付　強(qiáng)，王愛富，李桂珍，羅惠娜，馬春全

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山 528231)

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研究論文

馬鏈球菌獸疫亞種SeseC-00619蛋白的功能研究

付強(qiáng)，王愛富，李桂珍，羅惠娜，馬春全*

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山 528231)

為了闡明馬鏈球菌獸疫亞種新蛋白SeseC-00619(細(xì)胞表面蛋白,cell surface protein,CSP)的功能，本試驗(yàn)采用real-time qPCR分析CSP的體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)特征，同時(shí)在大腸埃希菌中表達(dá)與純化馬鏈球菌獸疫亞種表面相關(guān)蛋白CSP，研究其免疫反應(yīng)性及免疫保護(hù)功能，并試圖解釋其分子機(jī)制。通過流式細(xì)胞術(shù)與黏附抑制試驗(yàn)探索CSP對(duì)小鼠肺上皮細(xì)胞的黏附作用。結(jié)果表明，CSP是一個(gè)重要的體內(nèi)誘導(dǎo)抗原，并且能在S.zooepidemicus細(xì)菌表面表達(dá)，屬于細(xì)菌表面蛋白。重組蛋白CSP能夠黏附LA-4細(xì)胞表面，而這種黏附作用可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制S.zooepidemicus黏附宿主細(xì)胞。本結(jié)果為進(jìn)一步研究CSP基因的功能及其在致病機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。

細(xì)胞表面蛋白；黏附；致病機(jī)制

馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcusequissp.zooepidemicus,S.zooepidemicus) 屬于乳桿菌目、鏈球菌科、鏈球菌屬，能引起豬、馬、綿羊、奶牛等多種動(dòng)物發(fā)病，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠、兔等對(duì)該菌也極為易感，在我國(guó)主要引起豬鏈球菌病[1-3]。豬鏈球菌病是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要細(xì)菌性疾病，嚴(yán)重危害我國(guó)乃至世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。

現(xiàn)有的研究對(duì)S.zooepidemicus的毒力因子和保護(hù)抗原缺乏全面的了解，因此現(xiàn)階段全面控制S.zooepidemicus感染仍然存在很多困難[4-5]。近年來S.zooepidemicus菌株的基因組測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SeseC-00619(cell surface protein,CSP)具有典型LPXTG的細(xì)胞壁錨定域，很可能是一種細(xì)菌表面蛋白。因?yàn)镃SP無同源蛋白或與其他蛋白序列無顯著的同源性[6]，所以深入研究CSP的功能對(duì)闡明S.zooepidemicus的分子致病機(jī)制具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種、載體和細(xì)胞馬鏈球菌獸疫亞種菌株、大腸埃希菌基因工程菌株DH5α、大腸埃希菌BL21、表達(dá)質(zhì)粒pET-28a (+)、小鼠肺上皮細(xì)胞LA-4均由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.1.2試劑細(xì)菌RNA抽提用Trizol試劑，Invitrogen公司產(chǎn)品；DNase Ⅰ，Promega公司產(chǎn)品；Taq酶、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和SalⅠ、T4連接酶、DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR相關(guān)試劑，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；UNIQ-10 柱式離心式DNA凝膠回收試劑盒，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG-FITC，Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1Real-time qPCR培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的S.zooepidemicus作為體外培養(yǎng)細(xì)菌，感染小鼠體內(nèi)細(xì)菌的富集方法按照Fu Q等描述的方法進(jìn)行[7]。使用Trizol試劑提取體內(nèi)富集細(xì)菌和體外培養(yǎng)細(xì)菌的RNA，以DNase Ⅰ去除DNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以回收的CSP和16 S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定其濃度，換算濃度(ng/μL)至拷貝數(shù)/μL。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品做10倍梯度稀釋，稀釋的濃度分別為1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷貝數(shù)/μL，以其作為模板繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR反應(yīng)體系(總體積為25 μL)：上、下游引物各0.5 μL，10×SYBR Green real-time PCR Master Mix 12.5 μL，雙蒸水 11 μL，cDNA 樣品0.5 μL 。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。PCR擴(kuò)增條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s, 55℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。整個(gè)反應(yīng)過程中的熒光信號(hào)的變化由LightCycler 480 (Roche)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)。按照文獻(xiàn)[8-9]描述的2-ΔΔCt方法對(duì)熒光定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2CSP基因的克隆應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增CSP基因的引物,兩端分別添加BamHⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基。P1：5′- CAATCGCTAATACGGAATTCGAGG -3′；P2：5′- CTTCGTGCGTCGACGCTGGTTTC -3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以CTAB法提取的S.zooepidemicus基因組作為PCR模板，按下列順序配制反應(yīng)試劑。反應(yīng)體系25 μL：2.5 μL的10×buffer，2.5 μL MgCl2，2.5 μL dNTP Mixtrue，10 μmol/L引物各0.5 μLTaqDNA 聚合酶0.1 μL，DNA模板2 μL，加無菌雙蒸水至25 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。用BamHⅠ和SalⅠ同時(shí)酶切PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物及pET-28a (+)，回收PCR片段以及載體片段。將回收 PCR片斷與 pET-28a(+)連接，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.3重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及純化將表達(dá)菌株接種于添加氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃搖床培養(yǎng)。從培養(yǎng)好的菌液中取 100 μL接種于含氨芐青霉素的新鮮 LB液體培養(yǎng)基中，于 37℃振蕩培養(yǎng)約3 h，至OD 600 nm 達(dá)到0.6～1.0時(shí)，添加IPTG至終濃度為0.8 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng) 3 h后收集菌體。將超聲波破碎后的上清液用Ni-NTA親和樹脂純化。

1.2.4免疫熒光檢測(cè)用PBS洗3次并調(diào)整細(xì)菌的密度約為1×108CFU/mL，取5 μL均勻涂在蓋玻片上，加入100%的甲醇在-20 ℃固定10 min，然后加入相應(yīng)的血清200 μL，37 ℃孵育1 h后用PBS洗片3次，加入FITC標(biāo)記的IgG，37 ℃避光孵育1 h后用TBST洗片3次，風(fēng)干后固定在載玻片上，用熒光顯微鏡觀察[10]。

1.2.5免疫保護(hù)試驗(yàn)將純化的重組蛋白CSP與Marcol 52佐劑乳化后作為疫苗，濃度為 200 μg/mL，設(shè)置佐劑對(duì)照(即用生理鹽水與等量佐劑乳化制備)和空白對(duì)照(只注射生理鹽水)。4周齡的雌性Balb/c小鼠(約18 g)每組10只，免疫方法如下：首免腹腔注射佐劑乳化的抗原0.5 mL，2周后腹腔注射免疫佐劑乳化的抗原0.5 mL。二免10 d后進(jìn)行保護(hù)力試驗(yàn)，分別接種相同劑量的S.zooepidemicus(2×105CFU)，連續(xù)觀察2周，記錄小鼠的死亡情況。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)按照Lin L等[11]描述的方法進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CSP黏附LA-4細(xì)胞，用10 g/L的BSA封閉LA-4細(xì)胞，加入10 μg純化后的重組蛋白CSP，冰上孵育45 min后加入200 μL相應(yīng)的血清，冰上孵育45 min；于4 ℃ 、2000 r/min離心3 min，棄上清，用500 μL預(yù)冷的BSA溶液洗2次，加入FITC標(biāo)記抗體，冰上孵育45 min；用濾膜過濾后加入到流式管中，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.7抑制黏附試驗(yàn)抑制黏附試驗(yàn)參照Chen B等[12]描述的方法進(jìn)行，往24孔板培養(yǎng)的LA-4細(xì)胞加入10 μg純化后的重組蛋白CSP(加入BSA作為對(duì)照)，于37 ℃孵育45 min，然后用PBS洗3次再加入500 μL用DMEM重懸的細(xì)菌 (1×107CFU/mL)，于4 ℃孵育2 h；用PBS洗細(xì)胞3次后加入1 mL的Triton X-100裂解液，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)；蛋白抑制細(xì)菌黏附細(xì)胞的計(jì)算[1-(蛋白處理的CFU/BSA處理的CFU)]×100。

2　結(jié)果

2.1Real-time qPCR分析CSP的體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)

標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1A所示，CSP標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.550 5x+34.782，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，擴(kuò)增效率為1.215；16 S rRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.574 3x+35.907，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，擴(kuò)增效率為1.214。CSP與16 S rRNA的引物擴(kuò)增效率基本一致，滿足試驗(yàn)要求，表明本試驗(yàn)的real-time PCR能準(zhǔn)確反映轉(zhuǎn)錄水平。抽提體內(nèi)感染細(xì)菌的 RNA和體外培養(yǎng)細(xì)菌的RNA，應(yīng)用real-time qPCR技術(shù)比較感染動(dòng)物前后CSP表達(dá)量的變化，結(jié)果見圖1B，相對(duì)于體外培養(yǎng)的細(xì)菌，S.zooepidemicus感染小鼠脾臟分離細(xì)菌CSP的mRNA表達(dá)上調(diào)30倍，表明CSP屬于體內(nèi)誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)的抗原，很可能在S.zooepidemicus感染宿主過程中發(fā)揮重要作用。

2.2CSP純化后SDS-PAGE鑒定及Western blot 分析

使用Ni-NTA樹脂做親和層析，純化重組表達(dá)的CSP蛋白(融合His標(biāo)簽)，結(jié)果見圖2。收集的目的蛋白超濾濃縮后，用于后續(xù)的試驗(yàn)分析。純化的重組蛋白用S.zooepidemicus康復(fù)血清做Western blot分析，結(jié)果如圖2所示，純化后的蛋白能與S.zooepidemicus康復(fù)血清反應(yīng)，出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，表明重組蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，可將該蛋白用于S.zooepidemicus攻毒保護(hù)力評(píng)價(jià)。

A.Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品模板的線性關(guān)系；B.小鼠脾臟富集的細(xì)菌的相對(duì)表達(dá)量

A.Calibration curves generated using the DNA standards for csp and 16 S rRNA；B.The csp collected from spleens of three SEZ-infected mice were upregulated relative to genes culturedinvitro

圖1實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)

Fig.1Quantitation of theinvivo-induced gene transcripts by real-time qPCR

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.IPTG誘導(dǎo)前的樣品；2.誘導(dǎo)后的樣品；3.純化后的樣品；4.蛋白與康復(fù)血清雜交的結(jié)果

M.Protein molecular weight Marker; 1.Non-induced expression products; 2.Induced expression products; 3.Purified proteins; 4.Western blot analysis of recombinant protein with convalescent sera againstS.zooepidemicus

圖2純化重組CSP蛋白的SDS-PAGE鑒定及Western blot 分析

Fig.2SDS-PAGE and Western blot analysis of recombinant CSP

2.3間接免疫熒光試驗(yàn)驗(yàn)證蛋白的表面分布

通過氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)CSP無同源蛋白或與其他蛋白序列無顯著的同源性，但是CSP具有典型LPXTG的細(xì)胞壁錨定域，很可能是一種細(xì)菌表面蛋白。為了證明蛋白是否在細(xì)菌的表面表達(dá)，使用CSP的抗體進(jìn)行了間接免疫熒光試驗(yàn)，陰性對(duì)照血清作為試驗(yàn)的陰性對(duì)照。結(jié)果如圖3所示，CSP的抗體染色后可以見到細(xì)菌表面具有特異性的綠色熒光，而陰性血清染色后未見明顯的綠色熒光，表明CSP是免疫原性蛋白且分布于細(xì)菌的表面，可將該蛋白用于S.zooepidemicus攻毒保護(hù)力評(píng)價(jià)。

2.4CSP蛋白的保護(hù)效力

為了評(píng)價(jià)CSP蛋白的保護(hù)效力，各組小鼠在二次免疫后第10天分別接種相同劑量的S.zooepidemicus(2×105CFU)，評(píng)價(jià)重組蛋白的免疫保護(hù)力。結(jié)果見圖 4，空白對(duì)照組小鼠的死亡率為70%，陰性對(duì)照組小鼠的死亡率為60%，而試驗(yàn)組小鼠的死亡率僅為0，表明CSP蛋白具有較高的保護(hù)效力。

圖3　免疫熒光分析CSP(A和B)與陰性對(duì)照(C和D)

2.5CSP蛋白黏附上皮細(xì)胞

定量PCR初步評(píng)價(jià)了CSP在體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)的特性，暗示這些蛋白在細(xì)菌感染宿主過程中可能起到重要作用。為了探討重組蛋白是否參與細(xì)菌黏附LA-4細(xì)胞的過程，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)重組蛋白CSP黏附細(xì)胞的功能。結(jié)果如圖5所示，細(xì)胞與重組蛋白孵育，其平均熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組的平均熒光強(qiáng)度，表明重組蛋白CSP可以黏附LA-4細(xì)胞。

圖4　重組CSP蛋白的保護(hù)效力

A.選中的未染色的細(xì)胞；B.重組蛋白CSP(空白框)處理及BSA處理(陰影框)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度

2.6CSP蛋白的黏附抑制試驗(yàn)

為了進(jìn)一步分析CSP蛋白在S.zooepidemicus黏附宿主細(xì)胞過程中的作用，本試驗(yàn)進(jìn)行了黏附抑制試驗(yàn)，CSP蛋白與細(xì)胞孵育后，再用S.zooepidemicus感染細(xì)胞，計(jì)算抑制黏附的效率。結(jié)果如圖6所示，重組蛋白CSP能抑制75.7%的細(xì)菌黏附細(xì)胞，這表明CSP在S.zooepidemicus黏附細(xì)胞的過程中起到關(guān)鍵的作用。

圖6　重組蛋白CSP抑制S.zooepidemicus黏附LA-4細(xì)胞

3　討論

細(xì)菌在環(huán)境發(fā)生改變的時(shí)候，可以迅速調(diào)整某些基因的表達(dá)水平以適應(yīng)環(huán)境的改變，一些毒力相關(guān)因子在培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)表達(dá)水平低或者不表達(dá)，當(dāng)感染宿主進(jìn)入宿主體內(nèi)后被誘導(dǎo)表達(dá)[13]。本試驗(yàn)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析CSP在體內(nèi)、體外的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CSP在S.zooepidemicus感染時(shí)上調(diào)表達(dá)，屬于體內(nèi)增強(qiáng)表達(dá)的抗原，暗示CSP在細(xì)菌感染宿主過程中可能發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步研究CSP在S.zooepidemicus致病過程中的作用有助于更好地闡明該蛋白的功能。

氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，CSP具有典型LPXTG的細(xì)胞壁錨定域，是一種細(xì)菌表面相關(guān)蛋白。本試驗(yàn)通過間接免疫熒光試驗(yàn)進(jìn)一步證明CSP抗體染色后細(xì)菌表面具有特異性的綠色熒光，而陰性血清染色后未發(fā)現(xiàn)明顯的綠色熒光，說明CSP確實(shí)分布于S.zooepidemicus的表面。多種革蘭陽(yáng)性菌的表面蛋白能結(jié)合宿主蛋白，這些表面蛋白被認(rèn)為是潛在的毒力因子，是疫苗研發(fā)的疫苗候選[14-16]。此外，純化后的CSP蛋白能與S.zooepidemicus康復(fù)血清反應(yīng)，表明重組蛋白具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性，具有作為疫苗候選的潛力，可進(jìn)一步將該蛋白用于S.zooepidemicus攻毒保護(hù)力評(píng)價(jià)。試驗(yàn)采用Marcol 52佐劑乳化的CSP免疫小鼠，能夠抵御S.zooepidemicus的攻擊，無疑是很好的保護(hù)性抗原。

CSP能夠保提供較高的保護(hù)力，可作為疫苗候選抗原。本試驗(yàn)深入探索CSP提供保護(hù)效力的機(jī)制，通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，重組蛋白CSP能夠黏附LA-4細(xì)胞表面；而黏附抑制試驗(yàn)表明這種黏附功能可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制細(xì)菌黏附宿主細(xì)胞，可以推測(cè)CSP抗體能阻斷S.zooepidemicus黏附侵入宿主從而起到保護(hù)作用[17]。這些試驗(yàn)結(jié)果揭示了CSP可能與宿主的某些基因相互作用，調(diào)控S.zooepidemicus黏附宿主上皮細(xì)胞過程。而細(xì)菌黏附宿主的上皮細(xì)胞無疑是細(xì)菌突破宿主防御系統(tǒng)的關(guān)鍵步驟，因此，CSP很可能在S.zooepidemicus黏附侵入宿主的過程中起到關(guān)鍵作用。CSP具體的黏附機(jī)制以及CSP如何影響致病功能仍未得到闡明，這些問題有待下一步通過構(gòu)建基因缺失突變菌株及回復(fù)突變菌株的研究來闡明。

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Study on SeseC-00619 Function of Streptococcus equi ssp.zooepidemicus

FU Qiang,WANG Ai-fu,LI Gui-zhen,LUO Hui-na,MA Chun-quan

(Foshan University,Foshan,Guangdong,528231,China)

In order to study the function of a protective antigen, SeseC-00619 (cell surface protein, CSP) ofStreptococcusequissp.zooepidemicus(S.zooepidemicus),real-time qPCR was used CSP was inducedinvivofollowing infection of mice withS.zooepidemicus. Immunofl uorescence assay was carried out to confirm that CSP was located at the surface ofS.zooepidemicuscells. The purified recombinant CSP could confer significant protection against challenge with lethal dose ofS.zooepidemicusin mice model. In addition, CSP could adhere to the LA-4 cells confirmed by flow cytometry and inhibit adherence ofS.zooepidemicusto LA-4 cells in an adherence inhibition assay. Our findings encouraged further research for the pathogenesis ofS.zooepidemicusCSP protein.

cell surface protein; adherence; pathogenesis

2016-05-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31502047)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014A030310020)；廣東高校優(yōu)秀青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(2014KQNCX179)

付強(qiáng)(1983-)，男，廣東英德人，講師，博士，主要從事動(dòng)物分子免疫學(xué)研究。*通訊作者

S852.611;S858.21

A

1007-5038(2016)08-0001-05