趙鳳菊，顧貴波，李井春，王　竹

(遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧沈陽 110164)

?

大腸埃希菌PCR檢測方法的建立及應用

趙鳳菊，顧貴波，李井春，王竹

(遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧沈陽 110164)

本研究建立了一種快速診斷動物大腸桿菌病的PCR檢測方法，與傳統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)、生化鑒定方法相比較有效縮短了檢測時間，提高了檢測效率，同時為大腸桿菌病的快速診斷和流行病學調查提供了有效的技術手段。通過對大腸埃希菌ECs1048基因序列分析，利用Premier5.0軟件設計并合成了1對特異性引物，建立了檢測大腸埃希菌ECs1048基因的PCR檢測方法。通過反復試驗確定本方法的最佳退火溫度為56℃。靈敏性試驗和特異性試驗表明本方法能夠檢測出的最低菌懸液濃度為1.5×102CFU/mL，并具有較高的特異性。穩(wěn)定性與重復性試驗表明本方法具有良好的穩(wěn)定性。利用本方法對臨床樣品的檢測結果與生化試驗鑒定結果的符合率為100%。本研究建立的檢測方法靈敏性高、特異性強、穩(wěn)定性好，可應用于動物大腸桿菌病的診斷。

大腸埃希菌；聚合酶鏈反應；建立

大腸埃希菌(Escherichiacoli)廣泛存在于自然界中，其中致病性大腸埃希菌是能引起人和動物共同感染的重要人獸共患病病原[1]。在不發(fā)達和中等發(fā)達國家大腸埃希菌是引起新生兒敗血癥的主要原因之一，每年因新生兒敗血癥死亡的兒童達100萬以上[2]。5歲以下兒童中，30%～40%急性腹瀉病例是由致瀉大腸埃希菌引起的[3]。近5年來，每年每10個死亡的孩子中就有一個是腹瀉病導致的。隨著大型集約化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，病原性大腸埃希菌對畜牧業(yè)造成的損失已日益明顯[4]。由于大腸埃希菌抗原性復雜，血清型較多，且各血清型間幾乎沒有交叉保護作用，從而給本病的免疫預防造成很大困難[5-6]。因此，快速診斷成為有效控制大腸桿菌病的關鍵。

大腸埃希菌一般先根據(jù)其培養(yǎng)特性、生物學特性進行初步鑒定，然后根據(jù)生化試驗進行最終的確診。但傳統(tǒng)的細菌分離、生化試驗等鑒定方法存在操作過程繁瑣、耗時長等缺點[10]。因此，建立快速、特異的檢測方法對大腸桿菌病的診斷具有重要意義。隨著分子生物學技術的發(fā)展，PCR技術被廣泛應用于各種細菌病的病原鑒定。本研究根據(jù)大腸埃希菌的保守基因ECs1048序列設計引物，建立了大腸埃希菌PCR檢測方法。不僅為大腸桿菌病的快速診斷提供了技術支持，同時也為本病的有效防控提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品致病性大腸埃希菌臨床分離株、金黃色葡萄球菌、沙門菌、奇異變形桿菌、豬鏈球菌、巴氏桿菌由遼寧省動物疫病預防控制中心保存；大腸埃希菌ATCC25922購自杭州市天和微生物試劑有限公司；羊梭菌病多聯(lián)干粉滅活疫苗購自哈藥集團生物疫苗有限公司(201204)；臨床病料采自遼寧地區(qū)。

1.1.2主要試劑DNAzol提取試劑、ExTaqDNA聚合酶、10×ExTaqbuffer、2.5 mmol/L dNTPs、DNA Marker DL 2 000、溴化乙錠,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號分別為20130608、20130708；細菌腸桿菌科微量生化反應管，杭州天和微生物試劑公司產(chǎn)品。

1.1.3引物根據(jù)GenBank上登錄的大腸埃希菌ECs1048(EU902952.1)基因序列，利用Primer Premier5.0軟件設計并合成了1對特異性引物。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列為：F：5′-GCCTCGCCTGGAGAATGA-3′，R：5′-CCTGAGACTGCGGTGGAA-3′。擴增目的片段大小為272 bp。

1.2方法

1.2.1細菌的培養(yǎng)及DNA模板的制備將大腸埃希菌劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)18 h～24 h后，挑選典型菌落，用1 mL無菌生理鹽水制備成一定濃度的菌懸液。吸取200 μL菌懸液至1.5 mL Eppendorf管中，加入800 μL DNAzol提取試劑，混勻后4℃、12 000 r/min離心10 min。吸取900 μL上清，置于另一1.5 mL Eppendorf管中，加入500 μL無水乙醇，混勻后4℃、12 000 r/min離心5 min。吸棄上清，用無菌水配制的750 mL/L乙醇洗滌2次，干燥后用40 μL無菌水溶解沉淀，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2反應體系及反應條件優(yōu)化采用25 μL反應體系，通過對PCR反應體系及反應條件的優(yōu)化，確定PCR反應體系為：10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，ExTaq酶0.125 μL，滅菌水16.375 μL，模板 2 μL。

反應條件為：94℃ 5 min；94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 50 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL溴化乙錠)電泳，然后用凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.2.3特異性試驗提取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、奇異變形桿菌、豬鏈球菌、巴氏桿菌、羊梭菌病多聯(lián)干粉滅活疫苗菌的核酸，并設立無模板陰性對照。按優(yōu)化的PCR反應條件，分別以各菌種基因組DNA為模板進行PCR擴增，檢測該方法的特異性。

1.2.4敏感性試驗將純培養(yǎng)物制成1.5×108CFU/mL～101CFU/mL菌懸液，然后分別提取基因組DNA進行PCR擴增，檢測該方法的敏感性。

1.2.5重復性與穩(wěn)定性試驗利用優(yōu)化后的反應體系和反應條件，分3次提取大腸埃希菌標準陽性菌株的基因組DNA，并平行進行3次PCR擴增，檢測方法的穩(wěn)定性。

1.2.6臨床病料檢測

1.2.6.1細菌分離鑒定無菌采集18份臨床疑似病料，同時接種營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)18 h～24 h。并于麥康凱培養(yǎng)基上挑取典型菌落進行純培養(yǎng)，然后按廠家腸桿菌科細菌微量生化鑒定管要求進行生化鑒定。1.2.6.2臨床樣品的PCR檢測對18份臨床疑似病料樣品提取基因組DNA，用本試驗建立的PCR方法進行檢測并與細菌分離鑒定結果進行比較分析。

2　結果

2.1目的基因的擴增結果

分別提取大腸埃希菌標準菌株及臨床分離株的DNA，進行PCR擴增反應。結果顯示，可擴增出272 bp的目的基因條帶，證明該方法可擴增出hypothetical protein(ECs1048)基因(圖1)。

2.2特異性試驗結果

以優(yōu)化的PCR反應條件檢測該方法對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、奇異變形桿菌、豬鏈球菌、巴氏桿菌、梭菌的特異性。結果顯示，僅以大腸埃希菌的DNA為模板能擴增出特異性目的條帶。表明該方法具有較高的特異性，與其他病原無交叉反應(圖2)。

M.DNA標準DL 2 000;1.大腸埃希菌ATCC25922;2.大腸埃希菌分離株;N.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000;1.E.coliATCC25922;2.E.coliisolate;N.Negative control

圖1目的基因的PCR擴增

Fig.1PCR amplification of target gene

M.DNA標準DL 2 000;1.大腸埃希菌;2.金黃色葡萄球菌;3.沙門菌;4.奇異變形桿菌;5.豬鏈球菌 ;6.巴氏桿菌;7.羊梭菌病多聯(lián)干粉滅活疫苗

M.DNA Marker DL 2 000;1.E.coli;2.S.aureus;3.Salmonella;4.Proteusmirabilis;5.Streptococcussuis;6.Pasteurella;7.Clostridiumperfringens

圖2PCR特異性試驗

Fig.2The specificity test of PCR

2.3敏感性試驗結果

提取濃度為1.5×108～101CFU/mL的大腸埃希菌菌懸液的DNA為模板進行PCR擴增，電泳結果顯示，能擴增出目的條帶的最低菌懸液濃度為1.5×102CFU/mL(圖3)。

M.DNA Marker DL 2 000;1.1.5×108CFU/mL;2.1.5×107CFU/mL;3.1.5×106CFU/mL;4.1.5×105CFU/mL;5.1.5×104CFU/mL;6.1.5×103CFU/mL;7.1.5×102CFU/mL;8.1.5×101CFU/mL

圖3PCR敏感性試驗

Fig.3The sensitivity test of PCR

2.4重復性與穩(wěn)定性試驗結果

通過試驗表明該方法具有良好的重復性與穩(wěn)定性(圖4)。

2.5臨床病料的檢測結果

2.5.1細菌分離鑒定結果通過細菌分離培養(yǎng)與革蘭染色鏡檢，18份樣品中14份樣品分離菌的培養(yǎng)特征與鏡檢結果與大腸埃希菌相符。將這14份樣品的培養(yǎng)物進行生化鑒定，結果生化特性基本與大腸埃希菌相符。

M.DNA標準DL 2 000;1～3.第1次提取的DNA;4～6.第2次提取的DNA;7～9.第3次提取的DNA

M.DNA Marker DL 2 000;1-3.DNA extracted first time;4-6.DNA extracted second time;7-9.DNA extracted third time

圖4PCR方法重復性與穩(wěn)定性試驗

Fig.4The reproducibility and stability tests of PCR

2.5.2臨床樣品的PCR檢測應用建立的方法對18份臨床疑似病料進行檢測，14份為大腸埃希菌陽性，4份為大腸埃希菌陰性。將檢測結果與細菌分離培養(yǎng)鑒定結果相比較，結果顯示，該PCR方法鑒定結果與病原分離培養(yǎng)鑒定結果符合率為100%。證明建立的方法可以準確地檢測出病料中的大腸埃希菌，可以很好的應用于臨床樣品的檢測(圖5)。

M.DNA標準DL 2 000;1～18.臨床樣品;N.陰性對照:P.陽性對照

3　討論

大腸埃希菌是人和各種動物腸道內的正常菌群，一般情況下不具有致病力，其中一些特殊血清型的大腸埃希菌對人和動物有致病性，能夠引起人和動物的腹瀉、敗血癥、心內膜炎、肺炎、泌尿道感染、幼畜或幼兒腦炎、腹膜炎等[11-12]。傳統(tǒng)的細菌分離鑒定雖然能夠滿足臨床的部分需要，但仍存在需時較長的缺點。隨著分子生物學技術的發(fā)展，PCR技術已經(jīng)成功應用于多種細菌病的病原鑒定。PCR技術的應用不僅提高了檢測的準確性，還加快了檢測速度，為動物疫病防控爭取到寶貴時間，降低了動物疫病給畜牧業(yè)可能造成的經(jīng)濟損失，同時也為有效控制動物疫病的傳播提供了新的技術支持。

本試驗建立的大腸埃希菌PCR檢測方法能夠擴增出與預期大小一致的目的基因條帶，且對其他6種細菌均無擴增反應，表明該PCR檢測方法具有較高的特異性。通過敏感性試驗發(fā)現(xiàn)在菌懸液濃度為1.5×102CFU/mL時也能擴增出清晰的目的條帶，表明其具備較好的敏感性。對該PCR檢測方法的重復性評價說明建立的方法具有較高的精確度和良好的穩(wěn)定性。大腸埃希菌PCR檢測方法建立后，利用該方法與傳統(tǒng)的細菌分離鑒定方法同時對臨床患病豬的樣品進行檢測，符合率達100%，說明建立的方法不僅可應用于純培養(yǎng)物的檢測，也可成功應用于臨床樣品的檢測。

準確的疫病診斷是采取有效控制疫病蔓延的關鍵，而檢測方法的靈敏性與特異性又是準確診斷的必要條件。近幾年，豬群特別是規(guī)?；i場頻繁發(fā)生腹瀉性疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。然而導致豬只腹瀉的原因多而復雜，雖然采取了相應的防治措施，但防治效果并不明顯。大腸埃希菌是引起腹瀉的一個重要原因，但因為一些因素導致易被人們忽視。全面分析發(fā)病原因，采取合理的治療措施，對疫病有效防控尤為重要。本試驗建立的檢測方法不僅為大腸桿菌病的診斷提供了有效的技術支持，也為本病的有效防控提供了理論依據(jù)。

[1]馬增軍,芮萍,逯春香.豬源腸外致病性大腸桿菌的分析與鑒定[J].中國人獸共患病學報，2015,31(2):130-134.

[2]Cools P,Jespers V,Hardy L,et al.A multi-country cross-sectional study of vaginal carriage of group B streptococci (GBS) andEscherichiacoliin resource-poor settings:prevalences and risk factors[J].PLoS One,2016,11(1):e0148052.doi: 10.1371/journal.pone.0148052.

[3]Odetoyin B W,Hofmann J,Aboderin A O,et al.DiarrhoeagenicEscherichiacoliin mother-child pairs in Ile-Ife,South Western Nigeria[J].BMC Infect Dis,2016,16(1):28. doi: 10.1186/s12879-016-1365-x.

[4]Liu L,Johnson H L,Cousens S,et al.Global,regional,and national causes of child mortality:an updated systematic analysis for 2010 with time trends since [J].Lancet,2012,379:2151-2161.

[5]陳浦言.獸醫(yī)傳染病學[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2012.

[6]高榮琨,王麗芳,李銳，等.太原地區(qū)雞源性大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].中國預防獸醫(yī)學報,2013,35(8):631-634.

[7]Hu P,Janga S C,Babu M,et al.Global functional atlas ofEscherichiacoliencompassing previously uncharacterized proteins[J].PLoS Biol,2009,7(4):e96. doi: 10.1371/journal.pbio.1000096.

[8]Neuhaus K,Landstorfer R,Fellner L,et al.Translatomics combined with transcriptomics and proteomics reveals novel functional,recently evolved orphan genes inEscherichiacoliO157:H7 (EHEC) [J].BMC Genomics,2016,17:133. doi: 10.1186/s12864-016-2456-1.

[9]Tautz D,Domazet-Loso T.The evolutionary origin of orphan genes[J].Nat Rev Genet,2011,12(10):692-702.

[10]黃埔和平,楊霞,趙軍,等.鴨源雞桿菌雙重PCR檢測方法的初步建立[J].中國預防獸醫(yī)學報,2013,35(8):640-643.

[11]姜曉冰.大腸桿菌質粒介導喹諾酮耐藥機制研究[D].廣東廣州:華南理工大學,2013.

[12]郭雪麗,王紅寶,李紅麗,等.山西省致病性豬大腸桿菌分離及生物特性研究[J].養(yǎng)豬,2015(2):97-99.

Establishment and Preliminary Application of PCR for DetectingEscherichiacoli

ZHAO Feng-ju,GU Gui-bo,LI Jing-chun,WANG Zhu

(Prevention and Control Center of Liaoning Province Animal Epidemic Disease,Shenyang，Liaoning，110164,China)

This study established a rapid diagnostic PCR method for colibacillosis in animals.Compared with traditional bacterial culture,biochemical identification method,the PCR can effectively reduce the test time,improve the detection efficiency.Also it provided the effective technical means for rapid diagnosis and epidemiological investigation of the disease.Based on ECs1048 gene sequence fromEscherichiacoli,a pair of specific primers were designed and synthesized by premier 5.0 software,and the PCR detection method for ECs1048 gene was established.The optimum annealing temperature of the method was 56℃ by repeated experiments.Sensitivity and specificity tests showed that the method can detect the minimum suspension concentration 1.5×102CFU/mL,and has a high specificity.Stability and repeatability tests showed that the method has good stability.At the same time,the method was applied to detect the clinical samples,and the coincidence rate of the test results and the biochemical test results was 100%.Thus,The detection method established in this study has high sensitivity,strong specificity and good stability.It can be used in the laboratory diagnosis of colibacillosis in animals.

Escherichiacoli;polymerase chain reaction;establishment

2016-03-05

遼寧省自然科學基金項目(201402573)；遼寧省農(nóng)業(yè)攻關及產(chǎn)業(yè)化項目(2015202013)

趙鳳菊(1978-)，女，河北廊坊人，高級獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物人畜共患病的防控與研究。

S852.615.2

A

1007-5038(2016)08-0011-04