楊 娥殷紅巖陳都紅陳德森（.湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 442000）

·研究報(bào)告·

丹參提取液對(duì)大鼠子宮缺血再灌注損傷的保護(hù)作用*

楊 娥1殷紅巖1陳都紅1陳德森2△
（1.湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 442000）

目的 觀察丹參提取液對(duì)缺血再灌注模型大鼠子宮的影響，為臨床研究子宮缺血再灌注損傷的防治提供理論依據(jù)。方法 SD大鼠36只，采用線栓法建立大鼠子宮缺血再灌注損傷模型，在術(shù)前連續(xù)7 d用丹參提取液灌胃進(jìn)行干預(yù)并設(shè)為丹參組，另設(shè)假手術(shù)組和模型組作對(duì)照。檢測(cè)術(shù)后24 h大鼠子宮組織白介素-2 （IL-2）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和乳酸脫氫酶（LDH）濃度，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)子宮組織中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，丹參組大鼠子宮組織中Bax蛋白表達(dá)、IL-2和MDA顯著降低（P＜0.05），而SOD活性、Bc1-2蛋白表達(dá)顯著提高（P＜0.05）。結(jié)論 丹參提取液對(duì)大鼠子宮缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與其下調(diào)Bax蛋白、提高SOD活性、抑制自由基對(duì)缺血再灌子宮組織的破壞、降低IL-2造成的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

丹參提取液 子宮缺血再灌注損傷 總超氧化物歧化酶 Bcl-2 Bax

【Abstract】Objective：To establish uterine ischemia reperfusion injury model of rat，and to observe the effect of Chinese herbal medicine Salvia miltiorrhiza extract on the uterus of rats with ischemia reperfusion injury to provide theoretical basis for clinical study of the prevention and treatment of uterine ischemia reperfusion injury.Methods：Uterine ischemia reperfusion injury model of 36 SD rats was established with thread embolism method，before operation receiving Salvia miltiorrhiza extract intragastric administration to intervene for 7 days as Danshen group.Sham operation group and the model group were used as control.The levels of IL-2，malondialdehyde （MDA），total superoxide dismutase（SOD）and lactate dehydrogenase（LDH）were detected in 24 hours after operation，and the expression of Bc1-2 and Bax in uterine tissues was detected by immunohistochemistry.Results：Compared with the model group，Bax protein expression，IL-2 and MDA in the rat's uterine tissue of Salvia miltiorrhiza group decreased significantly（P＜0.05），and SOD activity and Bcl-2 protein expression increased significantly（P＜0.05）.Conclusion：Salvia miltiorrhiza can Huoxue has the effects of blood circulation，regulating menstruation，removing blood stasis and anti-inflammatory and a protective effect on uterine ischemia/reperfusion injury in rats，whose mechanism may be related to reducing Bax protein，increasing the activity of SOD，inhibition of free radicals on ischemia reperfusion of uterine tissue damage and decreasing IL-2 caused by inflammation.

【Key words】Salvia miltiorrhiza extract；Uterine ischemia reperfusion injury；Total superoxide dismutase；Bcl-2

任何子宮手術(shù)和有創(chuàng)檢查均有可能發(fā)生子宮缺血再灌注損傷并影響子宮的生殖功能［1］。臨床以胎盤(pán)早期剝離、子宮破裂、剖宮產(chǎn)、流產(chǎn)引產(chǎn)等手術(shù)造成的缺血再灌注損傷為重，近年來(lái)研究表明丙二醛（MDA）與組織器官缺血再灌注損傷有關(guān)［2］。而臨床常用的子宮收縮藥如縮宮素催產(chǎn)和引產(chǎn)及產(chǎn)后出血均有可能造成子宮收縮止血或阻斷血管止血的同時(shí)造成子宮缺血再灌注損傷［3］，故如何減輕或防治子宮缺血再灌注損傷是本研究的目的。活血調(diào)經(jīng)和祛瘀消炎是丹參主要藥性，藥理研究表明其可抗自由基、抗氧化、擴(kuò)張血管、增加缺血組織血液流量，抑制缺血區(qū)組織細(xì)胞內(nèi)鈣超載而發(fā)揮對(duì)缺血再灌注損傷的組織修復(fù)作用［4］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定大鼠子宮組織超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）濃度、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)等指標(biāo)來(lái)探討中藥丹參提取液對(duì)大鼠子宮缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制，為臨床研究子宮缺血再灌注損傷的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 普通級(jí)SD雌性大鼠36只，體質(zhì)量179～245 g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［許可證號(hào)：SYXK（鄂）2011-0031］，手術(shù)操作均在標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)室進(jìn)行 ［SCXK（鄂）2011-0008］。術(shù)后動(dòng)物房溫度保持在20～22℃，濕度50%～75%，24 h交替光照，分籠飼養(yǎng)動(dòng)物，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)即可。

1.2 藥物及試劑 丹參 （十堰市太和醫(yī)院中藥房提供）；水合氯醛（北京化學(xué)試劑公司提供）；Bcl-2和Bax蛋白測(cè)試盒 （北京博凌科為生物科技有限公司提供）；SOD、MDA、乳酸脫氫酶（LDH）和白介素-2（IL-2）試劑盒（南京建成生物工程研究所提供）。

1.3 干預(yù)方法 先將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)，用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和丹參組。參照人與動(dòng)物體表面積換算公式［5］，丹參組在術(shù)前連續(xù)7 d用10 mg/d劑量丹參提取液灌胃給藥進(jìn)行干預(yù)，模型組和假手術(shù)組給予腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液。

1.4 模型制備 參照吉小微等［6］線栓法制備子宮缺血再灌注模型。造模前禁食不禁水，用體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/kg），起效后腹部向上固定于大鼠手術(shù)固定器，碘伏消毒，于恥骨聯(lián)合上2 cm處向上腹正中切開(kāi)腹腔暴露子宮。然后從尾靜脈注射50 U/kg肝素，5 min后翻出兩側(cè)腹壁組織，在子宮底處用5號(hào)絲線縫分別結(jié)扎兩側(cè)子宮，用玻璃分針鈍性分離大鼠腹主動(dòng)脈并用4號(hào)絲線結(jié)扎之，30 min后去除兩側(cè)子宮和腹主動(dòng)脈結(jié)扎線復(fù)灌。模型組手術(shù)同上，假手術(shù)組僅開(kāi)腹不結(jié)扎，5 min后關(guān)閉腹腔。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 參照文獻(xiàn) ［7］擬定，于干預(yù)前和造模后4 h，3組各取6只大鼠，處死，分別取其子宮組織，-30℃低溫冰箱暫存待測(cè)。1）IL-2、MDA、SOD和LDH濃度檢測(cè)。分別取子宮組織研磨，勻漿，5000 r/min離心10 min，取上清液，嚴(yán)格按試劑盒步驟操作，用分光光度計(jì)檢測(cè)子宮組織中IL-2、MDA、SOD和LDH濃度。2）Bcl-2和Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)檢測(cè)。采用免疫組織化學(xué)法，參照文獻(xiàn)［8］提取Bcl-2和Bax蛋白，取暫存子宮標(biāo)本，多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋、脫水、切片（厚約5 μm）。烤片，脫水后抗原修復(fù)，37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記工作液，反應(yīng)染色后沖洗，蘇木精復(fù)染，脫水后封固。Bcl-2和Bax陽(yáng)性為胞質(zhì)及胞膜內(nèi)側(cè)出現(xiàn)黃至棕黃色顆粒，取5個(gè)高倍鏡視野（400倍）計(jì)數(shù)每個(gè)高倍鏡視野內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，取平均值。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，用LSD檢驗(yàn)顯著性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 丹參提取液對(duì)大鼠子宮組織中IL-2和LDH的影響 見(jiàn)表1。模型組干預(yù)后子宮組織IL-2和LDH含量均明顯升高，與本組干預(yù)前和假手術(shù)組干預(yù)后同時(shí)期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。丹參組干預(yù)后IL-2含量降低，但仍高于假手術(shù)組，與模型組干預(yù)后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組子宮組織中IL-2和LDH水平比較（±s）

表1 各組子宮組織中IL-2和LDH水平比較（±s）

與本組干預(yù)前比較，*P＜0.05；與假手術(shù)組干預(yù)后比較，△P＜0.05；與模型組干預(yù)后比較，▲P＜0.05。下同。

組 別 時(shí)間 LDH（μmol/L） IL-2（ng/mL）假手術(shù)組 干預(yù)前 150.81±19.33 0.89±0.15 （n=6） 干預(yù)后 153.81±21.34 0.94±0.18模型組 干預(yù)前 147.06±22.74 0.91±0.27 （n=6） 干預(yù)后 185.71±23.42*△2.87±0.42*△丹參組 干預(yù)前 143.71±18.83 0.85±0.25 （n=6） 干預(yù)后 179.29±17.39*1.26±0.38▲

2.2 丹參提取液對(duì)大鼠子宮組織MDA和SOD的影響 見(jiàn)表2。模型組干預(yù)后大鼠子宮組織MDA明顯升高，SOD明顯降低，與干預(yù)前和假手術(shù)組干預(yù)后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組干預(yù)后比較，丹參組MDA顯著降低，SOD明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組子宮組織MDA和SOD水平比較（μmol/L，±s）

表2 各組子宮組織MDA和SOD水平比較（μmol/L，±s）

組別 時(shí)間 MDA SOD假手術(shù)組 干預(yù)前 1.81±0.22 127.82±13.78 （n=6） 干預(yù)后 1.72±0.16 120.71±15.27模型組 干預(yù)前 1.57±0.24 119.63±17.12 （n=6） 干預(yù)后 65.31±7.92*△62.08±6.07*△丹參組 干預(yù)前 1.78±0.16 123.79±15.29 （n=6） 干預(yù)后 5.95±0.37▲102.05±15.71▲

2.3 丹參提取液對(duì)大鼠子宮組織Bcl-2和Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)的影響 見(jiàn)表3。模型組干預(yù)后Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯著增強(qiáng)，Bcl-2降低，與干預(yù)前和假手術(shù)組干預(yù)后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組干預(yù)后比較，丹參組Bcl-2表達(dá)明顯增強(qiáng)，Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)有一定程度下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

丹參性涼、味苦、歸心、肝經(jīng)，具有活血調(diào)經(jīng)、消癥化瘀、排膿消腫之功效，用于婦女癥塊、血瘀經(jīng)閉、惡露、月經(jīng)不調(diào)等頑疾［9］?！侗静菥V目》謂丹參 “補(bǔ)新血，調(diào)經(jīng)脈，心經(jīng)邪火，令血調(diào)和，此其滋養(yǎng)而生血也”［10］?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，丹參提取液中富含水溶性丹參素和脂溶性丹參酮ⅡA等［11］。亦有研究表明，鈣超載是引起缺血再灌注損傷的根源，缺血再灌注時(shí)自由基大量生成，脂質(zhì)過(guò)氧化促使膜的通透性增高，溶酶體膜損傷引起溶酶體釋放，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能造成線粒體功能障礙，故極時(shí)阻止脂質(zhì)。

表3 各組子宮組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 各組子宮組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)比較（±s）

組 別 時(shí) 間 Bcl-2蛋白吸光度值 Bax蛋白吸光度值假手術(shù)組 干預(yù)前 5.10±0.27 4.61±0.27 （n=6） 干預(yù)后 4.93±0.18 4.27±0.16模型組 干預(yù)前 4.99±0.29 4.95±0.26 （n=6） 干預(yù)后 2.97±0.47*△29.01±5.12*△丹參組 干預(yù)前 4.84±0.54 5.12±0.21 （n=6） 干預(yù)后 12.71±2.33▲11.74±1.19▲

觀察發(fā)現(xiàn)，模型組缺血再灌注后子宮組織IL-2、MDA和LDH含量、Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯著增強(qiáng)，Bcl-2蛋白和SOD明顯降低，提示缺血再灌注造成機(jī)體各種指標(biāo)改變，造模方法可靠。丹參組干預(yù)后較模型組干預(yù)后大鼠子宮組織IL-2、MDA和LDH含量、Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)下調(diào)，Bcl-2和SOD明顯增高，提示丹參提取液具有明確的缺血再灌注保護(hù)作用。在本實(shí)驗(yàn)中，子宮組織復(fù)灌后，產(chǎn)生自由基會(huì)加劇脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，生成有細(xì)胞毒性的產(chǎn)物MDA，加速生物膜的破壞。有研究發(fā)現(xiàn)，水溶性丹參素是超氧陰離子清除劑，與SOD的作用相似，可清除超氧陰離子，減少氧自由基的產(chǎn)生［12］。另外，脂溶性丹參酮ⅡA可通過(guò)阻斷羥自由基的合成并最終清除線粒體的脂質(zhì)自由基［13］。姚常柏等［14］研究發(fā)現(xiàn)丹參注射液對(duì)H-Fe體系中的羥自由基的清除率達(dá)65%，對(duì)黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶體系中的超氧陰離子的清除率達(dá)100%。IL-2作為炎癥介質(zhì)，在機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，主要起到誘導(dǎo)和激活T、B淋巴細(xì)胞的作用，IL-2增多時(shí)可增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的溶酶體酶活性，增強(qiáng)由T、B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞吞噬功能［15］，故IL-2增多會(huì)造成過(guò)度炎癥反應(yīng)而加重組織細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)中，丹參組大鼠在干預(yù)后IL-2明顯降低，提示丹參提取液通過(guò)抑制T、B淋巴細(xì)胞分化，阻斷IL-2介導(dǎo)激活T、B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞吞噬功能，減少炎癥細(xì)胞對(duì)缺血缺氧子宮浸潤(rùn)，達(dá)到避免或減少炎癥反應(yīng)加重的現(xiàn)象［16］。缺血再灌注后子宮組織存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，Bcl-2和Bax蛋白與凋亡調(diào)控直接相關(guān)，Bc1-2蛋白水平增高可抑制細(xì)胞凋亡，Bax蛋白水平增高會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2蛋白是一種跨膜蛋白，在抗凋亡中發(fā)揮重要作用，可阻斷因氧自由基、缺血缺氧等刺激引起的細(xì)胞凋亡［17］。丹參組Bax表達(dá)降低、Bcl-2表達(dá)增高，這可能是丹參提取液中的脂溶性丹參酮ⅡA對(duì)子宮缺血再灌注損傷時(shí)，可能通過(guò)阻斷羥自由基的合成并最終清除線粒體的脂質(zhì)自由基［18］，抑制細(xì)胞凋亡Bax蛋白，增高Bcl-2而抑制細(xì)胞凋亡，起到缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

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Protective Effect of Salvia Miltiorrhiza Extract on Rat with Uterine Ischemia Reperfusion Injury

YANG E，YIN Hongyan，CHEN Douhong，et al.Taihe Hospital of Shiyan，Hubei，Shiyan 442000，China.

R969 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

1004-745X（2016）08-1515-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.08.017

湖北省十堰市科技局資助課題（ZD2013003）

（電子郵箱：glhcds@163.com）

2016-03-30）