陳聲波　劉逸　智發(fā)朝　趙芯梅

·論著·

MAWBP在急性潰瘍性結(jié)腸炎模型中的作用

陳聲波劉逸智發(fā)朝趙芯梅

目的探討MAWBP在潰瘍性結(jié)腸炎急性模型中的作用。方法40只BALB/c小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，分別為正常對(duì)照組、Mock組、MAWBP組和MAWD組；Mock、MAWBP和MAWD組飲用4%DSS制作急性潰瘍性結(jié)腸炎模型，正常對(duì)照組飲用高壓過(guò)的飲用水。造模第1天，正常對(duì)照組、Mock組、MAWBP組和MAWD組分別注射慢病毒稀釋液、慢病毒空載體、含MAWBP基因慢病毒液、含MAWD基因慢病毒液。造模期間進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分；造模結(jié)束檢測(cè)各組小鼠腸道MAWBP蛋白和mRNA表達(dá)水平，病理切片評(píng)估腸道炎癥程度。結(jié)果與正常小鼠相比，急性潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠MAWBP蛋白表達(dá)水平明顯降低；與Mock組相比，MAWBP組MAWBP蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯升高；MAWBP組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分和低于Mock組；病理切片顯示MAWBP組腸道炎癥水平低于Mock組。結(jié)論MAWBP對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎急性模型具有保護(hù)作用，可通過(guò)上調(diào)MAWBP表達(dá)改善潰瘍性結(jié)腸炎病情。

MAWBP；潰瘍性結(jié)腸炎；動(dòng)物模型

【Abstract】Object To study the effect of MAWBP on acute colitis model in mice.Methods Forty BALB/c mice were assigned randomly into four groups（Normal Control，Mock，MAWBP and MAWD group）with 10 mice per group.Mock，MAWBP and MAWD group drank 4%DSS solution while Normal Control group received autoclaved drinking water.On the first day of the model，Normal Control，Mock，MAWBP and MAWD group received lentivirus diluents，lentivirus vector，lentivirus with MAWBP gene and lentivirus with MAWD gene respectively.Meanwhile，Disease Activity Index was evaluated.At the end of the model，the protein and mRNA expression of MAWBP were detected and histological colitis severity were determined in colonic tissue.Results Mice with acute colitis had a lower protein expression of MAWBP than healthy mice. Mice in MAWBP group had a higher protein and mRNA expression of MAWBP than mice in Mock group. Mice in MAWBP group had a lower score of Disease Activity Index than mice in Mock group.Mice in MAWBP group developed a less severe inflammation than mice in Mock group.Conclusion MAWBP has a protective effect on acute colitis model in mice and up-regulation of MAWBP alleviates ulcerative colitis.

【Key word】MAWBP；Ulcerative colitis；Animal model

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一類(lèi)原因不明，以腸道慢性非特異性炎癥為特征的腸道疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn′s disease，CD）兩個(gè)類(lèi)型。病因不明，多與環(huán)境、遺傳、感染、免疫等因素有關(guān)。UC被認(rèn)為是一類(lèi)具有高度癌變風(fēng)險(xiǎn)的非可控性炎癥［1］，病程長(zhǎng)，病變程度輕重不一，臨床上常表現(xiàn)反復(fù)發(fā)作而治愈難度大。因此，尋找更加有效的治療靶點(diǎn)有利于改變現(xiàn)有的治療困境。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常人，MAWBP在UC患者腸黏膜中低表達(dá)，且與病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)［2］。因此，我們推想，能否通過(guò)上調(diào)腸道組織MAWBP表達(dá)水平以緩解UC病情。

材料和方法

一、對(duì)象和試劑

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的4～6周齡BALB/c雄性小鼠，體重17～21g，飼養(yǎng)在SPF環(huán)境內(nèi)［許可證號(hào)：SYXK（粵）2011-0074］。

2.試劑和材料

葡聚糖硫酸鈉（dextra sulfate sodium，DSS，MW．40000）購(gòu)自MP Bio。慢病毒稀釋液（細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM）購(gòu)自SIGMA-ALDRICH。Western blot所需一抗：GAPDH（美國(guó)Abcam）、Actin（美國(guó)SIGMA）、MAWBP（美國(guó)CST）和MAWD（美國(guó)CST）。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自北京中杉金橋。慢病毒表達(dá)載體委托賽業(yè)生物科技有限公司設(shè)計(jì)構(gòu)建。表達(dá)載體1：pLV［Exp］-Puro-CMV＞hPbld1［ORF032447］：IRES：EGFP；表達(dá)載體2：V［Exp］-Puro-CMV＞hStrap ［NM_011499.3］：IRES：EGFP；對(duì)照組載體：pLV［Exp］-Puro-CMV＞EGFP。RT-qPCR所需引物委托英濰捷基公司合成，相關(guān)引物如表1所示。

表1　引物序列表

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.急性潰瘍性結(jié)腸炎模型制作

將40只BALB/c小鼠飼養(yǎng)在SPF環(huán)境，隨機(jī)分為4組，分別為Normal Control、Mock、MAWBP 和MAWD組，每組10只。除Normal Control組外，其他三組均通過(guò)自由飲用4%DSS溶液7天制作潰瘍性結(jié)腸炎急性模型［3］。造模期間，于第3、5天換入新的DSS溶液。DSS濃度可根據(jù)小鼠狀態(tài)在3%～5%調(diào)整。

2.慢病毒轉(zhuǎn)染

于造模第1天分別向Normal Control、Mock、MAWBP和MAWD組腹腔注射等體積（100 μL）慢病毒稀釋液、病毒空載體溶液、含MAWBP基因慢病毒溶液和含MAWD基因慢病毒溶液。造模結(jié)束（第8天）處死小鼠，取結(jié)直腸組織分析MAWBP和MAWD蛋白和mRNA表達(dá)情況以驗(yàn)證慢病毒在小鼠腸道組織轉(zhuǎn)染情況。

3.腸道臨床嚴(yán)重程度評(píng)估

造模期間，進(jìn)行各組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分（Disease Activity Index，DAI）［4-5］，測(cè)量小鼠體重，檢查肛周，記錄排便情況，根據(jù)DAI量表（表2）計(jì)算評(píng)分。

表2　DAI評(píng)分表

4.組織病理切片

潰瘍性結(jié)腸炎急性模型結(jié)束處死小鼠，取結(jié)直腸組織，進(jìn)行組織病理切片和HE染色，顯微鏡下評(píng)估各組腸道炎癥情況。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用IBM SPSS Statistics 19.0對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，運(yùn)用ANOVA方差分析法比較各組RT-PCR結(jié)果以及DAI之間的差異，組間兩兩比較運(yùn)用LSD方法，P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、急性潰瘍性結(jié)腸炎模型構(gòu)建成功

正常對(duì)照組小鼠肛周毛發(fā)整潔，無(wú)稀便、血便粘附，肛門(mén)黏膜呈粉紅色，無(wú)充血、破潰。急性潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠飲用DSS溶液后1周內(nèi)全部出現(xiàn)不同程度的進(jìn)食及進(jìn)飲減少、體重下降，腹瀉、血便，肛周毛發(fā)凌亂，肛口稀血便粘附（圖1A），提示DSS誘導(dǎo)了小鼠腸道發(fā)生急性損傷。造模結(jié)束后，小鼠結(jié)直腸組織HE染色顯示：正常對(duì)照組黏膜基本正常，層次結(jié)構(gòu)清晰，腺體排列有序；DSS組黏膜受損，腺體減少、排列紊亂，淋巴細(xì)胞增多（圖1B）。說(shuō)明DSS組腸道產(chǎn)生了炎癥，提示DSS相關(guān)急性潰瘍性結(jié)腸炎模型構(gòu)建成功。

二、MAWBP在急性潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠中低表達(dá)

急性潰瘍性結(jié)腸炎模型結(jié)束后，處死小鼠，取結(jié)直腸組織進(jìn)行Western blot分析，發(fā)現(xiàn)MAWBP表達(dá)在DSS組顯著較正常對(duì)照組低（圖1C），提示MAWBP與腸炎活動(dòng)程度呈負(fù)相關(guān)，結(jié)合我們之前研究［2］，MAWBP在潰瘍性結(jié)腸炎中可能發(fā)揮保護(hù)作用。

三、上調(diào)MAWBP表達(dá)可降低急性潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠的疾病嚴(yán)重程度

造模期間，腹腔注射含目標(biāo)基因的慢病毒顆粒使MAWBP在腸道組織過(guò)表達(dá)，造模結(jié)束取結(jié)直腸組織，Western blot檢測(cè)MAWBP蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)MAWBP組明顯較正常對(duì)照組、Mock組高（圖2A）；RT-qPCR檢測(cè)MAWBP在腸道組織mRNA水平，發(fā)現(xiàn)MAWBP組明顯高于提示Mock組（圖2B）；這些都提示MAWBP成功轉(zhuǎn)染到小鼠腸道組織，并使MAWBP表達(dá)上調(diào)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)各組小鼠進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分，發(fā)現(xiàn)MAWBP組評(píng)分低于Mock組（圖2C），提示上調(diào)MAWBP表達(dá)有緩解腸炎作用。為了進(jìn)一步證實(shí)MAWBP緩解腸道炎癥水平作用，造模結(jié)束后，我們?nèi)≈苯Y(jié)腸組織進(jìn)行組織切片、HE染色，鏡下評(píng)估各組腸道炎癥程度。鏡下可見(jiàn)（圖3）：①正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜基本完整，腺體排列整齊、結(jié)構(gòu)層次清晰，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；②Mock組和MAWD組小鼠結(jié)腸黏膜破損嚴(yán)重，腺體減少、排列紊亂，以淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞的大量浸潤(rùn)，淋巴濾泡增生；③MAWBP組小鼠結(jié)腸炎癥相對(duì)較輕，黏膜基本完整，腺體結(jié)構(gòu)清晰，炎細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)較少；以上結(jié)果提示MAWBP在腸道炎癥中起保護(hù)作用，一定程度上緩解了炎癥的進(jìn)展，而MAWD并沒(méi)有此作用。

A：DSS制作急性潰瘍性結(jié)腸炎模型期間小鼠肛周情況；

B：急性潰瘍性結(jié)腸炎模型腸道組織HE切片染色（放大倍率：左上圖100×，右上圖100×，左下圖400×，右下圖200×）；

C：MAWBP蛋白在急性潰瘍性結(jié)腸炎模型腸道組織表達(dá)情況。

圖1　MAWBP蛋白在潰瘍性結(jié)腸炎急性模型腸道組織低表達(dá)（NC：正常對(duì)照組，DSS：急性潰瘍性結(jié)腸炎模型組）

（A）經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染，MAWBP蛋白在腸道組織表達(dá)上調(diào)。（B）經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染，MAWBP蛋白和mRNA在腸道組織表達(dá)上調(diào)。EGFP/NC：空載組mRNA與正常對(duì)照相比的倍數(shù)變化；MAWBP/NC：轉(zhuǎn)染了含有MAWBP基因慢病毒的小鼠與正常對(duì)照相比體內(nèi)目的蛋白mRNA的倍數(shù)變化（MAWBP/NC vs EGFP/NC，n=3，F(xiàn)=1701.256，P＜0.001）。（C）急性潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分（MAWBP組vsMock組，n=3，*P＜0.05）。

圖2　上調(diào)MAWBP表達(dá)可減輕急性潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠腸道組織炎癥。

討論

MAWBP（MAWD binding protein）是MAWD （mitogen-activated protein kinase activator with WD repeats）結(jié)合蛋白，是以MAWD為誘餌蛋白通過(guò)雙雜交技術(shù)從人肝臟cDNA文庫(kù)分離的蛋白，在人腦、肺臟、心臟、肝臟、胰臟和腎臟等組織器官中均有表達(dá)［6］，提示MAWBP參與細(xì)胞基本功能［7］。由于涉及MAWBP的研究少，MAWBP的生物學(xué)功能尚不明確。為了探討MAWBP在潰瘍性結(jié)腸炎中的作用，我們制作DSS相關(guān)的急性潰瘍性結(jié)腸炎模型，發(fā)現(xiàn)MAWBP在小鼠模型腸道表達(dá)下調(diào)，這與我們前期在UC患者的研究相吻合［2］。另外，我們通過(guò)慢病毒載體轉(zhuǎn)染MAWBP基因到小鼠腸道組織，使MAWBP在小鼠腸道組織過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染病毒空載體小鼠相比，過(guò)表達(dá)MAWBP的小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分和病理組織炎癥程度均明顯降低，說(shuō)明上調(diào)MAWBP表達(dá)可以改善急性潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠的病情，MAWBP對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎具有一定的治療作用。鑒于DSS相關(guān)急性潰瘍性結(jié)腸炎模型主要是通過(guò)直接損傷腸道基底隱窩上皮模擬人類(lèi)潰瘍性結(jié)腸炎［3］，因此我們推測(cè)，MAWBP可能是通過(guò)加速腸道上皮細(xì)胞增殖修復(fù)，抑制炎癥因子釋放而緩解病情進(jìn)展。

相關(guān)研究表明，MAWBP在肝癌組織中低表達(dá)，且與患者病情預(yù)后相關(guān)，低表達(dá)提示肝癌組織低分化和高度惡性［8］。MAWBP在胃癌組織中也呈低表達(dá)［9］，低表達(dá)也提示胃癌細(xì)胞低分化［10］。我們的研究證實(shí)MAWBP在急性潰瘍性結(jié)腸炎模型和UC患者腸道低表達(dá)，且表達(dá)水平與病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)［2］，提示MAWBP可作為潰瘍性結(jié)腸炎病情活動(dòng)的預(yù)測(cè)指標(biāo)，表達(dá)水平越低提示病情越重。此外，上調(diào)MAWBP表達(dá)除了緩解潰瘍性結(jié)腸炎外，還具有抑制腫瘤生長(zhǎng)作用。肝癌中，上調(diào)MAWBP表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和侵襲能力［8］；胃癌中，上調(diào)MAWBP表達(dá)可促進(jìn)胃癌分化，抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、成瘤能力［10-11］；這些均提示MAWBP可能具有抗炎抗腫瘤發(fā)生的作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)上調(diào)MAWBP表達(dá)緩解了急性潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠病情，可通過(guò)調(diào)控MAWBP表達(dá)水平治療潰瘍性結(jié)腸炎。

放大倍率：

左上圖40×和200×；

右上圖40×和200×；

左下圖100×和400×；

右下圖40×和200×。

NC：正常對(duì)照組；

Mock：空載慢病毒；

MAWBP：轉(zhuǎn)染含MAWBP基因的慢病毒；

MAWD：轉(zhuǎn)染含MAWD基因的慢病毒。

圖3　上調(diào)MAWBP表達(dá)可減輕急性潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠腸道組織炎癥，經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染，各組腸道組織HE切片染色

［1］Ordás I，Eckmann L，Talamini M，et al.Ulcerative colitis［J］. Lancet，2012，380（9853）：1606-1619.

［2］Zhao X，Kang B，Lu C，et al.Evaluation of p38 MAPK pathway as a molecular signature in ulcerative colitis［J］.J Proteome Res，2011，10（5）：2216-2225.

［3］Wirtz S，Neufert C，Weigmann B，et al.Chemically induced mouse models of intestinal inflammation［J］.Nat Protoc，2007，2（3）：541-546.

［4］Okayasu I，Hatakeyama S，Yamada M，et al.A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice［J］.Gastroenterology，1990，98（3）：694-702.

［5］Cooper HS，Murthy SN，Shah RS，et al.Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis［J］.Lab Invest，1993，69（2）：238-249.

［6］Iriyama C，Matsuda S，Katsumata R，et al.Cloning and sequencing of a novel human gene which encodes a putative hydroxylase［J］.J Hum Genet，2001，46（5）：289-292.

［7］Herde P，Blankenfeldt W.The purification，crystallization and preliminary structural characterization of human MAWDBP，a member of the phenazine biosynthesis-like protein family［J］.Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun，2006，62（Pt 6）：546-549.

［8］Li A，Yan Q，Zhao X，et al.Decreased expression of PBLD correlates with poor prognosis and functions as a tumor suppressor in human hepatocellular carcinoma［J］.Oncotarget，2016，7（1）：524-537.

［9］Zhang J，Kang B，Tan X，et al.Comparative analysis of the protein profiles from primary gastric tumors and their adjacent regions：MAWBP could be a new protein candidate involved in gastric cancer［J］.J Proteome Res，2007，6（11）：4423-4432.

［10］Li D，Zhang J，Xi Y，et al.Mitogen-activated protein kinase activator with WD40 repeats（MAWD）and MAWD-binding protein induce cell differentiation in gastric cancer［J］.BMC Cancer，2015，15：637.

［11］Li DM，Zhang J，Li WM，et al.MAWBP and MAWD inhibit proliferation and invasion in gastric cancer［J］.World J Gastroenterol，2013，19（18）：2781-2792.

（本文編輯：李?lèi)?ài)民）

The effect of MAWBP on acute colitis model in mice

CHEN Sheng-bo，LIU Yi，ZHI Fa-chao，ZHAO Xin- mei.Department of Gastroenterology，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangdong Provincial Key Laboratory of Gastroenterology，Guangzhou 510515，China

10.3969/j.issn.1672-2159.2016.03.001

510515廣東省胃腸疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化內(nèi)科

趙芯梅，E-mail：xmzhao914@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金（81402037）（81170341）

2016-05-15）