王錦鳳，肖露，王若琳，錢衛(wèi)平，周亮

(1.北京大學深圳醫(yī)院生殖醫(yī)學科，深圳　518036；2.汕頭大學醫(yī)學院，汕頭　515041；3.湖南省岳陽市婦幼保健院，岳陽　414000)

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內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白27(ERp27)在小鼠卵母細胞的定位及在精卵融合中的作用

王錦鳳1，2，肖露3，王若琳1，2，錢衛(wèi)平1*，周亮1*

(1.北京大學深圳醫(yī)院生殖醫(yī)學科，深圳518036；2.汕頭大學醫(yī)學院，汕頭515041；3.湖南省岳陽市婦幼保健院，岳陽414000)

目的探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白27(ERp27)在小鼠卵母細胞的表達定位，以及該蛋白在小鼠精卵融合中的作用。方法將性成熟后的小鼠促排卵后，取出卵母細胞，并分為空白對照組(不做任何處理)、陰性對照組(與正常血清IgG共孵育)、抗ERp27抗體封閉組(與抗ERp27單克隆抗體共孵育)，用免疫熒光法檢測ERp27在小鼠卵母細胞上的定位；通過穿卵實驗觀察抗ERp27抗體對受精率、受精指數(shù)的影響。結(jié)果免疫熒光結(jié)果顯示ERp27在小鼠MI期卵母細胞主要分布在胞漿的周邊區(qū)域中，在MⅡ期卵母細胞則均勻分布于卵母細胞胞質(zhì)；穿卵實驗結(jié)果顯示，空白對照組、陰性對照組及抗ERp27抗體封閉組受精率分別為90.91%、89.13%和76.00%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，受精指數(shù)分別為(5.20±1.32)、(5.40±1.07)和(3.20±0.92)，抗ERp27抗體封閉組的受精指數(shù)顯著低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論ERp27在小鼠MⅠ及MⅡ期卵母細胞中均有表達，該蛋白可能與精卵融合有關。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白27；間接免疫熒光；精卵融合

【Abstract】

Objective：To investigate the localization of endoplasmic reticulum protein 27 (ERp27) on mouse oocytes and its role in gamete fusion.

Methods：The oocytes were collected from sexually mature male mice after controlled ovarian hyperstimulation. The oocytes were randomly divided into blank control (no treatment) group，negative control (co-incubated with IgG) group and anti-ERp27 group (co-incubated with ERp27 antibody). The localization of ERp27 was detected by immunofluorescence analysis. The effect of anti-ERp27 antibody on fertilization rate (FR) and fertilization index (FI) was observed by sperm-oocyte fusion assay.

Results：According to indirect immunofluorescence analysis，ERp27 was mainly distributed in the cytoplasm of the peripheral region in MⅠ oocytes，while evenly distributed in the cytoplasm in MⅡ oocytes. The fertilization rate (90.91% vs. 89.13% vs. 76.00%) was not significantly different among the blank control，negative control and anti-ERp27 groups (P>0.05). The fertilization index of anti-ERp27 group (3.20±0.92) was significantly lower than the other two groups [(5.20±1.32)，(5.40±1.07) ](P<0.05).

Conclusions：ERp27 was expressed in MI and MⅡ stage oocytes in mouse and this protein may play a role in facilitating sperm-oocyte fusion.

(JReprodMed2016，25(9)：827-831)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白27(Endoplasmic reticulum protein 27，ERp27)是由Alanen等[1]于2006年新發(fā)現(xiàn)的一個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族(protein disulfide isomerase family，PDI)中一個不具有氧化還原活性的成員。ERp27目前只在脊椎動物中被發(fā)現(xiàn)，人類ERp27的同源物在小鼠、黑猩猩、狗、牛、恒河獼猴、綠色的河豚魚和斑馬魚中都有發(fā)現(xiàn)。人類ERp27在很多組織中都有表達，例如骨髓、肺、腎、脾等，其中在胰腺中的表達最顯著[1]。PDIs是一類主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的巰基/二硫鍵氧化還原酶[2]，都含有一個或多個硫氧還蛋白同源結(jié)構(gòu)域，其中具有C-X-X-C催化中心的結(jié)構(gòu)域為α型，沒有催化中心的為β型，其主要功能是催化底物蛋白質(zhì)二硫鍵的形成、異構(gòu)和還原，輔助新合成的蛋白質(zhì)形成正確空間構(gòu)象。大約有三分之一的細胞蛋白通過分泌途徑排出，且隨后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進行氧化折疊[3]。ERp27是分子量大小為27.7 kDa，缺少C-X-X-C活性位點結(jié)構(gòu)，由兩個硫氧還蛋白折疊結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，同源于PDI非催化活性的bb’結(jié)構(gòu)域。關于該蛋白的具體生理功能目前尚不清楚，在生殖細胞中的表達及功能也少見報道。本文將探討ERp27在小鼠不同時期卵母細胞中的定位及該蛋白與精卵融合的關系。

材料與方法

一、材料

1. 實驗動物：SPF級昆明雌、雄性小白鼠，購自廣州實驗動物中心(合格證編號：No.44007200 021665)，檢疫1周無異常情況后，進入實驗。其中雌性小鼠6～8周齡，體重28～32 g；雄性小鼠8～10周齡，體重38～42 g。

2. 實驗試劑：兔ERp27抗體(Abcam，英國)；Alexa Fluor 594 標記的羊抗兔IgG(Life Technologies，美國)；DAPI染色試劑盒(江蘇凱基生物)；孕馬血清促性腺激素(PMSG)和HCG(寧波三生藥業(yè))；人血清白蛋白、改良的人輸卵管液(HTF，ART-1023)、受精液(ART-1020)、透明質(zhì)酸酶和組織培養(yǎng)油(Quinn’s Sage，美國)；羊血清(北京中杉金橋)。

二、實驗方法

1.小鼠超促排卵及取卵、取精：取6～8周性成熟雌鼠，經(jīng)12 h明/暗循環(huán)周期喂養(yǎng)，飼以滅菌水、食物及墊料1周后，腹腔內(nèi)注射PMSG 10 U/只，46～48 h腹腔注射 HCG 10 U/只。12～14 h后，將雌鼠脫頸椎處死，并取出輸卵管壺腹部，轉(zhuǎn)移到盛有輸卵管液的培養(yǎng)皿中；在體視顯微鏡下用1 ml注射器撕破膨大部，卵冠丘復合物成團溢出，用透明質(zhì)酸酶去除顆粒細胞，轉(zhuǎn)移到盛有培養(yǎng)液滴的培養(yǎng)皿中。雄鼠頸脫臼處死后，取附睪尾，置于裝有培養(yǎng)液的EP管中，用1 ml注射器扎數(shù)個小口，上游15 min后吸取上層精子，將密度調(diào)至(1～3)×106個/ml，培養(yǎng)箱中獲能2 h備用。

2.小鼠卵母細胞間接免疫熒光：將小鼠卵母細胞放入PBS(pH 7.4)中洗滌3次，用4%多聚甲醛室溫下固定30 min，洗脫液洗3次，5 min/次；體積分數(shù)0.5%的Triton X-100(Sigma，美國)室溫下透膜20 min，洗脫液洗3次，5 min/次；用1% BSA室溫下封閉1 h，然后加入ERp27單克隆抗體(1∶100)，同時以加入進口羊血清為陰性對照，37℃孵育1 h，洗脫液洗3次，5 min/次；加入Alexa Fluor 594 標記的羊抗兔IgG(1∶500)，于37℃避光孵育1 h，洗脫液洗3次，5 min/次；加入DAPI(1∶20)染核，避光操作，室溫孵育15 min，洗脫液洗1次，5 min/次；在玻璃底皿中滴入防熒光淬滅劑，卵母細胞置于其中，用激光共聚焦顯微鏡觀察。

3.穿卵實驗：將去顆粒細胞后的卵母細胞分為3組：空白對照組(44枚，不做任何處理)、陰性對照組(46枚，與正常血清IgG共孵育)、抗ERp27抗體封閉組(50枚，與抗ERp27單克隆抗體共孵育)。去透明帶，將各組卵母細胞分別放入酸性HTF(濃鹽酸與HTF體積比為1∶20)溶液中，顯微鏡下觀察到透明帶消失時，立刻吸出卵母細胞；將卵母細胞移入裝有培養(yǎng)液滴的培養(yǎng)皿，加入已獲能的精子懸液50 μl，石蠟油覆蓋后置于含5% CO2的培養(yǎng)箱中37℃孵育3 h。移出受精卵，在培養(yǎng)液中清洗3次，除去表面松散精子，4%多聚甲醛固定30 min，洗脫液洗3次，5 min/次；加入DAPI(1∶20)染核，避光操作，室溫孵育15 min，洗脫液洗滌后，加入滴有防熒光淬滅劑的玻璃底皿中，用激光共聚焦顯微鏡觀察精卵融合情況。

受精率和受精指數(shù)作為判斷精卵融合的標準。受精率指被精子穿入的卵細胞所占百分比，受精指數(shù)是穿入卵細胞內(nèi)的精子個數(shù)。

三、統(tǒng)計學處理

每次實驗重復3次，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，進行χ2檢驗分析各組受精率之間的差異，用單因素方差分析法分析各組間受精指數(shù)的差異；P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)　　果

一、ERp27在小鼠卵母細胞的亞細胞定位

間接免疫熒光的實驗結(jié)果顯示，在MⅠ期小鼠卵母細胞中，ERp27主要分布在卵母細胞胞漿的周邊區(qū)域(圖1)；在MⅡ期的小鼠卵母細胞中，ERp27均勻分布在卵母細胞胞漿中(圖2)。陰性對照未見明顯熒光信號(圖3)。

A：小鼠MⅠ期卵母細胞中DAPI所染的染色質(zhì)(藍光)；B：DIC圖像；C：ERp27在小鼠MⅠ期卵母細胞中的定位(紅光)；D：Merged圖像圖1　ERp27在MⅠ期小鼠卵母細胞中的定位

A：小鼠MⅡ期卵母細胞中DAPI所染的染色質(zhì)(藍光)；B：DIC圖像；C：ERp27在小鼠MⅡ期卵母細胞中的定位(紅光)；D：Merged圖像圖2　ERp27在MⅡ期小鼠卵母細胞中的定位

A：小鼠卵母細胞中DAPI所染的染色質(zhì)(藍光)；B：DIC圖像；C：ERp27在小鼠卵母細胞中表達的陰性對照(無明顯熒光信號)；D：Merged圖像圖3　ERp27在小鼠卵母細胞表達陰性對照

二、ERp27單克隆抗體與受精率和受精指數(shù)的關系

空白對照組、陰性對照組及抗ERp27抗體封閉組的受精率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)?？笶Rp27抗體封閉組的受精指數(shù)明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1　三組小鼠受精率和受精指數(shù)的比較[(x-±s)，n(%)]

注：與抗ERp27抗體封閉組比較，*P<0.05

討　　論

蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)家族是第一類被發(fā)現(xiàn)參與二硫鍵形成的酶類。有證據(jù)表明，該家族的組成具有種屬依賴性，例如釀酒酵母中有5個PDI家族成員[4]，而在人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了有至少20個[2]。該家族蛋白最為人所知的作用是促進二硫鍵的正確形成，這一過程對于胞外蛋白和細胞表面蛋白的折疊過程是非常關鍵的[5]。

近年來的研究表明，PDI家族蛋白與精子、卵母細胞的成熟發(fā)育及精卵融合等密切相關。2006年，Ellerman等[6]報道ERp57定位于小鼠頂體反應后精子的赤道區(qū)，與精卵融合有關。隨后在人類精子的研究中也發(fā)現(xiàn)，ERp57主要定位于精子的頂體和尾部，頂體反應后位于赤道部；且在IVF受精率低的患者中，精子ERp57的表達量明顯低于高受精率精子[7]。另外，Liu等[8]的研究表明，在大鼠卵母細胞中MⅡ期卵母細胞ERp57的表達量明顯高于MI期卵母細胞，且主要分布在偏心核對立面的微絨毛區(qū)。ERp29是PDI家族中一個不具有催化活性的成員，近年來也被報道與生殖細胞的成熟相關。2007年，Guo等[9]的研究表明，精子在大鼠附睪頭到附睪尾的運行過程中，ERp29的表達量顯著增加，可能參與分泌性蛋白質(zhì)的合成，在精子成熟的過程中發(fā)揮重要作用。隨后，Ying等[10]報道，ERp29主要分布在附睪頭部精子的頭部、附睪尾部精子的頭部和尾部主段，頂體反應后分布在赤道區(qū)及頂體后區(qū)；可能通過影響精卵膜融合影響受精。

ERp27是分子量為27.7 kDa的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，缺少C-X-X-C活性位點結(jié)構(gòu)，由兩個硫氧還蛋白折疊結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，同源于蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶PDI非催化活性的bb’結(jié)構(gòu)域。含有一段結(jié)構(gòu)Asp-Glu-Trp-Asp，位于b’結(jié)構(gòu)域的一個環(huán)中，類似于鈣聯(lián)蛋白和鈣網(wǎng)蛋白P-結(jié)構(gòu)域頂端的Glu-Asp-Trp-Asp區(qū)域。ERp27正是通過該區(qū)域與ERp57連接相互作用。而ERp29與ERp27都是PDIs中不具有催化活性的成員，都缺少C-X-X-C活性位點，不能催化巰基到二硫鍵的轉(zhuǎn)換；但都具有連接底物的特性。二者都是結(jié)構(gòu)簡單的兩結(jié)構(gòu)域蛋白，ERp29的一個結(jié)構(gòu)域為硫氧還蛋白折疊，另一個結(jié)構(gòu)域則全由α-螺旋構(gòu)成；ERp27的兩個結(jié)構(gòu)域均為硫氧還蛋白折疊。ERp57、ERp29已分別被證實與生殖細胞的成熟及精卵融合相關。

本文研究ERp27與小鼠生殖細胞及受精的關系，結(jié)果表明在MI期的小鼠卵母細胞中，ERp27主要分布在卵母細胞胞漿的周邊區(qū)域，而在MⅡ期卵母細胞中，該蛋白則均勻分布在胞質(zhì)，根據(jù)其在卵母細胞成熟過程中分布的變化，推測其可能與小鼠卵母細胞的成熟發(fā)育過程有關；而這一蛋白在這兩個減數(shù)分裂時期的表達量是否存在差異，還需要后續(xù)的蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)加以驗證。

精子穿進透明帶進入卵周間隙，這時的精卵膜融合是精子頭部遺傳物質(zhì)進入卵母細胞內(nèi)的關鍵過程，也是受精成功必不可少的一步[11]。為研究ERp27在精卵融合中的作用，我們進行了精子穿小鼠卵母細胞透明帶的實驗。早在1976年就有文獻首次報道了人精子穿倉鼠卵的實驗[12]，隨后被公認是判斷精卵結(jié)合能力的經(jīng)典方法[13]，并且也是作為鑒定男性不育檢查項目的一種。目前，這一穿卵實驗也常被用于鑒定某一蛋白在精卵融合過程中發(fā)揮的作用，例如SP-10[14]、SOB2[15]等均是通過穿卵實驗從而證實與精卵融合相關。近年來這一實驗方法也有了發(fā)展和改進，Ying等[10]2010年的研究表明，用小鼠精子和小鼠卵母細胞行穿卵實驗，效果良好。本研究參照上述實驗方法，結(jié)果顯示，抗ERp27抗體對受精率無明顯影響，對受精指數(shù)有抑制作用，表明ERp27在精卵融合中可能發(fā)揮著重要作用，一方面可能與我們的樣本量較小有關，另一方面考慮到ERp27與ERp57在結(jié)構(gòu)上的相互連接，而ERp57已被證實與精卵融合相關，我們推測ERp27與ERp57可能共同發(fā)揮促進精卵融合的作用。

綜上所述，本研究初步探討了ERp27在生殖細胞中的分布，及其與精卵融合的關系。而該蛋白在卵母細胞發(fā)育過程中發(fā)揮何種作用，是否與該家族其他蛋白相互作用以及影響精卵融合的機制還需要更深入的研究。

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[編輯：辛玲]

Localization of ERp27 on mouse oocytes and its role in gamete fusion

WANG Jin-feng1，2，XIAO Lu3，WANG Ruo-lin1，2，QIAN Wei-ping1*，ZHOU Liang1*

1.DepartmentofReproductiveMedicine，PekingUniversityShenzhenHospital，Shenzhen518036 2.MedicalCollegeofShantouUniversity，Shantou515041 3.CenterforReproductiveMedicine，YueyangHospitalforMaternal&ChildHealthCare，Yueyang414000

ERp27；Indirect immunofluorescence analysis；Sperm-oocyte fusion

10.3969/j.issn.1004-3845.2016.09.012

2016-02-24；

2016-04-10

國家自然科學基金(30900817)；廣東省醫(yī)學科研基金(A2015397);深圳市科技研發(fā)資金基礎研究計劃面上項目(JCYJ20120616144719076)

王錦鳳，女，湖北孝感人，碩士研究生，病理學與病理生理學專業(yè).(*

,Email：zhouliang1002@163.com)