(yǎng)基總體積的0.2%(500μL)接種于培養(yǎng)基25mL中，27℃培養(yǎng)傳代。主要采用藥物直接添加入培養(yǎng)基的方法干預(yù)四膜蟲生長曲線，觀察當(dāng)歸補(bǔ)血湯對四膜蟲抗氧化的影響。分別在無菌培養(yǎng)液的6孔板中加入不同濃度的藥液，接種對數(shù)生長期的嗜熱四膜蟲，每個濃度分別設(shè)3個平行，另設(shè)空白對照。

2.2計數(shù)

取200μL混勻的嗜熱四膜蟲培養(yǎng)體系用1μL魯哥試劑固定，分別在不同溫育時間取樣計數(shù)。

嗜熱四膜蟲在顯微鏡下的計數(shù)方法：用移液槍取1μL固定液，用血細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，每隔3h進(jìn)行1次計數(shù)，記錄每次培養(yǎng)液中的四膜蟲個數(shù)。

2.3GPx4、TxnRd2基因表達(dá)

在六孔板中取長勢良好的對數(shù)生長期四膜蟲，培養(yǎng)基中四膜蟲濃度為(2～3)×105個·mL-1，總RNA提取參照Trizol試劑盒的說明書步驟，總RNA最終溶于50μL以DEPC處理過的雙蒸水中，隨后用DU730核酸-蛋白分析儀檢測RNA濃度和純度。

取提取后的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，每個樣本進(jìn)行熒光定量以測定GPx4以及TxnRd2基因的表達(dá)，以18s作為內(nèi)參基因，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成并經(jīng)質(zhì)量檢測，引物序列見表1。

表1 GPx4、TxnRd2及內(nèi)參基因引物序列

反應(yīng)體系：Real Time-PCR反應(yīng)選用TaKaRa公司的SYBR PremixExTaqTM定量擴(kuò)增反應(yīng)體系，PCR管中加入SYBR PremixExTaqTM(2×)10 μL，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物2 μL，F(xiàn)orward Primer 0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。充分混勻，去除氣泡，離心使液體集中到管底，反應(yīng)體系總體積20 μL。

擴(kuò)增條件：PCR管放入Real Time-PCR儀中，設(shè)定反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 20 s，57 ℃ 30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)，65～96 ℃繪制熔解曲線，以△Ct值及2-△△Ct進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以ΔCt值以及2-ΔΔCt對Real Time PCR實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=Ct給藥組-Ct空白對照組。

2.4統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1當(dāng)歸補(bǔ)血湯對四膜蟲生長曲線的影響

由表2可知，與空白組比較，當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠明顯影響四膜蟲生長曲線。由圖1可觀察到，15h后四膜蟲的生長量達(dá)到平臺期，隨著藥物濃度的增加，四膜蟲平臺期數(shù)量明顯提高。

表2 當(dāng)歸補(bǔ)血湯對四膜蟲生長曲線的影響

圖1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯對四膜蟲生長曲線的影響

3.2GPx4、TxnRd2基因的表達(dá)

與空白組比較，給藥組的GPx4、TxnRd2基因表達(dá)有不同程度的上調(diào)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯對TxnRd4基因表達(dá)的促進(jìn)程度明顯高于GPx4。由表3中2-ΔΔCt可觀察到隨著給藥濃度的增加，GPx4、TxnRd2基因mRNA的表達(dá)有不同程度的上調(diào)。圖2顯示在40個循環(huán)期內(nèi)皆達(dá)到DNA復(fù)制平臺期說明反應(yīng)體系穩(wěn)定，引物擴(kuò)增效率較高。圖3溶解曲線為單峰，溶解曲線均一，說明DNA產(chǎn)物相同，退火溫度合適，為特異性擴(kuò)增。

表3 不同濃度當(dāng)歸補(bǔ)血湯對四膜蟲GPx4、TxnRd2 基因表達(dá)的影響

圖2 Real Time-PCR擴(kuò)增曲線

圖3 Real Time-PCR熔解曲線

4 討論

本實驗以補(bǔ)益氣血延緩衰老為主要依據(jù)，實驗方用當(dāng)歸補(bǔ)血湯，出自李東垣《內(nèi)外傷辨惑論》，主要治療氣血虧損、陽浮于外之證?，F(xiàn)代研究中發(fā)現(xiàn)黃芪、當(dāng)歸能增加抗氧化酶活性，提高機(jī)體對抗自由基對機(jī)體的損傷[6]。目前中醫(yī)藥對抗衰老中藥研究越來越多，也逐漸深入。建立一個合理、有效且便利的藥物篩選方法能夠幫助我們更好地發(fā)掘藥物以及藥物的有效成分，使藥物的研發(fā)更有靶向性，更快在臨床上發(fā)揮作用。

GPx-4是硒蛋白谷胱甘肽氧化還原酶(GPx)家族眾多氧化還原酶類的一種，作為一種抗氧化酶在細(xì)胞生理中發(fā)揮重要作用[7]，而在真核細(xì)胞生物對抗脂質(zhì)過氧化當(dāng)中更是起著無可替代的作用[8]。GPx-4同樣也是哺乳動物細(xì)胞中唯一能夠直接還原生物膜上磷脂氫過氧化物的抗氧化酶，它能夠清除過多的活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)。ROS是氧化還原代謝中一類常見產(chǎn)物，若體內(nèi)代謝平衡失調(diào)會誘發(fā)諸如癌癥及多種退化性疾病，這些疾病的發(fā)生均與ROS對細(xì)胞損傷相關(guān)[9]。Gpx-4通過清除活性氧的細(xì)胞毒性作用，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，從而起到防治疾病的作用。

真核生物的硫氧還蛋白還原酶(thioredoxinreductases，TR)主要有3類：TR1(常見有TrxR1，TxnRd1或TrxRα)，TR3(TrxR2，TxnRd2，TrxRβ) 以及硫氧還蛋白-谷胱甘肽還原酶(thioredoxin glutathione reductase，TGR；主要有TR2，TxnRd3[10]。TR1和TR3兩種還原酶機(jī)制已經(jīng)較為明確，TxnRd2是哺乳動物體內(nèi)三種硫氧還蛋白還原酶基因的一種，主要在線粒體內(nèi)發(fā)揮作用[11]。有證據(jù)表明可以通過改變體內(nèi)氧化-抗氧化的平衡來阻礙疾病發(fā)生、延緩衰老的進(jìn)程[12]。

本實驗以當(dāng)歸補(bǔ)血湯經(jīng)典方劑干預(yù)四膜蟲的生長，由表2結(jié)果可觀察到，隨著藥物濃度的增加，給藥組對于空白組平臺期有明顯的提高，提示當(dāng)歸補(bǔ)血湯對四膜蟲的生長繁殖產(chǎn)生影響，可能是通過抗氧化作用影響四膜蟲的壽命。加入當(dāng)歸補(bǔ)血湯的四膜蟲抗氧化基因GPx-4、TxnRd2與空白組比較有較為明顯的升高，如表3所示，提示當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠提高基因的表達(dá)量。通過表3還可觀察到，當(dāng)歸補(bǔ)血湯對TxnRd2基因表達(dá)作用明顯強(qiáng)于GPx-4。其中GPx-4基因主要影響細(xì)胞內(nèi)抗氧化反應(yīng)酶，作用體現(xiàn)在保護(hù)生物膜系統(tǒng)免受氧化損傷；而TxnRd2主要作用于線粒體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，故我們推測當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能主要是通過調(diào)控氧化/抗氧化平衡對嗜熱四膜蟲生長周期產(chǎn)生影響。由于GPx-4抗氧化還原酶的作用對微量元素硒有一定需求，并以硒蛋白的形式發(fā)揮作用，因此尚需進(jìn)一步試驗進(jìn)行驗證。實驗結(jié)果表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯對嗜熱四膜蟲生長曲線可能是通過影響GPx-4、TxnRd2基因表達(dá)來得以實現(xiàn)。目前對抗氧化藥物的篩選一般利用動物模型或者建立相應(yīng)的細(xì)胞模型，通過檢測血液、組織及細(xì)胞中抗氧化酶的含量達(dá)到篩選中藥以及活性部位的目的。動物模型操作簡單但實驗周期較長，不穩(wěn)定因素較多，細(xì)胞模型建立操作較為復(fù)雜與繁瑣。而四膜蟲作為一個單細(xì)胞生物用作篩選抗氧化藥物，實驗周期較短，實驗室培養(yǎng)簡單，實驗結(jié)果準(zhǔn)確[13]。許多疾病如衰老、糖尿病、心血管疾病等的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體氧化應(yīng)激密切相關(guān)，嗜熱四膜蟲能夠幫助尋找高效、低毒的抗氧化藥物，建立快速有效的篩選方法和篩選模型具有重要意義。課題組希望通過前期研究，建立以四膜蟲為模式生物用于抗氧化藥物篩選的一種新方法，以期為后期研究中藥配伍相互作用提供可靠依據(jù)。

在基礎(chǔ)研究中嗜熱四膜蟲一直處于前沿地位，其細(xì)胞內(nèi)有兩種細(xì)胞核，因此四膜蟲猶如一個豐富的基因庫，為遺傳物質(zhì)研究提供了良好的基礎(chǔ)。課題組希望通過觀察研究方劑對四膜蟲的影響，以期建立一個較為理想的藥物篩選模型，由于其具有實驗周期短、針對性強(qiáng)的特點，有望在機(jī)制研究、藥物篩選等方面發(fā)揮重要的作用。

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EffectsofDangguiBuxueDecoctiononmRNAExpressionofGPx4andTxnRd2inTetrahymenaThermophile——ANewMethodforAnti-oxidativeDrugDiscovery

LIYiming，WANGPing*

(InstituteofGeratology，HubeiUniversityofChineseMedicine，CollaborativeInnovationCenterofTraditionalChineseMedicineofNewProductsforGeriatrics，Wuhan430065，China)

Objective：To study the effects of Danggui Buxue decoction on mRNA expression of GPx4 and TxnRd2 inTetrahymenathermophile.Methods：T.thermophilagrowth was intervened by using the boil-free granule of traditional Chinese medicine.Four different concentrations of Danggui Buxue decoction were added into culture medium ofT.thermophile，and each concentrations with two parallel designs，by setting a group using sterile distilled water as blank control.Processing of gene glutathione peroxidase (GPx4) and thioredoxin reductases (TxnRd2) expression data generated by quantitative real-time RT-PCR.Results：Compared with blank control group，the growth curve of medicine intervention went up significantly.Results also showed that the expression level of GPx4 and TxnRd2 were increased by Danggui Buxue decoction.Conclusion：Danggui Buxue decoction could increase theT.thermophile’s growth curve，which may be related to GPx4 TxnRd2 gene expression.

Tetrahymenathermophile；Danggui Buxue decoction；GPx4；TxnRd2

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.009

2015-09-15)

國家自然科學(xué)基金委重點項目(81130064)

*

王平，博士，二級教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：老年腦病中醫(yī)藥防治規(guī)律；E-mail：pwang54@aliyun.com