于冬玲，譚春萍,張艷雯

(南寧學(xué)院，廣西南寧 530200)

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廣西2013年-2015年雞傳染性支氣管炎病毒S1基因分子流行病學(xué)分析

于冬玲，譚春萍,張艷雯

(南寧學(xué)院，廣西南寧 530200)

為了解近年來廣西地區(qū)雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)的分子流行病學(xué)特點和遺傳變異規(guī)律，本研究對廣西地區(qū)2013年-2015年分離的26株IBV的S1基因進(jìn)行了克隆、序列測定和分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，26株IBV S1基因核苷酸序列長度在1 599 bp～1 632 bp之間，編碼533個～544個氨基酸，說明分離毒株核苷酸存在較多的插入和缺失；分離毒株之間核苷酸序列同源性在76.5%～100%之間，其推導(dǎo)氨基酸序列同源性在74.4%～100%之間，分離株與參考株核苷酸及推導(dǎo)氨基酸的同源性分別介于75.9%～97.3%和74.9%～96.3%之間；分離毒株可以分為4個主要分支，南寧地區(qū)2013年-2014年分離毒株主要在第2分支，而在2015年分離毒株主要分布在第1.1分支，這是一個新的流行趨勢，桂林地區(qū)的分離毒株主要分布在1.3、4.2分支，2015年以來的3個分離毒株分別存在于3和4.2分支，沒有形成比較明顯的優(yōu)勢流行毒株，玉林地區(qū)的毒株分布較散，也沒有形成明顯的優(yōu)勢流行毒株；分離毒株中大部分毒株與疫苗毒株同源性較低，部分毒株向著各自的方向進(jìn)化，呈現(xiàn)出一定的地域性。

雞傳染性支氣管炎病毒；S1基因；遺傳進(jìn)化

雞傳染性支氣管炎(Avian infectious bronchitis,IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)引起的危害養(yǎng)雞業(yè)的重要傳染病，主要侵害雞的呼吸系統(tǒng)和泌尿生殖系統(tǒng)，從而引起死淘率上升、產(chǎn)蛋下降、繼發(fā)感染等。近年來，IB的防控雖取得了一定的成效，但是部分地區(qū)仍有發(fā)生，特別是腎型IB尤為嚴(yán)重，給我國養(yǎng)雞業(yè)造成了重大損失[1-4]。本研究對從廣西地區(qū)檢測的26份IBV進(jìn)行了S1基因的克隆、測序及分子流行病學(xué)分析，及時了解IBV變異情況，為IB的流行病學(xué)研究、疫苗篩選和綜合防控奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株本研究所選取得毒株均分離自廣西南寧、桂林、玉林等地區(qū)的散養(yǎng)雞場，具體信息如表1所示。選用某商品H120疫苗作為陽性對照，選用健康雞樣品作為陰性對照。

1.1.2主要試劑DH5α感受態(tài)細(xì)胞,天根生化科技有限公司產(chǎn)品;AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒、DNA片段快速純化/回收試劑盒,愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司產(chǎn)品;一步法RT-PCR試劑盒(PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2)、ExTaqDNA聚合酶(5 U/μL)、DNA Marker DL 2 000、pMD18-T Simple載體,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計與合成應(yīng)用Primer 5.0 和DNA Star Lasergene 7.1基因分析軟件分析了GenBank中注冊的IBV S1基因序列，設(shè)計擴(kuò)增S1全長片段的引物：

P1 (Forward primer)：5′-AAGACTGAACAAAAGACCGACT-3′(22 bp)；

P2 (Reverse primer )：5′-CAAAACCTGCCATAACTAACATA-3′(23 bp)；

引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。P1/P2引物對擴(kuò)增的片段長度為1600 bp左右[5]。

1.2.2S1基因的克隆測序IBV RNA的提取按照AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒說明書進(jìn)行。參照PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)采用25 μL體系，反應(yīng)條件為：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，53 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃ 終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物使用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用成像系統(tǒng)照相。S1基因純化使用愛思進(jìn)DNA片段快速純化/回收試劑盒進(jìn)行。純化后產(chǎn)物與pMD18-T Simple載體進(jìn)行連接反應(yīng)，按說明書進(jìn)行。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑選單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，鑒定克隆成功樣品，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

表1　IBV廣西分離株的來源及背景

1.2.3序列分析與進(jìn)化樹的構(gòu)建用DNA Star對分離株與GenBank中登錄的12株參考毒株S1基因核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行同源性比較分析。應(yīng)用ClustalX計算方法進(jìn)行序列比對，使用MEGA5.0的臨位相接法(Neighbor-Joining法)進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建，并用Bootstrap對進(jìn)化樹進(jìn)行統(tǒng)計驗證。參考毒株及其GenBank登錄號如下：M41(DQ834384)、Ark99(M99482)、4/91(AF093794)、H120(M21970)、Ma5(AY561713)、W93(AY427818)、A2(AY043312)、QXIBV (AF193423)、LX4 (AY189157)、PSH050513(DQ160004)、LDT3(AY702975)和28/86(AY846750)。

2　結(jié)果

2.1RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用RT-PCR擴(kuò)增IBV S1基因片段，結(jié)果分別擴(kuò)增出約1 600 bp的目的條帶，與預(yù)期的片段大小相符。如圖1所示為部分樣品S1基因RT-PCR擴(kuò)增片段產(chǎn)物的電泳結(jié)果。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陰性對照；2 .陽性對照；3～4.樣品

M.DNA Marker DL 2 000; 1 Negative control; 2 Positive control; 3-4.Samples

圖1IBV S1基因RT-PCR擴(kuò)增片段產(chǎn)物的電泳結(jié)果

Fig.1The electrophoresis results of RT-PCR products of IBV S1 gene

2.2測序結(jié)果

將測序所得序列提交GenBank，獲得分離株的注冊號，如表1所示。

2.3同源性分析

測序結(jié)果表明，26株IBV S1基因核苷酸序列長度在1 599 bp～1 632 bp之間，編碼533-544氨基酸，說明分離毒株存在較多的堿基插入和缺失。26個分離毒株與12個參考毒株S1基因序列通過MegAlign軟件Clustal W 方法進(jìn)行序列比較[5-6]。分析表明，各分離毒株之間核苷酸序列同源性在76.5%～100%之間，其推導(dǎo)氨基酸序列同源性在74.4%～100%之間。分離株與參考株核苷酸及推導(dǎo)氨基酸的同源性分別介于75.9%～97.3%和74.9%～96.3%之間?？梢姺蛛x毒株之間、分離毒株與參考毒株之間同源性差異較大，參差不齊，十分復(fù)雜。推測S1基因的多樣性差異是導(dǎo)致目前免疫失敗的一個重要因素。

2.4遺傳進(jìn)化分析

將26株IBV分離株與參考毒株的S1基因核苷酸序列用MEGA5.0分析軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)行遺傳分析，如圖2所示。結(jié)果表明，全部分離毒株可以分為4個大分支，每個分支里面又可以分為若干小的分支。第1分支包括13個分離毒株(56%)和3個參考毒株(LX4、QXIBV、A2)；第2分支包括4個分離毒株(15%)和1個參考毒株(PSH050513)1個疫苗毒株(LDT3)。第3分支包括2個參考毒株(W93、M41)3個疫苗毒株(28/86、H120、Ma5)；第4分支包括6個分離毒株(23%)，未見參考毒株，由于本研究選用的參考毒株有限，說明這個分支是一個新的進(jìn)化方向，與選用的經(jīng)典毒株均不同；第5分支包括3個分離毒株(12%)和1個參考毒株(Ark99)1個疫苗毒株(4/91)。結(jié)果說明，分離毒株與疫苗毒株均不在同一分支上，1、2分支毒株與我國經(jīng)典的分離毒株在同一分支，未見3分支分離毒株，5分支與國外Ark99在同一分支，說明國外毒株也存在于廣西地區(qū)，并產(chǎn)生了進(jìn)化，4分支與選用的參考毒株均不在一起，屬不同的分支，提示為一個新的進(jìn)化方向。

從分布規(guī)律來看，2015年以來南寧地區(qū)4個分離株均在1.1分支；2013年10月～2014年4月南寧6個分離株中有2個分離毒株在1.3分支、4個分離毒株在2分支；2013年4月～2015年5月桂林地區(qū)10個分離株中有5個分離毒株在1.2分支、4個分離毒株在第4分支、1個分離毒株在5分支。桂林地區(qū)的毒株分布較散，提示桂林地區(qū)的IBV感染更為復(fù)雜。2013年11月～2015年2月玉林地區(qū)6個分離株中有2個分離毒株在1分支、2個分離毒株在第4分支、2個分離毒株在5分支，分布也較分散。

綜合來看南寧地區(qū)2013年-2014年分離毒株多在第2分支，而在2015年分離毒株多分布在第1.1分支，這是一個新的流行趨勢。桂林地區(qū)的分離毒株多分布在1.3、4.2分支，2015年以來的3個分離毒株分別存在于3、4.2分支，沒有形成比較明顯的優(yōu)勢流行毒株。玉林地區(qū)的毒株分布較分散，也沒有形成明顯的優(yōu)勢流行毒株，這可能與其地理位置有關(guān)。

3　討論

廣西地區(qū)是我國重要的黃羽肉雞養(yǎng)殖區(qū)域，其中又以桂林、玉林、南寧3個地區(qū)存欄量最多。雞傳染性支氣管炎是危害養(yǎng)殖生產(chǎn)的重要疾病之一，給養(yǎng)殖場造成了重大損失[7-8]。檢測結(jié)果表明，養(yǎng)殖生產(chǎn)的各日齡段均有分離到IBV，其中10日齡～30日齡為高發(fā)階段，有16群，占21%，最早8日齡就有感染發(fā)病的。這可能是因為雛雞在這個生長階段，IBV母源抗體已經(jīng)逐步消退，但疫苗免疫后保護(hù)力尚未完全建起，IBV野毒感染率比較高，所以10 d～ 30 d發(fā)病較多。呼吸型IB多發(fā)生于20日齡以內(nèi)，有16群，占62%。另外從4群無發(fā)病癥狀的雞群也分離到了IBV，證明IB是存在潛伏感染或者耐過后持續(xù)排毒的。發(fā)生大腸埃希菌、沙門菌、支原體等感染的雞群也能夠檢出IBV，說明存在混合感染。IBV分離毒株中，大部分毒株與疫苗毒株同源性較低，部分毒株向著各自的方向進(jìn)化，呈現(xiàn)出一定的地域性。這與國內(nèi)其他學(xué)者的研究結(jié)果相近[9-10]。

圖2　S1基因進(jìn)化樹

IB的早期免疫主要是黏膜免疫，雛雞母源抗體雖高，但始終不能產(chǎn)生有效的保護(hù)。針對廣西地區(qū)IB的復(fù)雜情況，在免疫預(yù)防方面筆者認(rèn)為，提早接種免疫，使雛雞產(chǎn)生黏膜免疫力，是非常重要的，可以選擇1日齡噴霧(或者3天齡點眼)免疫多價弱毒疫苗。從測序結(jié)果來看，可以選用H120、4/91、LDT3等弱毒苗來免疫。也可以根據(jù)目前流行趨勢使用油苗免疫，所使用毒株最好在第1、2、4分支當(dāng)中選擇2個～3個毒株，制成多價苗，以期能夠取得較好的免疫效果。

IBV毒株變異較快，一方面是病毒本身不斷變化，另一方面是免疫壓力促使病毒免疫逃避，產(chǎn)生新的流行毒株，所以需要我們不斷的持續(xù)跟蹤IBV的變化，適時掌握其流行規(guī)律，制定合理的防疫計劃，對于養(yǎng)殖生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。

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Molecular Epidemiological Analysis of S1 Gene of Avian Infectious Bronchitis Virus Isolated in Guangxi Province during 2013-2015

YU Dong-ling,TAN Chun-ping,ZHANG Yan-wen

(Nanning University,Nanning,Guangxi,530200,China)

In order to find out the characteristics of molecular epidemiology and molecular genetic variation of avian infectious bronchitis virus (IBV) in Guangxi province of China in recent years,S1 genes were cloned,sequenced and analysed in 26 IBV strains isolated between 2013 and 2015 in the study.The results showed that: 26 IBV strains of S1 gene nucleotide sequence lengths were 1 599 bp-1 632 bp,encoding 533-544 amino acids,indicated that there were many insertions and deletions.The nucleotide sequence homology of strains isolated was 76.5%-100%,the amino acid sequence homology was 74.4%-100%,the nucleotide and amino acid homology between the isolated and referenced strains were 75.9%-97.3% and 97.3%-74.9% respectively.Isolated strains can be divided into four main branches.In Nanning area,some strains were in the No 1 branch from 2013 to 2014,but the other strains were mainly distributed in the No 1.1 branch in 2015,it is a new popular trend.In Guilin area,strains were mainly distributed in No 1.3 and 4.2 branches,but some strains were found in No 3 and 4.2 branches in 2015,there was no obvious predominant pandemic strain.The strains isolated were very fragmented distribution in Yulin area,also does not have the obvious predominant pandemic strain.The homology of most isolates and vaccine strains was low,and some of the strains showed some regional characteristics toward the respective directions in the evolution.

Avian infectious bronchitis virus; S1 gene; genetic evolution

2015-11-06

南寧學(xué)院校級項目(2014JSGC04，2014XJ09)

于冬玲(1985-)，女，山東威海人，講師，碩士研究生，主要從事動物疾病研究。

S852.659.6;S858.31

A

1007-5038(2016)08-0019-05