許嬌嬌，楊云旭，徐蓓華，胡　英#

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江寧波　315100；2.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江溫州　325000）

Man-PEI25k納米復(fù)合物在微針作用下的透皮性能研究Δ

許嬌嬌1，2＊，楊云旭1，徐蓓華1，胡英1#

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江寧波315100；2.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江溫州325000）

目的：研究高分子質(zhì)量聚乙烯亞胺（PEI25k）的甘露糖衍生物（Man-PEI25k）的納米復(fù)合物在微針作用下的透皮性能。方法：以熒光染料水溶性羧基CdSe/ZnS量子點（QD）為模型藥物，與PEI25k、Man-PEI25k溶液通過靜電吸附形成PEI25k/QD和不同嫁接率（1∶3、1∶6）的Man-PEI25k/QD納米復(fù)合物，同時以游離的QD作為對照，通過共聚焦顯微鏡觀察微針作用下QD在皮膚活性表皮層和真皮層中的分布情況；用熒光分光光度計測定微針作用下PEI25k/QD和Man-PEI25k/QD納米復(fù)合物在皮膚活性表皮層和真皮層中QD的累積滯留量。結(jié)果：微針作用于在體皮膚，Man-PEI25k/QD納米復(fù)合物在活性表皮層和真皮層的量明顯高于PEI25k/QD納米復(fù)合物；Man-PEI25k/QD（1∶6）納米復(fù)合物在活性表皮層和真皮層的量明顯高于Man-PEI25k/QD（1∶3）納米復(fù)合物。體外透皮試驗顯示，微針能明顯提高納米復(fù)合物在活性表皮層和真皮層中的滯留量；微針作用48 h后，Man-PEI25k/QD納米復(fù)合物在活性表皮層和真皮層的滯留量約比PEI25k/QD增加了2、1.5倍，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論：微針可提高Man-PEI25k/QD納米復(fù)合物在活性表皮層的透皮性能。

高分子質(zhì)量聚乙烯亞胺的甘露糖衍生物；納米復(fù)合物；微針；透皮給藥；水溶性羧基CdSe/ZnS量子點

經(jīng)皮免疫作為一種新型免疫治療手段被廣泛關(guān)注。人體皮膚角質(zhì)層下的活性表皮層中存在著一大類樹突狀細胞（DCs）——郎格漢斯細胞（LCs）。當抗原被這類細胞捕捉，刺激DCs并使其成熟，并可使DCs離開皮膚活性表皮向局部淋巴結(jié)游走，產(chǎn)生很強的免疫效應(yīng)，因此活性表皮層被認為是疫苗接種的最佳部位［1］。理想的免疫策略是選擇適宜的免疫措施和給藥系統(tǒng)，刺激DCs成熟，提高DCs對抗原的攝取、表達和遞呈，從而提高疫苗的免疫效應(yīng)。

由于DCs為未分化細胞，其轉(zhuǎn)染效率是影響免疫遞呈的重要原因，已知DCs細胞膜表面分布3種受體：Fc受體、甘露糖（Mannose，Man）受體（MMR）、DEC-205受體［2］。通過藥劑學(xué)和化學(xué)合成手段，可在載體材料分子上引入MMR，通過MMR的介導(dǎo)，可將DNA疫苗納米粒直接導(dǎo)向于DCs，以增加DCs對DNA疫苗的細胞攝?。?-5］。

聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）是近期研究最為廣泛的陽離子聚合物材料，因其較強的DNA結(jié)合和細胞轉(zhuǎn)染能力，被公認為非病毒基因載體的一個“黃金對照準則”［6-9］。根據(jù)目前的研究報道，PEI的轉(zhuǎn)染效率很大程度上依賴于其分子質(zhì)量，當分子質(zhì)量高于25 kDa（即PEI25k）時，表現(xiàn)出很高的轉(zhuǎn)染能力，但毒性也隨之增大，因其比較高的細胞毒性及在體內(nèi)無特異性轉(zhuǎn)染，使其應(yīng)用受到限制［10-11］。為了降低高分子質(zhì)量PEI的細胞毒性，同時提高靶向性，筆者根據(jù)DCs膜表面的MMR，利用PEI單體上的活潑氨基，通過還原胺化反應(yīng)，在分子中引入Man基團。由于PEI結(jié)構(gòu)中的部分氨基被Man基取代，從而降低了PEI的正電性，提高了其對DCs的靶向性。本研究是采用甘露吡喃異硫氰酸苯酯（MPITC）修飾PEI25k，得到PEI25k的Man衍生物Man-PEI25k［12］。

根據(jù)皮膚在免疫、生理和生物等方面的特性，以皮膚作為DNA疫苗接種部位有其獨特的優(yōu)勢［13-14］，而DNA疫苗經(jīng)皮免疫最大的阻力來源于皮膚外層的角質(zhì)層。微針陣列（Microneedles）技術(shù)是一種新興的物理經(jīng)皮促透方法，具有精確、高效、無痛、便利等優(yōu)勢，是替代傳統(tǒng)經(jīng)皮給藥系統(tǒng)的一種有效的治療方式［15-16］。其作用后可在角質(zhì)層產(chǎn)生微米級的空洞，從而形成能使微粒穿透到達活性表皮層的藥物通道［17］。本文主要是考察Man-PEI25k納米復(fù)合物在微針作用下的透皮性能。

1　材料

1.1儀器

FV-1000共聚焦熒光顯微鏡（澳大利亞Olympus公司）；RF-5301熒光分光光度計（日本島津公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olmypus公司）；TK-6H透皮試驗儀（上海凱偕科技貿(mào)易有限公司）；TGL-16G臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；TOTA-580Ⅲ顯微鏡成像系統(tǒng)（上海上光新光學(xué)有限公司）；電動微針（韓國Ugoigo公司，可調(diào)的針刺深度：0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mm，進針速度最高可達：1 000 r/min）。

1.2藥品與試劑

PEI25k（美國Sigma公司，CAS：9002-98-6）；Man-PEI25k納米復(fù)合物（筆者按文獻［12］方法自制得到）；水溶性羧基CdSe/ZnS量子點（QD，北京中科物源生物技術(shù)有限公司，發(fā)射波長：535 nm）；蘇木素-伊紅（HE）染色劑、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；包埋劑O.C.T.（美國Sakura公司）。

1.3動物

BALB/c小鼠，體質(zhì)量18～22 g，♂，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，合格證號：2008001652799；SD大鼠，體質(zhì)量200 g左右，♂，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供，合格證號：2008001654050。

2　方法

2.1鼠皮的制備

取SD大鼠，乙醚麻醉處死，用電動剃毛刀除去腹部毛，剝?nèi)ジ共科つw，除去皮下脂肪組織及黏連物，生理鹽水反復(fù)沖洗，鋁箔包裹，置于-80℃下保存?zhèn)溆谩ＥR使用前浸入生理鹽水，自然融化，并仔細檢查鼠皮的完整性。

2.2微針陣列皮膚刺入實驗

為了說明微針陣列對經(jīng)皮免疫的有效性和安全性，筆者考察不同規(guī)格（微針長度：0.25、0.5、1.0 mm）的微針陣列作用皮膚后所形成的微孔及皮膚自我愈合情況。用微針陣列處理6只SD大鼠腹部皮膚（2 cm×2 cm）2 min，立即頸椎脫臼處死，其中3只取皮，除去皮下脂肪組織黏連物，包埋于冰凍包埋劑O.C.T.中，-80℃下冰凍過夜；于皮膚縱行面切片，厚度7 μm，HE染色，PBS漂洗多次，磷酸-甘油封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察皮膚穿刺情況，并用顯微成像系統(tǒng)拍照記錄。另將上述微針處理過的其余3只SD大鼠繼續(xù)正常飼養(yǎng)，分別于24、72 h后，頸椎脫臼處死，取皮，冰凍切片，染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察皮膚愈合情況。

2.3微針作用下Man-PEI25k納米復(fù)合物在皮膚中的分布考察

實驗前24 h先剪去BALB/c小鼠腹部的毛，形成1 cm×1 cm的無毛區(qū)域。以熒光染料QD（帶負電荷）為模型藥物，與PEI25k、Man-PEI25k納米復(fù)合物溶液通過靜電吸附形成PEI25k/QD和不同嫁接率（1∶3、1∶6）的Man-PEI25k/QD納米復(fù)合物［12］，同時以游離的QD作為對照，在小鼠去毛的腹部皮膚上用微針陣列作用2 min。取上述納米復(fù)合物溶液，固定QD含量，涂布于微針作用區(qū)域，3 h后，用PBS清洗去除殘留在皮膚上的藥物，頸椎脫臼處死，取皮，除去皮下脂肪組織及黏連物。一部分皮膚樣本浸入O.C.T.液中包埋，-80℃下冰凍過夜，冰凍切片，每片包括表皮、真皮和皮膚附屬器（包括毛囊、汗腺、皮脂腺等），將切片直接置于共聚焦顯微鏡下中觀察熒光分布，并拍照記錄。另一部分皮膚樣本置于載玻片上，在共聚焦顯微鏡下觀察納米復(fù)合物在皮膚中的分布，以皮膚角質(zhì)層為掃描的起始點，沿垂直于皮膚角質(zhì)層的Z軸，進行逐層皮膚掃描，每隔6.66 μm掃描一次，激發(fā)波長為488 nm。同時以空白皮膚為對照，觀察皮膚自體熒光強度。

2.4體外透皮試驗

2.4.1接收液中QD含量的測定將微針陣列處理后的SD大鼠腹部皮膚固定在Franz擴散池上（有效面積0.5 cm2），角質(zhì)層面向供應(yīng)室。各取含相同量QD的PEI25k/QD和Man-PEI25k/QD納米復(fù)合物約500 μl置于供應(yīng)室中（分別平行3組），封口，防止液體蒸發(fā)；接收室中注入已超聲除氣并預(yù)熱至37℃的PBS （100 mmol/L，pH 7.4）；將擴散池放置于37℃恒溫水浴循環(huán)中持續(xù)攪拌，攪拌速度為350 r/min。在設(shè)定的時間點（3、6、12、24、48 h），從接收室中取樣1 ml，立刻補充等量新鮮接收液。樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，用熒光分光光度法測定不同時間點接收液中QD的含量，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm。

2.4.2皮膚中QD滯留量的測定共聚焦顯微鏡實驗初步證實了Man-PEI25k陽離子聚合物材料對皮膚有靶向性。為了更加凸顯其在皮膚各層的靶向性分布，筆者分離活性表皮層和真皮層，熒光定量分析了QD的滯留量。在“2.4.1”項下各設(shè)定時間點，將皮膚從擴散池中卸下，置于50℃左右的鐵板上5 min，用鑷子小心分離皮膚的活性表皮層和真皮層，分別剪碎剝離，并置于離心管中，加入10 ml萃取混合液［生理鹽水-異丙醇（9∶l）］，超聲45 min，以離心半徑8.5 cm、12 000 r/min離心20 min，取上清液，重復(fù)上述步驟，將2次上清液合并作為待測樣品。稀釋到適當濃度后，用熒光分光光度計測量其熒光值，代入標準曲線方程計算PEI25k/QD和Man-PEI25k/QD納米復(fù)合物在皮膚活性表皮層和真皮層中QD的滯留量（μmol/cm2）。

2.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計學(xué)軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示。通過t檢驗對處理組與對照組的實驗數(shù)據(jù)進行差異分析。P＜0.05時認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1微針陣列的皮膚刺入情況

不同長度微針作用于皮膚后HE染色圖見圖1。

由圖1可知，微針處理后，刺破了活體大鼠皮膚的角質(zhì)層，并在皮膚表面形成了與針體形狀尺寸相似的微通道，這可用于傳輸藥物。本實驗采用電動微針，垂直角度進針，可大大減輕創(chuàng)傷，微針處理后再正常飼養(yǎng)大鼠72 h后皮膚基本回復(fù)正常，特別是0.25 mm微針處理的皮膚愈合情況比較理想。故本研究以下實驗都采用0.25 mm微針給藥。0.25 mm微針作用24、72 h后皮膚的HE染色圖見圖2（其他圖略）。

圖1　不同長度微針作用于皮膚后HE染色圖Fig 1　HE staining of skin after pierced by microneedles with different lengths

圖20　.25mm微針作用24、72h后皮膚的HE染色圖Fig 2　HE staining of skin after pierced by 0.25 mm microneedle for 24，72h

3.2微針遞送的納米復(fù)合物在皮膚中的分布

不同條件下皮膚切片中QD分布的共聚焦顯微鏡圖見圖3。

圖3　不同條件下皮膚切片中QD分布的共聚焦顯微鏡圖Fig 3　Distribution of QD in skin section under different conditions observed by confocal microscopy

由圖3可知，微針遞送Man-PEI25k納米復(fù)合物后活性表皮層和真皮層中熒光強度明顯高于PEI25k納米復(fù)合物，這說明Man-PEI25k能將藥物靶向傳遞于皮膚中甘露糖受體高表達的LCs所在的活性表皮層和真皮層。此外，Man-PEI25k（1∶6）介導(dǎo)的QD在活性表皮層和真皮層的熒光強度明顯高于Man-PEI25k（1∶3），這說明Man配體在PEI25k分子中的嫁接率會影響載體材料介導(dǎo)的效率，Man在整個載體材料中比例不宜過大，這部分將進行后續(xù)研究。

以Z軸掃描觀察不同條件下皮膚內(nèi)QD的共聚焦掃描電鏡圖見圖4。

由圖4空白皮膚的逐層掃描情況可知，其在488 nm激發(fā)光下幾乎沒有自發(fā)熒光，說明皮膚本身對實驗的觀察無干擾。微針作用下Man-PEI25k/QD（1∶6）在皮下可達到66.6 μm，而微針作用下PEI25k/QD和QD只達到皮下39.96 μm。

3.3體外透皮試驗

3.3.1量子點QD的標準曲線以QD溶液的熒光值（y）為縱坐標、QD溶液的濃度（x）為橫坐標，得到標準曲線方程為y= 13 183x-1.845 3（r2=0.999 7）。結(jié)果表明，QD在0.001～0.018 μmol/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3.2接收液中QD的含量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體外透皮48 h后，在接收液中沒有檢測到納米粒。曾有人研究表明經(jīng)毛囊遞送納米粒，也未能在接收液中檢測到納米粒［11］。

圖4　以Z軸掃描觀察不同條件下皮膚內(nèi)QD的共聚焦掃描電鏡圖Fig 4　Confocal SEM micrograph of QD in skin under different conditions observed by Z-axis scanning

3.3.3皮膚中的QD滯留量隨著納米復(fù)合物與皮膚作用時間的延長，納米復(fù)合物滲透進入皮膚內(nèi)的量也隨之增加；在不同設(shè)定時間點，微針作用下在活性表皮層和真皮層中的QD滯留量均明顯高于不用微針的情況（P＜0.01）。微針作用后48 h，Man-PEI25k/QD納米復(fù)合物在活性表皮層的滯留量約比PEI25k/QD增加2倍，真皮層的滯留量增加1.5倍。Man-PEI25k/QD納米復(fù)合物在活性表皮層的滯留量明顯高于在真皮層中的量（P＜0.01）。該結(jié)果與熒光定性實驗結(jié)果符合，說明微針作用能將Man-PEI25k/QD納米復(fù)合物靶向作用于活性表皮層。PEI25k/QD、Man-PEI25k/QD納米復(fù)合物在活性表皮層和真皮層中的累積滯留量見圖5。

4　討論

以微針作用于鼠的離體或在體皮膚，Man-PEI25k/QD納米復(fù)合物在皮膚活性表皮層的量明顯大于PEI25k納米復(fù)合物，并且不同嫁接率的Man-PEI25k介導(dǎo)QD在活性表皮層的量存在明顯差異。在體外透皮擴散實驗中發(fā)現(xiàn)，微針作用下，在預(yù)定時間內(nèi)，納米復(fù)合物無法透過皮膚層進入接收池中；且發(fā)現(xiàn)體外擴散后，Man-PEI25k/QD納米復(fù)合物在皮膚活性表皮層的量明顯大于PEI25k/QD納米復(fù)合物。微針作用后48 h，Man-PEI25k/QD組表皮層滯留量約比PEI25k/QD增加2倍，真皮層滯留量增加1.5倍。這說明微針可提高Man-PEI25k/QD納米復(fù)合物在活性表皮層的透皮性能，為進一步研究經(jīng)皮免疫給藥奠定了基礎(chǔ)。

經(jīng)皮免疫將皮膚作為免疫系統(tǒng)，其主要針對分布在皮膚活性表皮層和真皮層的專職抗原呈遞細胞。微針屬于微創(chuàng)性的傳遞系統(tǒng)，精準地調(diào)節(jié)微針刺入長度，使其不觸及痛覺神經(jīng)幾乎可以實現(xiàn)無痛。利用受體配體特異性結(jié)合的特性修飾載體，其載藥后能更加高效地傳遞抗原至抗原呈遞細胞，進而引發(fā)系列強大的免疫應(yīng)答。因此，靶向性微針經(jīng)皮免疫，是一種將皮膚滲透性、抗原的免疫刺激性和樹突細胞的抗原呈遞的高度靶向性相結(jié)合的治療新策略，其能極大地提高免疫自主性，具有著廣闊的實際應(yīng)用前景。

圖5　PEI25k/QD、Man-PEI25k/QD納米復(fù)合物在活性表皮層和真皮層中的累積滯留量注：＊P＜0.05；＊＊P＜0.01；＊＊＊P＜0.001Fig 5　Accumulative retention amount of PEI25k/QD and Man-PEI25k/QD nanocomplexes in active epidermal layer and dermisNote：＊P＜0.05；＊＊P＜0.01；＊＊＊P＜0.001

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（編輯：鄒麗娟）

Study on the Percutaneous Properties of Man-PEI25kNanocomplex under the Treatment of Microneedles

XU Jiaojiao1，2，YANG Yunxu1，XU Beihua1，HU Ying1
（1.Zhejiang Pharmaceutical College，Zhejiang Ningbo 315100，China；2.School of Pharmacy，Wenzhou Medical University，Zhejiang Wenzhou 325000，China）

OBJECTIVE：To study the percutaneous properties of Man-PEI25knanocomplex under the treatment of microneedles. METHODS：Using fluorescent dye water-soluble carboxyl CdSe/ZnS quantum dot（QD）as model drug，Man-PEI25k/QD and Man-PEI25k/QD nanocomplex with different grafting rates（1∶3，1∶6）were formed through electrostatic adherence with PEI25kand Man-PEI25k.The distribution of QD in the active epidermal layer and dermis of skin were observed by confocal microscopy after the treatment of microneedles，using free QD as control.The accumulative retention amounts of QD in the active epidermal layer and dermis of skin were determined by fluorescence spectrophotometer after PEI25k/QD and Man-PEI25k/QD nanocomplex treated with microneedles.RESULTS：The amounts of Man-PEI25k/QD nanocomplex in active epidermal layer and dermis were significantly higher than that of PEI25k/QD nanocomplex under the treatment of microneedles in vivo；the amounts of Man-PEI25k/QD（1∶6）nanocomplex in active epidermal layer and dermis of skin were significantly higher than that of Man-PEI25k/QD（1∶3）nanocomplex.In in vitro transdermal diffusion experiments，microneedles could increase the retention amounts of nanocomplex in active epidermal layer and dermis of skin significantly.The retention amounts of Man-PEI25k/QD nanocomplex in active epidermal layer were increased by 2 times of that of PEI25k/QD under the treatment of microneedles after 48 h；at the same time，in the dermis that was increased by 1.5 times，with statistical significance（P＜0.01）.CONCLUSIONS：Microneedles can improve the percutaneous properties of Man-PEI25knanocomplex in active epidermal layer.

Man-PEI25k；Nanocomplex；Microneedles；Transdermal drug delivery；Water-soluble carboxyl CdSe/ZnS quantum dot

R965

A

1001-0408（2016）22-3062-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.12

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃暨新苗人才計劃項目（No.2013R433003）；寧波市第二批科技項目（No.2015C110027）；寧波市科技創(chuàng)新團隊項目

＊碩士研究生。研究方向：藥物新劑型、新技術(shù)。電話：0574-88222707。E-mail：1037979619@qq.com

教授。研究方向：藥物新劑型、新技術(shù)。電話：0574-88222707。E-mail：pharmhawk@126.com

2015-12-05

2016-03-17）