郭振環(huán)，馬　霞，王文秀，王　恬，沈志強*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院博士后科研工作站，山東濱州 256600；2.南京農(nóng)業(yè)大學博士后科研流動站，江蘇南京 210095；3.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；4.河南省康星藥業(yè)股份有限公司，河南鄭州 451464)

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蜂膠黃酮對病毒誘導PK-15細胞凋亡的影響

郭振環(huán)1,2,3,4，馬霞1,3，王文秀3，王恬2，沈志強1,3*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院博士后科研工作站，山東濱州 256600；2.南京農(nóng)業(yè)大學博士后科研流動站，江蘇南京 210095；3.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；4.河南省康星藥業(yè)股份有限公司，河南鄭州 451464)

為研究蜂膠黃酮對病毒誘導宿主細胞凋亡的影響，將蜂膠黃酮從最大安全濃度250 μg/mL倍比稀釋5個濃度，與豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬細小病毒(PPV)分別一起加至單層PK-15細胞培養(yǎng)體系中，用流式細胞儀檢測蜂膠黃酮對TGEV和PPV感染PK-15細胞凋亡率的影響。結果顯示，與病毒對照組比較，TGEV和PPV感染PK-15細胞后，蜂膠黃酮可以顯著降低PPV感染引起的PK-15細胞凋亡率，而對TGEV感染引起的PK-15細胞凋亡率則沒有顯著影響。說明蜂膠黃酮可以減輕無囊膜的PPV感染對PK-15細胞引起的凋亡。

蜂膠黃酮；豬傳染性胃腸炎病毒；豬細小病毒；細胞凋亡

豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和豬細小病毒(Porcine parvovirus,PPV)只能在來源于豬的細胞(如原代豬腎細胞、豬睪丸細胞及PK-15、CPK、IBRS-2、MVPK及ST等傳代細胞)和人的某些傳代細胞(如Hela、KB、Hep-2、Lu132等細胞)中培養(yǎng)增殖[1]。TGEV和PPV感染PK-15細胞可以引起細胞的凋亡和釋放多種抗感染因子[2-3]。本試驗在前期發(fā)現(xiàn)蜂膠黃酮具有抵抗TGEV和PPV感染PK-15細胞的作用及減少PK-15細胞的死亡數(shù)量的基礎上[4]，觀察蜂膠黃酮對TGEV和PPV感染PK-15細胞引起細胞凋亡的影響，為蜂膠活性物質(zhì)抗病毒作用研究基礎資料。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒毒株、細胞和藥物疫苗株病原TGEV、PPV和PK-15細胞均由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院提供。蜂膠黃酮，由山東綠都生物科技有限公司制備，蘆丁法測定黃酮含量為85%。

1.1.2主要試劑和儀器胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑藍(MTT)染料、碘化丙啶(PI)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，Gibco公司產(chǎn)品；新生牛血清，杭州四季青生物有限公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱(371型)，Thermo公司產(chǎn)品；細胞培養(yǎng)瓶和96孔細胞培養(yǎng)板，德國Nunclon公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡由重慶光學儀器廠生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1蜂膠黃酮對PK-15細胞安全濃度的測定將蜂膠黃酮用細胞維持液從2 000 μg/m連續(xù)的2倍比稀釋10個濃度后，加到長成單層PK-15的96孔細胞培養(yǎng)板上，100 μL/孔，每個稀釋度重復6孔，另設細胞對照，置37 ℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后MTT法檢測，以加蜂膠黃酮孔OD值不顯著低于細胞對照孔OD值的最高濃度作為最大安全濃度。

將安全濃度下倍比稀釋5個濃度的蜂膠黃酮和TGEV或PPV加到長成單層PK-15細胞，每濃度重復18孔，同時設病毒對照組和細胞對照孔。于加入后的12、24、36、48、60、72 h隨機取3孔，用不含EDTA的胰蛋白酶消化PK-15細胞，PBS洗滌3次后，吸棄上清，細胞懸浮與500 μL Binging buffer中，加入5 μL PI和5 μL Annexin V-FITC，避光室溫反應10 min，用流式細胞儀進行檢測[5]。

2　結果

2.1蜂膠黃酮PK-15細胞的安全濃度

蜂膠黃酮在500 μg/mL～2 000 μg/mL的OD 570 nm值顯著小于細胞對照組(P<0.05)，表明該濃度下的蜂膠黃酮對CEF細胞具有一定的毒性。15.6 μg/mL～250 μg/mL的OD 570 nm值顯著高于細胞對照組(P<0.05)，3.9 μg/mL～7.8 μg/mL的OD 570 nm值與細胞對照組差異不顯著(P>0.05)。故將蜂膠黃酮對PK-15的最大安全濃度定為250 μg/mL(表1)。

表1　蜂膠黃酮對CEF細胞的毒性

注：同列數(shù)據(jù)標注不含相同字母者差異顯著(P<0.05)。

Note:Column data marked without the same letters differ significantly (P<0.05).

2.2蜂膠黃酮對TGEV感染后PK-15細胞凋亡的檢測結果

如圖1～圖3所示，TGEV感染PK-15細胞后12、24、36、48、60、72 h的細胞凋亡率，在所選蜂膠黃酮劑量范圍內(nèi)，各蜂膠黃酮組PK-15細胞凋亡率與病毒對照組均差異不顯著(P>0.05)。

A.感染TGEV后12 h；B.感染TGEV后24 h

A.12 hours after TGEV infection;B.24 hours after TGEV infection

同組柱形圖標注不含相同字母者差異顯著(P<0.05)

Bars without the same letters differ significantly (P<0.05)

圖1蜂膠黃酮對TGEV感染PK-15細胞12 h和24 h凋亡率的影響

Fig.1The effect of PF on PK-15 apoptotic rate 12 and 24 hours after TGEV infection

A.感染TGEV后36 h；B.感染TGEV后48 h

A.36 hours after TGEV infection;B.48 hours after TGEV infection

同組柱形圖標注不含相同字母者差異顯著(P<0.05)

Bars without the same letters differ significantly (P<0.05)

圖2蜂膠黃酮對TGEV感染PK-15細胞36 h和48 h凋亡率的影響

Fig.2The effect of PF on PK-15 apoptotic rate 36 and 48 hours after TGEV infection

A.感染TGEV后60 h；B.感染TGEV后72 h

A.60 hours after TGEV infection;B.72 hours after TGEV infection

同組柱形圖標注不含相同字母者差異顯著(P<0.05)

Bars without the same letters differ significantly (P<0.05)

圖3蜂膠黃酮對TGEV感染PK-15細胞60 h和72 h凋亡率的影響

Fig.3The effect of PF on PK-15 apoptotic rate 60 and 72 hours after TGEV infection

2.3蜂膠黃酮對PPV感染后PK-15細胞凋亡的檢測結果

如圖4～圖6所示，PPV感染PK-15細胞后12、24、36、48、60、72 h的細胞凋亡率。感染12 h和24 h后，125 μg/mL和250 μg/mL濃度的蜂膠黃酮組PK-15細胞凋亡率均顯著低于其他各組(P<0.05)；感染36 h后，31.2、62.5、125、250 μg/mL濃度的蜂膠黃酮組PK-15細胞凋亡率均顯著低于病毒對照組(P<0.05)；感染48、60、72 h后，各蜂膠黃酮組PK-15細胞凋亡率顯著低于病毒對照組(P<0.05)。

A.感染TGEV后12 h；B.感染TGEV后24 h

A.12 hours after TGEV infection;B.24 hours after TGEV infection

同組柱形圖標注不含相同字母者差異顯著(P<0.05)

Bars without the same letters differ significantly (P<0.05)

圖4蜂膠黃酮對PPV感染PK-15細胞12 h和24 h凋亡率的影響

Fig.4The effect of PF on PK-15 apoptotic rate 12 and 24 hours after PPV infection

A.感染TGEV后36 h；B.感染TGEV后48 h

A.36 hours after TGEV infection;B.48 hours after TGEV infection

同組柱形圖標注不含相同字母者差異顯著(P<0.05)

Bars without the same letters differ significantly (P<0.05)

圖5蜂膠黃酮對PPV感染PK-15細胞36 h和48 h凋亡率的影響

Fig.5The effect of PF on PK-15 apoptotic rate 36 and 48 hours after PPV infection

A.感染TGEV后60 h；B.感染TGEV后72 h

A.60 hours after TGEV infection;B.72 hours after TGEV infection

同組柱形圖標注不含相同字母者差異顯著(P<0.05)

Bars without the same letters differ significantly (P<0.05)

圖6蜂膠黃酮對PPV感染PK-15細胞60 h和72 h凋亡率的影響

Fig.6The effect of PF on PK-15 apoptotic rate 60 and 72 hours after PPV infection

3　討論

黃酮類化合物廣泛存在于自然界，是一類具有多種藥理活性的天然多酚類化合物，其具有廣泛的抑制病毒活性。張玉清等[6]曾報道5種中藥黃酮成分體外均有不同程度的抗病毒作用。黃酮類化合物作為蜂膠的主要有效成分之一，具有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、抵氧化、降血糖等作用[7]。Kai H等[8]和Nolkemper S等[9]證實蜂膠黃酮能影響流感病毒、單純皰疹病毒等均有不同程度的抑制作用。

病毒誘導細胞凋亡是普遍現(xiàn)象，且病毒感染機體誘發(fā)細胞凋亡在病毒致病性上具有雙重意義，因此，研究病毒誘導的細胞凋亡、宿主和病毒的凋亡及抗凋亡的規(guī)律，可為控制病毒感染和病毒病治療提供理論依據(jù)。陳藝娟等[10]試驗發(fā)現(xiàn)猴頭菇多糖能在呼腸孤病毒感染晚期抑制細胞凋亡，認為這可能是猴頭菇多糖對病毒感染產(chǎn)生積極影響，助于防止病毒在細胞中的擴散甚至利于病毒的清除。劉曉靜等[11]也從細胞凋亡的角度證明了黃芩、連翹的中草藥提取液具有抗流感病毒作用，為臨床使用中藥進行抗病毒治療提供了新的分子機制和試驗依據(jù)。

蘇建青等[12]認為中藥抗病毒感染細胞的作用途徑更多的可能是通過增強細胞的抵抗力而實現(xiàn)的。本試驗結果發(fā)現(xiàn)蜂膠黃酮對PPV感染細胞引起的凋亡具有明顯的減輕作用，且降低作用與蜂膠黃酮有一定的量效關系。Ma X等[13]前期研究蜂膠黃酮和Bankova V等[14]在研究黃酮類化合物抗病毒作用時，也發(fā)現(xiàn)藥物對病毒的抑制作用與藥物濃度在一定范圍內(nèi)成正相關。蜂膠黃酮對TGEV感染細胞引起的細胞凋亡沒有明顯的減輕作用，可能是TGEV進入細胞的速度快于藥物進入細胞的速度的原因，孫秋艷等[15]研究滸苔多糖抗TGEV時也持相同觀點。

李厚偉等[2]研究豬細小病毒感染PK-15細胞的增殖規(guī)律時發(fā)現(xiàn)，干擾素及相關細胞因子、凋亡相關細胞因子、部分抗病毒基因表達相應的加強，對闡釋細胞因子的免疫作用機制及PPV的分子作用機制提供了依據(jù)，為預防和治療PPV相關藥物的篩選及研制奠定了理論基礎。戴美玲等[3]在研究豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)誘導ST細胞凋亡時發(fā)現(xiàn)，TGEV感染能夠誘導ST細胞凋亡，caspase-3、caspase-8及FasL介導的死亡受體通路和Bcl-2家族調(diào)控的線粒體凋亡通路，在調(diào)控TGEV感染誘導的細胞凋亡過程中可能起著非常重要的作用。本試驗結果發(fā)現(xiàn)，蜂膠黃酮可以減輕PPV感染PK-15細胞后誘導的細胞凋亡，而對TGEV感染引起的PK-15細胞凋亡則沒有明顯的減輕作用，更深層次的機理如蜂膠黃酮通過調(diào)控PPV感染的PK-15細胞的哪種信號傳導通路及在基因水平還是蛋白水平及病毒本身結構(有無囊膜)影響藥物作用等則需要進一步的研究。

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Effect of Propolis Flavone on Apoptosis of PK-15 Cells Induced by Viruses

GUO Zhen-huan1,2,3,4,MA Xia1,3,WANG Wen-xiu3,WANG Tian2,SHEN Zhi-qiang1,3

(1.Postdoctoral Programme,Binzhou Animal Science and Veterinary Medicine Academy,Binzhou, Shandong, 256600,China;2.PostdoctoralProgramme,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing,Jiangsu, 210095,China;3.BinzhouAnimalScienceandVeterinaryMedicineAcademy,Binzhou,Shandong, 256600,China;4.HenanProvinceHealthStarPharmaceuticalCo.,Ltd,Zhengzhou,Henan, 451646,China)

In order to investigate the effect of propolis flavone (PF) on apoptosis of host cells induced by virus.PF was diluted to five concentrations with MM in of its safe concentration and added into PK-15 monolayers with transmissible gastroenteritis virus(TGEV) and porcine parvovirus(PPV).Then the effects of PF on apoptosis rate of host cells induced by TGEV and PPV were detected by flow cytometry.The results showed that PF could reduced the apoptosis rate of PK-15 cells induced by PPV remarkably compared with virus control.But the apoptosis rate of PK-15 cells induced by TGEV had no obvious significance.In conclusion,PF was able to alleviate the apoptosis rate of PK-15 cells induced by PPV,which had no envelope.

propolis flavone; Transmissible gastroenteritis virus; Porcine parvovirus; apoptosis

2016-01-04

山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院博士后科研啟動基金項目(bzxmsybsh201502)

郭振環(huán)(1977-)，男，山東淄博人，助理研究員，博士，主要從事中藥藥理學研究。*通訊作者

S852.3；S853.76

A

1007-5038(2016)08-0041-04