張獻(xiàn)

廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530000

納米孔技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)的研究新突破

張獻(xiàn)

廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530000

目的 探討納米孔技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)的研究新突破。方法 應(yīng)用氮化硅材料納米孔芯片，初步研究金納米棒及BSA易位行為，建立應(yīng)用納米孔檢測(cè)納米顆粒樣品及蛋白質(zhì)生物分子樣品方法，統(tǒng)計(jì)分析納米顆粒的易位信號(hào)及蛋白質(zhì)分子信號(hào)；按照實(shí)驗(yàn)所獲得的易位信號(hào)，總結(jié)常見的易位信號(hào)類型；按照實(shí)驗(yàn)結(jié)果模擬固態(tài)納米孔內(nèi)電場(chǎng)及納米孔周圍電場(chǎng)，獲得不同電壓下同一納米孔的電場(chǎng)強(qiáng)度比較。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)選擇孔徑為78 nm的固態(tài)納米孔檢測(cè)蛋白質(zhì)BSA，將溶于1M KCl溶液內(nèi)的樣品，加入至流體內(nèi)，偏置電壓變換獲得BSA分子過孔信號(hào)圖；選擇76 nm的納米孔在980 mV、900 mV、400 mV電壓下檢測(cè)12 nm的蛋白質(zhì)BSA分析易位結(jié)果，易位事件的原始信號(hào)如圖2；400 mV電壓下納米孔與蛋白質(zhì)的相互作用較強(qiáng)，易位事件相對(duì)較為分散，而980 mV及900 mV電壓下，納米孔與蛋白質(zhì)分子的作用時(shí)間較短，分子過孔速度較快，出現(xiàn)的易位事件也較多；激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，BSA在自然折疊態(tài)時(shí)內(nèi)源熒光發(fā)射峰的最大發(fā)射波長(zhǎng)位于346 nm附近，說明色氨酸殘基部分被隱藏；隨著尿素濃度的升高，BSA的相對(duì)熒光強(qiáng)度逐漸下降，出現(xiàn)熒光猝滅現(xiàn)象，說明BSA及尿素發(fā)生作用，導(dǎo)致BSA變性，但在0～5 M時(shí)，蛋白質(zhì)出現(xiàn)部分變性，6 M后，峰值出現(xiàn)顯著紅移，BSA完全變性；蛋白質(zhì)BSA和經(jīng)尿素變性后的BSA易位原始信號(hào)圖：BSA加入后，電流基線較波動(dòng)，后出現(xiàn)易位信號(hào)，蛋白質(zhì)易位時(shí)間的長(zhǎng)短，與BSA與孔的作用及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)；加入經(jīng)尿素變性的BSA后，電流基線總體穩(wěn)定但變細(xì)，易位信號(hào)峰頂端較尖。結(jié)論氮化硅納米孔檢測(cè)蛋白質(zhì)應(yīng)用為后續(xù)的納米孔傳感器在蛋白質(zhì)研究中提供理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)研究；信號(hào)檢測(cè)；BSA；固態(tài)納米孔

隨著近年來納米孔檢測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展，固態(tài)納米孔因其尺寸極易掌握，且其穩(wěn)定性較佳，是科學(xué)研究的熱點(diǎn)內(nèi)容，但對(duì)于檢測(cè)蛋白質(zhì)等生物大分子和變性劑與蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系研究則較少[1]。鳥叔是蛋白質(zhì)變性劑的常見類型之一，可促使蛋白質(zhì)變性，有助于蛋白質(zhì)的解折疊及折疊機(jī)制進(jìn)行了解；血清白蛋白主要進(jìn)行PH值及血液滲透壓的調(diào)節(jié)，同時(shí)可運(yùn)送類固醇、氨基酸、脂肪酸等多種物質(zhì)[2]。牛血清蛋白是體積較大的球蛋白，其水溶性將，可用于研究蛋白質(zhì)變性機(jī)制。本研究探析應(yīng)用固態(tài)納米孔檢測(cè)技術(shù)研究經(jīng)尿素變性的BSA及BSA的易位行為，效果滿意，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

中國電子集團(tuán)第55研究所制備納米孔芯片、氮化硅薄膜，南京大學(xué)固體微結(jié)構(gòu)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的聚焦粒子束加工系統(tǒng)完成刻蝕納米孔；在pH7.0的PBS溶液內(nèi)溶解BSA白色粉末，獲得BSA樣品溶液，檢測(cè)前在已過濾的1M氯化鉀溶液內(nèi)稀釋樣品溶液，配制成檢測(cè)工作液，分成小份，在-20°C冰箱內(nèi)置存，另取工作液加入已過濾的尿素6 M，待變性后為另一檢測(cè)液；超純水中溶解尿素粉末，配制出0 M、1 M、2 M、3 M、4 M、5 M、6 M、7 M、8 M濃度的溶液，與相同濃度的蛋白質(zhì)相互作用，為紫外熒光檢測(cè)的溶液；氯化鉀7.45 g在100 mL超純水內(nèi)溶解，配制為1 mol/L的氯化鉀溶液，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)用0.02 μm濾膜過濾；聚二甲基硅烷PDMS、乙醇、30%雙氧水溶液500 uL加入試管內(nèi)，加入濃硫酸1500 uL，混勻充分。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

電位粒度分析儀（N4PLUS）、熒光光譜儀。水浴鍋、氮?dú)馄?（流體和干燥芯片）、Anotop0.02 um濾膜（Whatman）、Ag/AgCl自制電極，自制微流體裝置，自制屏蔽箱（屏蔽特性：130×85×65 cm3＞60 dB），膜片鉗放大器（Axopatch 700 B）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

①制備芯片：熱氧化硅晶圓后在上下兩面生長(zhǎng)約100 nm厚的二氧化硅薄膜，低壓氣象化學(xué)沉積法（LPCVD）在兩面分別沉積500 nm及100 nm厚的氮化硅薄膜，光刻膠涂于500 nm厚的氮化硅面，曝光后予以反應(yīng)離子刻濁（RIE），形成500 um×500 um的正方形窗口；氫氟酸濕法進(jìn)行腐蝕，至表面氮化硅層停止，形成100 nm厚的自支撐氮化硅薄膜，應(yīng)用聚焦粒子束加工系統(tǒng)予以打孔，按照粒子束大小和打孔時(shí)間評(píng)估納米孔孔徑的制備大小情況；②芯片表征：檢測(cè)氮化硅薄膜是否完整，表征方法暴露制備伏安特性曲線及顯微鏡下觀察評(píng)估納米孔的電化學(xué)特性；③實(shí)驗(yàn)前處理流體及芯片：離心管加滿2 mL超純水，將芯片放入后初洗，后放入新配置的1.2 mL食人魚溶液的玻璃燒杯內(nèi)，90°C水浴內(nèi)放入燒杯30 min，燒杯取出，自然冷卻至室溫，后取出芯片，應(yīng)用大量超純水沖洗，芯片沖洗后放入裝有超純水的離心管內(nèi)置存?zhèn)溆茫幻看螒?yīng)用前應(yīng)用吸水紙水分吸干或氮?dú)獯蹈?；超純水徹底清洗PDMS密封墊片及流體裝置，超聲清洗30 min，氮?dú)獯蹈?；④配制不同濃度的KCl電解液及樣品溶液：超純水中溶解蛋白質(zhì)BSA粉末配制為1 mM的樣品溶液，根據(jù)需要稀釋至50 nM、100 nM、500 nM、1 uM、2 uM、5 uM、10 uM、50 uM、100 uM、500 uM等不同濃度，分裝為小份在-20°C下置存；配制KCl濃度為1M電解質(zhì)溶液，根據(jù)需要稀釋至濃度為0.1 M及0.4 M，過濾備用；⑤組裝檢測(cè)裝置：在PDMS密封墊上放置納米孔芯片，左右流體部分放入鋁制模具內(nèi)，螺栓旋緊固定；為避免加樣過程中出現(xiàn)氣泡，PDMS膠固定兩根特氟龍軟管，1 mL注射器插入特氟龍軟管內(nèi)部加樣；⑥檢測(cè)樣品易位信號(hào)及分析：樣品溶液加完后，將一對(duì)Ag/AGCl自制電極放入兩根特氟龍軟管內(nèi)，流體裝置放入大屏蔽箱內(nèi)，電極另一端接好膜片鉗放大器探頭，注意電極對(duì)應(yīng)；施加電壓后，膜片鉗放大電流信號(hào)，經(jīng)由數(shù)據(jù)采集卡顯示于上位機(jī)顯示屏。偏置電壓，樣品濃度改變，改變濕度、溫度、電解液KCl濃度改變納米孔對(duì)蛋白質(zhì)BSA檢測(cè)調(diào)節(jié)，得到蛋白質(zhì)BSA過孔信號(hào)。應(yīng)用膜片鉗自帶軟件Clampfit0.3分析記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 易位信號(hào)的統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)選擇孔徑為78 nm的固態(tài)納米孔檢測(cè)蛋白質(zhì)BSA，將溶于1M KCl溶液內(nèi)的樣品，加入至流體內(nèi)，偏置電壓變換獲得BSA分子過孔信號(hào)圖（圖1）；選擇76 nm的納米孔在980 mV、900 mV、400 mV電壓下檢測(cè)12 nm的蛋白質(zhì)BSA分析易位結(jié)果，易位事件的原始信號(hào)如圖2；400 mV電壓下納米孔與蛋白質(zhì)的相互作用較強(qiáng)，易位事件相對(duì)較為分散，而980 mV及900 mV電壓下，納米孔與蛋白質(zhì)分子的作用時(shí)間較短，分子過孔速度較快，出現(xiàn)的易位事件也較多。

圖1 固態(tài)納米孔檢測(cè)蛋白質(zhì)BSA分子 a：裝置示意圖；b：I-V曲線；c：過孔信號(hào)圖

圖2 蛋白質(zhì)BSA不同電壓下易位信號(hào)統(tǒng)計(jì)分析a：電流變化幅值-易位時(shí)間散點(diǎn)圖；b：易位事件-標(biāo)準(zhǔn)事件數(shù)柱狀圖；c：阻塞電流-標(biāo)準(zhǔn)事件數(shù)柱狀圖

2.2 蛋白質(zhì)BSA與尿素相互作用的熒光光譜分析

激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，BSA在自然折疊態(tài)時(shí)內(nèi)源熒光發(fā)射峰的最大發(fā)射波長(zhǎng)位于346 nm附近，說明色氨酸殘基部分被隱藏；隨著尿素濃度的升高，BSA的相對(duì)熒光強(qiáng)度逐漸下降，出現(xiàn)熒光猝滅現(xiàn)象，說明BSA及尿素發(fā)生作用，導(dǎo)致BSA變性，但在0～5 M時(shí)，蛋白質(zhì)出現(xiàn)部分變性，6 M后，峰值出現(xiàn)顯著紅移，BSA完全變性，見圖3。

圖3 不同濃度尿素與蛋白質(zhì)BSA相互作用的熒光光譜圖

2.3 經(jīng)尿素變性后蛋白質(zhì)BSA的固態(tài)納米孔檢測(cè)結(jié)果分析

蛋白質(zhì)BSA和經(jīng)尿素變性后的BSA易位原始信號(hào)圖（圖4）：BSA加入后，電流基線較波動(dòng)，后出現(xiàn)易位信號(hào)，蛋白質(zhì)易位時(shí)間的長(zhǎng)短，與BSA與孔的作用及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)；加入經(jīng)尿素變性的BSA后，電流基線總體穩(wěn)定但變細(xì)，易位信號(hào)峰頂端較尖。

圖4 固態(tài)納米孔檢測(cè)經(jīng)尿素變性后的BSA及BSA原始信號(hào)及單個(gè)易位信號(hào)

3 討論

每個(gè)新制備成的氮化硅納米芯片均需經(jīng)過電學(xué)特性的表征及觀察電子顯微鏡，因在預(yù)處理及制備芯片的過程中，薄膜極易出現(xiàn)破裂，在實(shí)驗(yàn)過程前如無法較佳的檢測(cè)到芯片薄膜的完整性而直接應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)，可引發(fā)安裝芯片后發(fā)生電流過載[3]；蛋白質(zhì)與各種形式的生命及生命活動(dòng)密切相關(guān)，它是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)[4]；機(jī)體的每個(gè)細(xì)胞全部重要組成部位均有蛋白質(zhì)的參與；蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，有一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、四級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)由一級(jí)結(jié)構(gòu)向更高級(jí)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變方式主要是蛋白質(zhì)折疊，如蛋白質(zhì)出現(xiàn)折疊錯(cuò)誤會(huì)嚴(yán)重影響機(jī)體的功能[5]，因此，檢測(cè)蛋白質(zhì)及分析其結(jié)構(gòu)十分重要。目前，檢測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方式有多種，如X射線晶體學(xué)，痛感檢測(cè)蛋白質(zhì)分子在晶體中電子密度的空間分布評(píng)估蛋白質(zhì)中所有原子的三維坐標(biāo)[6]；對(duì)于已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)還可通過圓二色譜及核磁共振等方式，但操作方法較為復(fù)雜，檢測(cè)成本較高；納米孔計(jì)數(shù)為新型單分子檢測(cè)熱點(diǎn)，可應(yīng)用于高靈敏度的蛋白質(zhì)檢測(cè)[7]。

本研究探析納米孔技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)的研究新突破，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)選擇孔徑為78 nm的固態(tài)納米孔檢測(cè)蛋白質(zhì)BSA，將溶于1M KCl溶液內(nèi)的樣品，加入至流體內(nèi)，偏置電壓變換獲得BSA分子過孔信號(hào)圖；選擇76 nm的納米孔在980 mV、900 mV、400 mV電壓下檢測(cè)12 nm的蛋白質(zhì)BSA分析易位結(jié)果，易位事件的原始信號(hào)如圖2； 400 mV電壓下納米孔與蛋白質(zhì)的相互作用較強(qiáng)，易位事件相對(duì)較為分散，而980 mV及900 mV電壓下，納米孔與蛋白質(zhì)分子的作用時(shí)間較短，分子過孔速度較快，出現(xiàn)的易位事件也較多；激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，BSA在自然折疊態(tài)時(shí)內(nèi)源熒光發(fā)射峰的最大發(fā)射波長(zhǎng)位于346 nm附近，說明色氨酸殘基部分被隱藏；隨著尿素濃度的升高，BSA的相對(duì)熒光強(qiáng)度逐漸下降，出現(xiàn)熒光猝滅現(xiàn)象，說明BSA及尿素發(fā)生作用，導(dǎo)致BSA變性，但在0～5 M時(shí)，蛋白質(zhì)出現(xiàn)部分變性，6 M后，峰值出現(xiàn)顯著紅移，BSA完全變性；蛋白質(zhì)BSA和經(jīng)尿素變性后的BSA易位原始信號(hào)圖：BSA加入后，電流基線較波動(dòng)，后出現(xiàn)易位信號(hào)，蛋白質(zhì)易位時(shí)間的長(zhǎng)短，與BSA與孔的作用及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)；加入經(jīng)尿素變性的BSA后，電流基線總體穩(wěn)定但變細(xì)，易位信號(hào)峰頂端較尖，與范勇等[8]的研究結(jié)果大體一致，納米孔測(cè)序?yàn)榻陙盹w速發(fā)展的測(cè)序技術(shù)之一，納米孔是在薄膜上組裝或制備的納米級(jí)空隙，尺寸約在0.1～0.01納米量級(jí)之間，其基本檢測(cè)原理為含有納米孔的薄膜將一定pH值及一定濃度的電解質(zhì) （常為氯化鉀溶液）分為兩部分，電解質(zhì)溶液中溶解待檢測(cè)樣品，在兩個(gè)腔室間施加電場(chǎng)，電場(chǎng)經(jīng)由納米形成一定的開孔粒子電流，在電場(chǎng)的作用下，帶電顆粒由一端腔內(nèi)穿過納米孔，遷移至另一端腔室[9-10]；在穿孔時(shí)，因樣品顆粒會(huì)占據(jù)部分納米孔空間，原來可通過納米孔的部分離子無法通過，引發(fā)開孔離子電流急驟降低，出現(xiàn)了阻塞電流；即為檢測(cè)了樣品顆粒的易位事件；在理想的狀態(tài)下，因各種檢測(cè)樣品的結(jié)構(gòu)及尺寸具有一定的差異，在穿孔過程中對(duì)孔的阻塞程度也會(huì)有所不同，檢測(cè)到的阻塞電流大小也不同，可反映出樣品顆粒的表面性質(zhì)、形狀、大小等特征屬性；牛血清蛋白主要由一個(gè)自由半胱氨酸基團(tuán)、17個(gè)二硫鍵、607個(gè)氨基酸殘基組成，是較大的螺旋形結(jié)構(gòu)；其氨基酸較多可用于電離，同時(shí)水溶性又較高，可用于研究蛋白質(zhì)的變性機(jī)制；樣品加入電解質(zhì)溶液中后，基線電流開始出現(xiàn)一些尖峰，每個(gè)尖峰對(duì)應(yīng)一個(gè)蛋白質(zhì)BSA分子的易位事件；固態(tài)納米孔檢測(cè)1 M氯化鉀樣品溶液中3 uM BSA分子的直徑大小約為12 nm，熒光光譜分析蛋白質(zhì)BSA的完全變性時(shí)的尿素濃度，即6 M濃度尿素對(duì)蛋白質(zhì)變性可完全變性；而電壓較小時(shí)，納米孔孔壁與蛋白質(zhì)的相互作用時(shí)間較長(zhǎng)，出現(xiàn)的易位事件不多，阻塞電流也相對(duì)較??；隨著電壓的升高，蛋白質(zhì)與孔壁的作用時(shí)間越短，在高壓時(shí)也出現(xiàn)可相應(yīng)結(jié)構(gòu)改變，阻塞電流相應(yīng)增大，偏置電壓的大小對(duì)周圍區(qū)域及孔的電場(chǎng)產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響易位過程。綜上所述，氮化硅納米孔檢測(cè)蛋白質(zhì)應(yīng)用為后續(xù)的納米孔傳感器在蛋白質(zhì)研究中提供理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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