權(quán)紅，甄梓娟，李連強，陳敏，蘭小中*

(1.西藏大學 農(nóng)牧學院 藥用植物研究中心，西藏 林芝 860000；2.西南大學 藥學院，重慶 400715)

·基礎(chǔ)研究·

藏藥匙葉翼首草中齊墩果酸及熊果酸的含量測定△

權(quán)紅1，甄梓娟1，李連強1，陳敏2，蘭小中1*

(1.西藏大學 農(nóng)牧學院 藥用植物研究中心，西藏 林芝 860000；2.西南大學 藥學院，重慶 400715)

目的：采用HPLC-PDA法測定藏藥匙葉翼首草不同生長年限、不同藥用部位中的齊墩果酸及熊果酸含量動態(tài)變化。方法：采用YMC-ODS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-0.1%乙酸銨為流動相(85∶15)等度洗脫，流速為1 mL·min-1，檢測波長為210 nm，柱溫為35 ℃。結(jié)果：齊墩果酸在5～150 mg·L-1線性關(guān)系良好(r=0.999 5)，平均加樣回收率為101.17%；熊果酸在20～600 mg·L-1線性關(guān)系良好(r=0.999 5)，平均加樣回收率為100.69%。匙葉翼首草中齊墩果酸和熊果酸的質(zhì)量分數(shù)分別為0.199～0.946、0.737～6.750 mg·g-1。結(jié)論：匙葉翼首草中齊墩果酸及熊果酸的含量在時間與空間格局上均具有統(tǒng)計學差異。

匙葉翼首草；齊墩果酸；熊果酸；含量測定

翼首草為川續(xù)斷科(Dipsacaceae)翼首草屬(Pterocephalus)匙葉翼首草Pterocephalushookeri(C.B.Clarke) H?eck植物的干燥全草，收載于《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)2015版一部[1]，是我國傳統(tǒng)藏藥材。具有解毒除瘟、清熱止痢、祛風通痹的功效，主要用于治療各種傳染病所引起的熱癥、流行性感冒、感冒發(fā)燒，心熱、血熱、腸炎、關(guān)節(jié)炎等病癥。在民間廣泛應用，被喻為地上“七種仙草”之一[2]。其化學成分主要有三萜皂苷、環(huán)烯醚萜、木脂素、脂肪酸及多糖等成分[3-7]，其中三萜皂苷類及環(huán)烯醚萜類化合物是匙葉翼首草的主要活性成分，具有抗炎、護肝、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化以及機體免疫調(diào)節(jié)等作用[8]?！吨袊幍洹?015版對匙葉翼首草中齊墩果酸及熊果酸總量進行了定量控制，規(guī)定干燥全草中齊墩果酸及熊果酸的總含量不低于0.20%。齊墩果酸及熊果酸為三萜類化合物，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。本實驗采用HPLC-PDA測定匙葉翼首草不同生長年限、不同藥用部位中的齊墩果酸及熊果酸含量，為翼首草的質(zhì)量控制提供參考。

注：1.齊墩果酸；2.熊果酸。圖1 齊墩果酸、熊果酸的化學結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

島津LC-20AD高效液相色譜儀(LC-20AD四元泵，DGU-20A脫氣機，SPO-M20A二極管陣列檢測器，SIL-20A自動進樣器，CTO-20A柱溫箱，日本島津公司)；JP-020超聲清洗器(100 W，40 kHz，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司)；AB135-S電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；超純水制備儀。

對照品：齊墩果酸(批號：J0709AS)、熊果酸(批號：N0827AS)購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。色譜級甲醇(Sigma公司)，超純水，其余試劑為分析純。

9份翼首草藥材采集自西藏林芝市巴宜區(qū)章麥村藏藥材種植基地，經(jīng)西藏大學農(nóng)牧學院蘭小中教授鑒定為川續(xù)斷科植物匙葉翼首草的干燥全草。標本保存于西藏大學農(nóng)牧學院食品科學學院。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

YMC-ODSC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：甲醇-0.1%乙酸銨水溶液(85∶15)等度洗脫，流速：1 mL·min-1，柱溫：35 ℃，檢測波長：210 nm，進樣量：10 μL。在此條件下，齊墩果酸和熊果酸保留時間分別為19.948、20.943 min，兩個成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，對照品和樣品色譜圖見圖1。

注：A.混合對照品；B.供試品；1.齊墩果酸；2.熊果酸。圖2 翼首草及混合對照品HPLC圖

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取齊墩果酸、熊果酸適量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，分別配制成齊墩果酸質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1、熊果酸質(zhì)量濃度為0.8 mg·mL-1的對照品儲備液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品粉末(過三號篩)約2 g精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足失重，搖勻，濾過，用少量甲醇洗滌濾渣及濾器，合并濾液，蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2項下的混合對照品溶液適量，置2 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，依次配成齊墩果酸質(zhì)量濃度為150、125、100、75、50、25、10、5 mg·L-1，熊果酸質(zhì)量濃度為600、500、400、300、200、100、40、20 mg·L-1的溶液。分別吸取上述系列混合對照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，分別以齊墩果酸和熊果酸質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，進行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 齊墩果酸、熊果酸的線性關(guān)系

2.5 精密度試驗

精密吸取供試品溶液10 μL，按2.1項下色譜條件進樣檢測，連續(xù)進樣6次，齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD分別為1.2%、1.7%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品(3年生地下部分)溶液10 μL，分別于0、1、4、8、12、24 h按2.1項下色譜條件進樣分析，測定齊墩果酸和熊果酸的峰面積，其RSD分別為1.4%、1.6%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗

取6份同一翼首草粉末(3年生地下部分)2 g，精密稱定，按2.3項下方法制備供試品溶液，在2.1項色譜條件下進樣檢測分析，齊墩果酸和熊果酸的RSD分別為1.9%、1.7%，表明該方法的重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的翼首草粉末(3年生地下部分)0.5 g，精密稱定，共9份。精密稱取齊墩果酸對照品1.4 mg、熊果酸4.24 mg置10 mL量瓶中，加適量甲醇溶解至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。根據(jù)樣品中齊墩果酸含量的90%、100%、110%，分別加入齊墩果酸和熊果酸對照品共3份，按2.3方法制備成供試品溶液，進行HPLC分析，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 翼首草中齊墩果酸、熊果酸的加樣回收率試驗

2.9 樣品測定

分別精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各10 μL，按2.1色譜條件進行測定，計算各樣品中齊墩果酸及熊果酸的質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表3、圖3。

表3 翼首草樣品中熊果酸和齊墩果酸的測定 /mg·g-1

圖3 匙葉翼首草不同生長年限、不同藥用部位的齊墩果酸、熊果酸含量變化

如圖3所示，與1年生翼首草地下部分相比，2年和3年生地下部分中齊墩果酸及熊果酸含量均降低；與2年生翼首草地下部分相比，3年生齊墩果酸及熊果酸含量雖然有所提高，但增長幅度明顯變小，基本趨于穩(wěn)定，這表明翼首草根中的齊墩果酸及熊果酸含量在2年后的增加或減少的幅度很小。與1年生翼首草地上部分及全草相比，2年和3年生翼首草中齊墩果酸及熊果酸含量均升高。

3 討論

實驗結(jié)果表明，匙葉翼首草中的齊墩果酸及熊果酸含量在時間和空間格局上均具有統(tǒng)計學差異。在1～3年栽培年限內(nèi)，地上部分及全草中齊墩果酸及熊果酸的含量顯著增加，但地下部分齊墩果酸及熊果酸的含量有先降低后增加的趨勢，其中齊墩果酸含量變化與已有文獻報道的結(jié)果相一致，但熊果酸含量變化與之前的文獻報道不相符[9]，可能是環(huán)境變化產(chǎn)生的影響。在人工栽培技術(shù)中，播種后第二年即可收獲，第三年收獲效果更佳[10-13]，從本實驗的數(shù)據(jù)來看，是有一定科學依據(jù)的。在對匙葉翼首草不同藥用部位中齊墩果酸及熊果酸含量測定發(fā)現(xiàn)，地上部分含量高于地下部分，1年生、2年生、3年生翼首草地上部分的齊墩果酸及熊果酸總量與地下部分的比值分別為2.8、6.7、6.8，栽培年限大于2年的翼首草地上部分總含量與地下部分趨于穩(wěn)定，考慮其經(jīng)濟效益及種植成本，建議種植2～3年后采收。本實驗測得的翼首草全草及地上部分齊墩果酸和熊果酸總含量均高于《中國藥典》2015版標準，地下部分總含量均達不到該標準。

由于本文只考察了西藏林芝產(chǎn)翼首草藥材不同生長年限的差別，未對其他產(chǎn)地翼首草藥材進行考察，因此還有待于后續(xù)進一步研究。

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ContentsDeterminationofOleanolicAcidandUrsolicAcidofPterocephalushookeri

QUANHong1，ZHENZijuan1，LILianqiang1，CHENMin2，LANXiaozhong1*

(1.MedicinalPlantsResearchCenter，AgriculturalandAnimalHusbandryCollegeofTibetUniversity，Linzhi860000，China；2.CollegeofPharmaceuticalSciences，SouthwestUniversity，Chongqing400715，China)

Objective：The spatiotemporal dynamic analysis of oleanolic acid and ursolic acid in different growth years of whole plant ofPterocephalushookeriwas determined by HPLC.Methods：The HPLC method was performed on a YMC-ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) column with methanol and 0.1% ammonium acetate-water as the mobile phase.Isocratic elution with flow rate at 1 mL·min-1.The detection wavelength was 210 nm and the column temperature was controlled at 35 ℃.Results：The content of oleanolic acid from 5 to 150 mg·L-1showed a good linearity，the average recovery was 101.17%，the content of ursolic acid from 20 to 600 mg·L-1showed a good linearity，the average recovery was 100.69%.The contents of oleanolic acid inP.hookeriranged from 0.199 to 0.946 mg·g-1，the contents of ursolic acid ranged from 0.737 to 6.750 mg·g-1.Conclusion：There is a significant differencein the spatiotemporal dynamic analysis of oleanolic acid and ursolic acid in different growth years ofP.hookeri.

Pterocephalushookeri；oleanolic acid；ursolic acid；contents determination

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.6.016

2015-12-17)

中央本級重大增減支項目(2060302)；西藏自治區(qū)科學技術(shù)廳重大科技計劃(20131225)；西藏自治區(qū)教育廳藏藥材資源與開發(fā)利用創(chuàng)新團隊建設(shè)項目

*

蘭小中，教授，博士，研究方向：藥用植物資源與開發(fā)利用；Tel：(0894)5826471，E-mail：lanxiaozhong@163.com