沈　菲　陳藝杰　徐曉蘭　繆曉青　吳珍紅

（1福建農(nóng)林大學(xué)，福州350002；2福建農(nóng)林大學(xué)蜂療研究所，福州 350002；3天然生物毒素國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，福州 350002）

蜂膠對(duì)煙曲霉抑菌機(jī)制的體外研究

沈菲1，2陳藝杰1，2徐曉蘭1，2，3繆曉青1，2，3吳珍紅1，2，3

（1福建農(nóng)林大學(xué)，福州350002；2福建農(nóng)林大學(xué)蜂療研究所，福州 350002；3天然生物毒素國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，福州 350002）

探討蜂膠對(duì)煙曲霉的抗菌作用及其作用機(jī)制，為蜂膠臨床治療由煙曲霉引起的疾病提供參考依據(jù)。本文采用不同濃度（10、20、30、40、50、100、150、200 mg/ml）的蜂膠乙醇提取物（EEP）處理煙曲霉孢子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其存在劑量依賴性，接著瓊脂稀釋法測定蜂膠的最小抑菌濃度（MIC），將煙曲霉與1/2MIC50EEP孵育3d后發(fā)現(xiàn)，蜂膠組煙曲霉菌絲的重量和呼吸速率顯著低于對(duì)照組，且蜂膠組孢子的超微結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損。通過半定量PCR分析磷脂腺肌醇信號(hào)通路相關(guān)的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)蜂膠組PKC基因與對(duì)照組相比呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。這些結(jié)果暗示，蜂膠能夠抑制煙曲霉的生長，具有治療由煙曲霉引起的疾病的潛力，是一種有前途的生物活性化合物。

蜂膠；煙曲霉；體外研究；PKC；作用機(jī)制

引言

蜂膠是蜜蜂采集膠源植物芽孢或樹脂，與上顎腺、蠟腺分泌物混合加工得到的具有特殊芳香性的膠狀產(chǎn)物［1］，含有類黃酮、氨基酸、維生素等多種成分［2］。它擁有廣泛的生物屬性，包括抗氧化［3］、抗菌［4］、消炎［5］、保肝［6］、抗腫瘤［7］及免疫調(diào)節(jié)［8］等。最常見的應(yīng)用之一就是其對(duì)許多革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌、酵母和真菌的抗菌活性。最近，一些研究表明，蜂膠具有很強(qiáng)的抗真菌活性，如抑制炭疽菌的遺傳轉(zhuǎn)化及球二孢屬、意大利青霉和青霉屬的生長［9］。

煙曲霉是淺部感染的常見病原菌，主要感染免疫低下患者，其導(dǎo)致的侵襲性曲霉病死亡率達(dá)到30～90%。同時(shí)煙曲霉也會(huì)侵襲皮膚，導(dǎo)致皮膚發(fā)炎［10］。目前治療由煙曲霉引起的疾病的藥物主要是化學(xué)合成的。隨著這些藥物的廣泛應(yīng)用，在抗真菌治療中遇到了耐藥性、不良反應(yīng)多等問題，導(dǎo)致治療真菌感染越來越困難，因此迫切需要尋找天然的抗真菌藥物［11］。

蛋白激酶C（PKC）是由相關(guān)蛋白構(gòu)成的一個(gè)大家族［12］，參與酵母菌菌絲及哺育動(dòng)物細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控和信號(hào)傳導(dǎo)［13］。同時(shí)PKC參與磷脂酰肌醇信號(hào)通路，調(diào)節(jié)Ca2+離子通路，為生物的生長發(fā)育的重要途徑［14］。

蜂膠為天然產(chǎn)品，具有廣譜抗菌、不良反應(yīng)小、較少出現(xiàn)耐藥等優(yōu)點(diǎn)。因此，蜂膠可以用于治療真菌引起的疾病。雖然蜂膠抗真菌的研究開發(fā)已引起人們的重視，但主要還是局限于蜂膠對(duì)白色念珠菌的抑制作用，對(duì)其機(jī)制的研究和報(bào)道很少［15-19］。因此，深入研究蜂膠對(duì)煙曲霉的抑菌機(jī)理，尋找蜂膠對(duì)煙曲霉的作用靶點(diǎn)，為蜂膠治療由煙曲霉引起的疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料

煙曲霉分離株，分離號(hào)：AS3.3572，購自上海北諾生物科技有限公司。毛膠購自神蜂科技開發(fā)有限公司，陽性藥物伊曲康唑購自某藥店。乳酸酚棉藍(lán)染色液為上海源葉生物科技有限公司。微量呼吸儀，SKW-3型，上海科技大學(xué)。

2　方法

2.1EEP的制備

將毛膠置于-20℃冰箱中冷凍2 h以上，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過80目篩網(wǎng)，粉末按料液比為1∶4加入70%乙醇（v/v），25℃恒溫振蕩48 h后，過濾除雜，40℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除酒精，然后放入60℃烘箱干燥至恒重，得到蜂膠浸提膏。用時(shí)，70%乙醇配成不同濃度，0.22μm無菌過濾膜過濾滅菌。

2.2孢子懸液的制備

煙曲霉在35℃的恒溫箱中培養(yǎng)3天后，用0.1%的吐溫80的生理鹽水沖洗培養(yǎng)基，無菌紗布除去洗脫液中的菌絲，用血球細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整分生孢子懸液的濃度為1.0×106～5.0×106CFU/ml，4℃保存24 h。

2.3不同濃度EEP抑制煙曲霉生長

利用打孔瓊脂培養(yǎng)法分別測定濃度為10、20、30、40、50、100、150 mg/ml的EEP對(duì)煙曲霉菌的抑菌圈大小。70%乙醇作為陰性對(duì)照，無菌水作為空白對(duì)照，伊曲康唑作為陽性對(duì)照。

2.4瓊脂稀釋法測定EEP的MIC

EEP按不同體積加入到培養(yǎng)基中，使其終濃度分別為：100 μg/ml、200 μg/ml、300 μg/ml、400 μg/ml、500 μg/ml、1000μg/ml。待冷卻至室溫后，用槍頭吸取5μL孢子懸液扎入培養(yǎng)基中，同時(shí)設(shè)立溶劑組（加70%乙醇），陽性對(duì)照組（添加伊曲康唑），陰性對(duì)照組（不加藥物也不加孢子懸液），空白對(duì)照組（加無菌水）。35°C連續(xù)培養(yǎng)7 d后觀察結(jié)果，將固體培養(yǎng)基中無菌落生長的濃度確定為最小抑菌濃度（MIC）。

2.5EEP對(duì)煙曲霉菌絲重量及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

2.5.1菌絲稱量

所有菌絲體采用液體培養(yǎng)，加入EEP，使其終濃度為1/2MIC50，加入孢子懸液，使其終濃度為106CFU/ml，同時(shí)設(shè)立如2.4所示的溶劑組、陽性對(duì)照組、空白對(duì)照組。35°C、180rpm培養(yǎng)3d后收集菌絲，用pH=7.4的無菌PBS12000rpm離心10min，共漂洗3次，棄去廢液，將菌絲挑出移到一干凈的離心管中，置于干燥箱中干燥至恒重后，稱量菌體干重。

2.5.2顯微觀察

用接種針挑取實(shí)驗(yàn)2.4中1/2MIC50平板上的煙曲霉孢子到載玻片上，用乳酸酚棉藍(lán)染色。將載玻片置于普通光學(xué)顯微鏡觀察，比較其菌絲及孢子形態(tài)和孢子數(shù)量的變化。

2.6EEP對(duì)煙曲霉呼吸的影響

煙曲霉的呼吸率表示為耗氧量。耗氧量測量是利用微量呼吸儀進(jìn)行測定的。具體方法如下，0.1ml 1.0× 106CFU/ml孢子懸液和EEP添加進(jìn)10ml PDA液體培養(yǎng)基中，混勻后吸取2ml到微量呼吸瓶中，添加0.5 ml 0.1mol/L的NaOH吸收瓶中，吸收瓶中另加1×3cm的濾紙片，以增大吸收面。整個(gè)反應(yīng)裝置在35℃水浴搖動(dòng)培養(yǎng)，每4h記錄液面下降的高度。通過公式：

XO2=K·h（1）

其中：XO2為耗氧量 （uL/h），K為反應(yīng)瓶常數(shù)，h為測壓管開口端液面下降量。

其中：K為反應(yīng)瓶常數(shù)，V為反應(yīng)瓶至測壓臂右端規(guī)定刻度之空間容積減去V'和NaOH溶液、濾紙的體積，V'加入反應(yīng)瓶中的溶液量，T0為273+水浴溫度（35℃），T為273，α為O2在37℃下液體中的溶解度，P0在一個(gè)大氣壓下，壓力計(jì)中膽酸鈉液面應(yīng)呈現(xiàn)的高度，通常以1000計(jì)算。

未添加EEP作為空白對(duì)照組，添加70%乙醇作為溶劑組。

2.7RNA提取和RT-PCR

1/2MIC50EEP處理煙曲霉后，離心收集菌絲，利用TransZol up（北京全式金有限公司）提取菌絲體的RNA，參照TaKaRa公司PrimeScripTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成cDNA。然后用北京艾德萊生物技術(shù)有限公司super PCR mix反應(yīng)體系進(jìn)行半定量PCR。以GAPDH為內(nèi)參，引物序列如下。GAPDHF：5’-GAAGAGTGCGACCTATGA-3’和GAPDHR：5’-CGAGATACCAGCCTTGATA-3’）及PKCF：5’-AAGTTCTGTTGGCTCTCA-3’和PKCR：5’-AATCTTGATGTGTCCGTCTA-3’）。PCR條件為：94℃預(yù)變性3 min，然后94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸10 min，共36個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃保持10 min。PCR結(jié)束后，取5 μL進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測，將瓊脂糖膠拍照后對(duì)其條帶用J Image軟件進(jìn)行灰度分析。

3　數(shù)據(jù)分析

4　結(jié)果

4.1不同濃度EEP對(duì)煙曲霉抑制作用

不同濃度蜂膠處理煙曲霉后，蜂膠組抑菌圈直徑顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性，但是當(dāng)蜂膠濃度達(dá)到100 mg/ml時(shí)達(dá)到飽和狀態(tài)（如圖1）。

圖1　不同濃度EEP對(duì)煙曲霉抑菌圈直徑的影響注：A表示無菌水；B表示溶劑組；C表示陽性對(duì)照組；D、E、F、G、H、I、J分別表示10、20、30、40、50、100、150 mg/ml的EEP。

4.2平板稀釋法測定EEP對(duì)煙曲霉的MIC

本文比較了煙曲霉在蜂膠含量不同的PDA平板上7d的生長情況，結(jié)果顯示當(dāng)EEP濃度為1000μg/ml時(shí)，煙曲霉不能生長，即EEP的MIC為1000μg/ml（圖2）。從圖2中可以看出：空白對(duì)照組的生長速度明顯要快于蜂膠組。

圖2　蜂膠抗煙曲霉瓊脂平板稀釋法藥敏實(shí)驗(yàn)注：A表示空白對(duì)照組；B表示溶劑組；C表示陽性對(duì)照組；D、E、F、G、H、I分別表示 100、200、300、400、500、1000μg/ml的EEP。

4.3EEP對(duì)煙曲霉菌絲重量及超微結(jié)構(gòu)的影響

表1　蜂膠對(duì)煙曲霉菌絲重量的影響（±s）

表1　蜂膠對(duì)煙曲霉菌絲重量的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組相比，*P＜0.05；n=3

組別　干重（mg）空白對(duì)照組　583.0667±10.9294陽性對(duì)照組　97.2667±25.34252*溶劑組　444.9333±1.30512*蜂膠組　16.0000±2.45561*

圖3　蜂膠對(duì)煙曲霉形態(tài)的影響注：A、C表示空白對(duì)照組，B、D、E、F表示500μg/ml蜂膠處理組

表1結(jié)果表明，對(duì)照組煙曲霉的干重為583.0667± 10.9294 mg，而蜂膠組的干重為16.0000±2.4556 mg，陽性對(duì)照組的干重為97.2667±25.3425 mg。說明蜂膠和伊曲康唑都抑制了煙曲霉的生長。

乳酸酚棉蘭染色后，在200和400倍光學(xué)顯微鏡下可以清楚的看到空白對(duì)照組和蜂膠組的煙曲霉，其顯微結(jié)構(gòu)存在顯著差異（圖3）：正常煙曲霉的分生孢子梗無分隔，分生孢子頭為柱狀，頂囊呈半圓形，菌絲排列整齊（圖3-A、C）；而蜂膠作用后的煙曲霉形態(tài)發(fā)生了改變，在圖3-B、D、E、F組中，可以看出此時(shí)的煙曲霉的分生孢子鏈變長，分生孢子梗出現(xiàn)分隔（圖3-F），部分細(xì)胞頂囊發(fā)育不完全（圖E）；從圖3-A、B的對(duì)比可以看出，蜂膠組的煙曲霉菌絲明顯較空白對(duì)照組煙曲霉菌絲不規(guī)則。

4.4EEP對(duì)煙曲霉呼吸的影響

如圖4所示，蜂膠明顯降低煙曲霉孢子的呼吸率。培養(yǎng)20 h后，蜂膠組煙曲霉的耗氧速率（2.067±0.5686 μL/h）顯著低于空白對(duì)照組（6.000±0.2646 μL/h）。因此，蜂膠干擾煙曲霉孢子萌發(fā)和菌絲的生長階段的能量代謝系統(tǒng)。

圖4　EEP對(duì)煙曲霉呼吸的影響

4.5EEP對(duì)煙曲霉PKC基因的影響

將圖5中得到的瓊脂糖電泳圖各條帶進(jìn)行灰度分析，將目標(biāo)基因PKC條帶的灰度值與內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)煙曲霉PKC基因在實(shí)驗(yàn)組中比對(duì)照組中表達(dá)降低了37.2倍（圖6）。因此，蜂膠對(duì)煙曲霉PKC基因的表達(dá)有下調(diào)作用，推測蜂膠可以通過抑制煙曲霉PKC基因的表達(dá)抑制煙曲霉菌的生長。

5　討論與結(jié)論

蜂膠是一種比較復(fù)雜的化合物，可能的單體化合物有200多種，其中最主要的兩大類成分為黃酮和酚酸?，F(xiàn)目前能夠分離出來的活性成分主要有咖啡酸酯、高良姜素、咖啡酸苯乙酯、松屬素等。高良姜素、咖啡、肉桂酸是蛋白酶抑制劑，負(fù)責(zé)阻止細(xì)菌生長和增殖。其他黃酮類化合物，如槲皮素，影響膜電位，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜透性上升，抑制細(xì)菌活性。很明顯，蜂膠的抗菌活性的機(jī)制是復(fù)雜的［20］。蜂膠具有抗真菌活性主要?dú)w功于黃酮類、酚酸類以及酯類，這些化合物統(tǒng)稱酚類化合物［21］。黃酮類成分中高良姜素、松屬素、槲皮素等已確認(rèn)對(duì)真菌有很強(qiáng)的抑制作用［22］；最近，Agüero等人從阿根廷當(dāng)?shù)氐姆淠z中分離出來的木酚素、白楊素、松屬素和高良姜素鑒定為當(dāng)?shù)胤淠z的主要抗真菌化合物［23］。酚酸類物質(zhì)及其衍生物也表現(xiàn)強(qiáng)烈的活性，Boonsai等從泰國意蜂蜂膠中分離出了腰果酚，發(fā)現(xiàn)腰果酚是泰國意蜂蜂膠的主要抗菌化合物之一，該結(jié)果與Silva等研究的巴西蜂膠中抗菌化合物結(jié)果一致，酚類化合物的含量越高，抗菌效果越好［24-25］。萜類物質(zhì)也有很強(qiáng)的抑菌作用：Sirikarn等從Tetragonula laeviceps蜂膠中分離出氧雜蒽酮，三萜烯和木酚素。其中三萜烯是這種蜂膠的主要抗菌活性成分［26］。

圖5　煙曲霉PKC基因半定量PCR瓊脂糖電泳圖

圖6　EEP對(duì)煙曲霉PKC基因的影響

FaLcao等人研究了不同蜜源植物的蜂膠對(duì)三種真菌的抑制作用，其中對(duì)煙曲霉的抗菌活性最強(qiáng)，且隨著酚類物質(zhì)含量的不同，抗菌活性也有所不同［15］。該結(jié)果與本文的研究結(jié)果相同，隨著蜂膠濃度的升高，酚類物質(zhì)的含量也相應(yīng)升高，所形成的抑菌圈也相應(yīng)的增大，當(dāng)濃度達(dá)到100 mg/ml時(shí)，蜂膠在瓊脂平板中的擴(kuò)散達(dá)到飽和。

煙曲霉的繁殖周期分為二個(gè)時(shí)期：茵絲發(fā)育的營養(yǎng)生長期和產(chǎn)生分生孢子的無性繁殖期［27］。因此，影響煙曲霉繁殖周期都會(huì)導(dǎo)致煙曲霉的生長受到抑制。本文的研究結(jié)果首次表明，蜂膠可以改變煙曲霉的形態(tài)，使其產(chǎn)孢率減少，從而抑制煙曲霉的繁殖與生長。通過電子顯微鏡觀察（如圖3-B、D、E、F），得出很有可能是蜂膠通過某些抗菌活性物質(zhì)通過滲透方式進(jìn)入煙曲霉細(xì)胞內(nèi)，干擾細(xì)胞內(nèi)的某些信號(hào)通路和相關(guān)基因的表達(dá)，抑制煙曲霉的生長及分生孢子的產(chǎn)生，從而達(dá)到抑制煙曲霉的目的。

呼吸是大多數(shù)微生物萌發(fā)和生長過程中所需的能量主要來源，破壞微生物的能量系統(tǒng)是某些藥物具有抗菌活性機(jī)制之一，如殼聚糖、甘草查爾酮A和C［28-30］。有研究表明，蜂膠中的松屬素對(duì)意大利青霉呼吸會(huì)產(chǎn)生影響，松屬素通過直接抑制線粒體的呼吸，導(dǎo)致ATP、能量載體減少，進(jìn)而導(dǎo)致煙曲霉的代謝紊亂［9］。本文首次提出蜂膠抑制煙曲霉的呼吸，抑制孢子萌發(fā)與菌絲的生長，干擾菌體的能量代謝系統(tǒng)。

PKC參與磷脂酰肌醇信號(hào)通路，參與Ca2+的調(diào)節(jié)［14］。在磷脂酰肌醇信號(hào)通路中磷脂酶C（PLC-β）與PKC為最主要的調(diào)控蛋白之一，活化的PLC-β使4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）水解成1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）和二?；视停―G），DG可活化PKC，IP3與其配體結(jié)合打開鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)通路。PKC可以使絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化，導(dǎo)致不同的細(xì)胞產(chǎn)生不同的反應(yīng)，如細(xì)胞分泌、細(xì)胞增殖和分化等［31］。因此，當(dāng)PKC基因表達(dá)受到抑制后，就會(huì)導(dǎo)致鈣調(diào)通道及其磷脂酰肌醇信號(hào)通路受到影響，可能會(huì)導(dǎo)致煙曲霉生長受到抑制。

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Propolis on Aspergillus fumigatus antifungal mechanisms in vitro

Shen Fei1，2Chen Yijie1，2Xu Xiaolan1，2，3Miao Xiaoqing1，2，3Wu Zhenhong1，2，3
（1 Fujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)u Zhou 350002；2 Apitherapy institute of fujian agriculture and forestry university，F(xiàn)u Zhou 350002；3 Natural biological toxin national local joint engineering laboratory，F(xiàn)uzhou 350002）

To investigate the effects of propolis on A.fumigatus，so as to provide guidance for clinical treatment of the A.fumigatus infection.Using different concentrations（10，20，30，40，50，100，150，200 mg/ml）of ethanolic extract of propolis（EEP）to deal with A.fumigatus spores found that a dose-dependent relationship between propolis and bacteriostatic ring size.Next，the minimum inhibitory concentrations（MIC）of propolis were determined by agar dilution method，A.fumigatus mycelium weights and spores respiratory rate were significantly inhibited when exposure to 1/ 2MIC50of propolis.Unltrastructure of spore was seriously damaged with propolis incubation for 3d，which was further confirmed by soluble protein loss of A.fumigatus mycelia treated with propolis.Seni-quantitative PCR found Phosphatidylinositol signal pathway related PLC gene expression down-regulated.These results suggest propolis can inhibit the growth of A.fumigates.and have a promising potential to treat pneumonia caused by A.fumigates.

propolis；Aspergillus fumigatus；in vitro；PKC；mechanism

國家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-45-KXJ19）

沈菲（1990-），女，湖北孝感人，在讀碩士，研究方向：蜂產(chǎn)品醫(yī)療與保健。

吳珍紅（1964-），女，研究員，研究方向：蜂產(chǎn)品醫(yī)療與保健，E-mail：wzh516@126.com。