沈俊逸 方邦江凌 麗 陳振翼 王曉翠（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032）

·研究報(bào)告·

復(fù)元醒腦湯對(duì)糖尿病腦梗死大鼠腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF基因及蛋白表達(dá)作用的研究*

沈俊逸 方邦江△凌 麗 陳振翼 王曉翠
（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032）

目的 觀察復(fù)元醒腦湯對(duì)糖尿病腦梗死大鼠腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF基因及蛋白表達(dá)的干預(yù)作用。方法 120只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、治療組各30只。造模完成后，治療組予以復(fù)元醒腦湯，假手術(shù)組、模型組予以0.9%氯化鈉注射液，灌胃7 d。測(cè)定比較各組實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF的mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 各組腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF三種基因及蛋白表達(dá)具有類似趨勢(shì)，由高到低依次為正常對(duì)照組、治療組、模型組及假手術(shù)組。正常對(duì)照組高于假手術(shù)組；治療組高于模型組（均P＜0.01）。結(jié)論 復(fù)元醒腦湯可上調(diào)SDF-1、CXCR4及VEGF的mRNA及蛋白表達(dá)水平，改善受損血管內(nèi)皮功能及修復(fù)功能而促進(jìn)局部血管再生和側(cè)支循環(huán)建立。

糖尿病腦梗死 復(fù)元醒腦湯 SDF-1 CXCR4 VEGF

【Abstract】Objective：To carry out the effect of Fuyuan Xingnao Decoction on the gene expression and protein secretion of SDF-1、CXCR4 and VEGF in diabetic cerebral infarction rats.Methods：Randomly all the enrolled healthy male SD rats were divided into 4 groups as Group C（control），Group AD（treated with placebo after acute cerebral infarction combined with diabetes mellitus），Group DM（diabetes mellitus without acute cerebral infarction）and Group AT （treated with Fuyuan Xingnao Decoction after acute cerebral infarction combined with diabetes mellitus）.After 7 day，the gene expression and protein secretion of SDF-1、CXCR4 and VEGF were measured in each samples.Results：Descendingly among all the groups the gene expression and protein secretion order of SDF-1，CXCR4 and VEGF were Group C，Group AT，Group AD and Group DM.Those of Group C were significantly overtopped than those of Group DM （P＜0.01）.Those of Group AT were significantly elevated in comparison with Group AD（P＜0.01）.Conclusion：Fuyuan Xingnao decoction can improve the gene expression and protein secretion of SDF-1、CXCR4 and VEGF in diabetic cerebral infarction rats，and then improve the vascular regeneration and the establishment of the collateral circulation.

【Key words】Fuyuan Xingnao Decoction；Diabetic cerebral infarction；SDF-1；CXCR4；VEGF

眾多研究表明糖尿病患者腦梗死發(fā)病率、致殘率及死亡率均較非糖尿病者高，機(jī)制尚不明確［1-7］。這給臨床治療及預(yù)防帶來(lái)很大困難。本實(shí)驗(yàn)所用方藥復(fù)元醒腦湯是方邦江教授臨床常用的治療糖尿病并發(fā)腦梗死基礎(chǔ)方，經(jīng)臨床驗(yàn)證療效顯著。前期多項(xiàng)研究業(yè)已證實(shí)，復(fù)元醒腦湯能改善糖尿病腦梗死大鼠神經(jīng)行為和缺血腦組織病理結(jié)構(gòu)，降低腦系數(shù)、腦組織含水量、腦血管通透性而緩解腦水腫［8-10］。研究結(jié)果示，內(nèi)源性內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）具有修復(fù)缺血性腦損傷的能力［11］，而基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）及其高度特異性受體CXCR4、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等外源性細(xì)胞因子能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的募集和動(dòng)員［12］，從而促進(jìn)缺血腦組織恢復(fù)以及血管新生。目前關(guān)于單純糖尿病血管病變或單純腦梗死SDF-1/CXCR4的研究眾多，而糖尿病并發(fā)腦梗死SDF-1/CXCR4變化的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從糖尿病并發(fā)腦梗死的分子生物學(xué)機(jī)制入手進(jìn)行了研究，并對(duì)中醫(yī)中藥治療的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，以期為臨床治療及預(yù)防提供理論依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 120只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量（250± 25）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院科技樓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（滬）2011-009。

1.2 藥物 復(fù)元醒腦湯［人參10 g（單煎），三七10 g，石菖蒲12 g，水蛭10 g，益母草30 g，生南星15 g，制大黃9 g（后下）］，由上海市龍華醫(yī)院制劑室生產(chǎn)提供，生藥質(zhì)量濃度為388 g/L。

1.3 儀器及試劑 1）凝膠成像儀GelDoc XR+，臺(tái)灣Amersham Pharmacia Biotech公司生產(chǎn)，熒光定量PCR儀、Applied Biosystems，北京Funglyn Biotech Incorporated生產(chǎn)；ABI 7900HT，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn)，BX51光學(xué)顯微鏡153714-709，日本Olympus生產(chǎn)；DP2-BSW攝像系統(tǒng)17267-617，日本Olympus生產(chǎn)；電泳儀164-5056，美國(guó)BIO-BAD公司生產(chǎn)；轉(zhuǎn)膜儀 170-3939，美國(guó) BIO-BAD公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀51119000美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)Bioshine ChemiQ，上海鷗翔科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。2）多聚甲醛、水合氯醛，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司生產(chǎn)；STZ美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)；PMSF，美國(guó)Amresco公司生產(chǎn)；RIPA裂解液，上海市碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；BCA蛋白分析試劑盒上海市碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；Actin抗體，美國(guó)CST公司生產(chǎn)；SDF-1抗體，美國(guó)CST公司生產(chǎn)；CXCR4抗體，美國(guó)CST公司生產(chǎn)；VEGF抗體，美國(guó)CST公司生產(chǎn)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG，美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，美國(guó)Millipore公司生產(chǎn)；逆轉(zhuǎn)錄M-MLV1試劑盒（RT-PCR），美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)；FastStart Universal SYBR Green，上海葉舟生物科技有限公司生產(chǎn)；TRI REAGENT RNA提取試劑盒，美國(guó)Molecular Research Center，Inc生產(chǎn)；引物合成引物，上海生工生物工程股份有限公司提供。

1.4 模型制備［13］將STZ試劑溶于pH為4.6的檸檬酸鈉緩沖液中（現(xiàn)配現(xiàn)用），大鼠接受腹腔注射STZ試劑（50 mg/kg）［14］，1周后成模（血糖>16.7 mmol/L），并連續(xù)高脂飲食飼養(yǎng)2周。實(shí)施自體血栓栓塞性大鼠腦梗塞模型手術(shù)［15-16］，1）制作血栓：將模型組、治療組兩組糖尿病大鼠用10%水合氯醛溶液按30 mg/100 g劑量麻醉后［17］，先暴露其股靜脈，抽取靜脈血0.5 mL加入預(yù)先加有75 U凝血酶的EP管中，立即混勻。然后用注射器吸取沉淀部分注入2根頭皮針?biāo)芰瞎軆?nèi)，靜置15 min再打進(jìn)盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中，洗掉凝血塊表面的紅細(xì)胞。在顯微鏡下選擇富含纖維素（深色）的血栓剪切成1～2 mm的小段，再轉(zhuǎn)入pH為7.4的PBS緩沖液中恒溫（37℃）靜置5 h使其凝縮，然后吸入EP50管中備用。2）制作腦梗死模型：將大鼠按前法麻醉后用眼科鑷子鈍性分離出左側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈。結(jié)扎頸外動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，用提前制備好的一毫升注射器針頭（將頭處折1個(gè)90°的平鉤）在頸外動(dòng)脈上挑刺出一個(gè)小口。將吸入血栓的EP50導(dǎo)管由頸外動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，松開(kāi)頸內(nèi)動(dòng)脈上的動(dòng)脈夾。緩慢將血栓注入頸內(nèi)動(dòng)脈，用生理鹽水沖管后拔出EP50導(dǎo)管，結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端。松開(kāi)頸總動(dòng)脈夾，縫合肌肉和皮膚。3）假手術(shù)組不將導(dǎo)管插入頸外動(dòng)脈，其余操作與手術(shù)組相同，手術(shù)過(guò)程中控制動(dòng)物肛溫在（37±0.5）℃。

1.5 分組及藥物干預(yù) 在常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)后按照正常對(duì)照組30只、糖尿病組90只進(jìn)行隨機(jī)分組的糖尿病組采用STZ腹腔注射法致糖尿病模型，造模成功后，連續(xù)高脂飲食飼養(yǎng)2周，再將糖尿病組按每組均等例數(shù)（每組30例）隨機(jī)分為糖尿病腦梗死組（模型組）、糖尿病腦梗死假手術(shù)組（假手術(shù)組）、糖尿病腦梗死治療組 （治療組），完成造模后，治療組每日按10.4 mL/（kg·d），每日2次，以復(fù)元醒腦湯灌胃（參照陳奇主編《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》依實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體表面積比計(jì)算），模型組、假手術(shù)組予以等量的生理鹽水灌胃，連續(xù)7 d后處死取材。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF mRNA表達(dá)水平檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，模型組、假手術(shù)組、治療組分別給與10%水合氯醛深度麻醉后，快速斷頭取腦，剪開(kāi)皮膚暴露頭及頸段，從頸椎處剪斷脊髓，剝離頸部肌肉，用止血鉗剔除顱骨，去除硬腦膜，迅速將腦組織100 mg放在液氮中冷凍。反復(fù)研磨成粉末，加入1 mL的TRI REAGENT RNA，氯仿抽提，異丙醇沉淀，75%酒精漂洗。DEPC水溶解RNA，反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA，進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。引物的序列分別為：VEGF Front primer CCTGGCTTTACTGCTGTACCT，reverse primer GCTGGTAGACGTCCATGAACT；SDF-1 Front primer GCTCTGCATCAGTGACGGTA，Reverse primer AGGGCACAGT TTGGAGTGTT；CXCR4 Front primerGCACATCATGGTGGGTCTCA，Reverseprimer CCCCACGTAATACGGTAGCC；β-Actin Front primer CAAGTTCAACGGCAC AGTCA，Reverse primer CACCCCATTTGATGTTAGCG。2）腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF蛋白表達(dá)水平檢測(cè)：稱取模型組、假手術(shù)組、治療組30 mg腦組織，加入取500 μL的裂解液RIPA充分裂解，用BCA試劑盒定量蛋白。SDS page電泳，轉(zhuǎn)膜。孵育的一抗抗體SDF-1抗體，CXCR4抗體，VEGF抗體（1∶1000），4℃過(guò)夜 孵育二抗抗體（1∶5000），室溫1 h振蕩孵育，ECL法曝光顯影。

2 結(jié) 果

2.1 各組腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF的基因表達(dá)水平比較 見(jiàn)表1和圖1。結(jié)果示SDF-1、CXCR4、VEGF 3種基因與Actin的相對(duì)表達(dá)量由高到低依次為正常對(duì)照組、治療組、模型組及假手術(shù)組。其中正常對(duì)照組與假手術(shù)組比較各基因的表達(dá)量均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；治療組3種基因表達(dá)水平均高于模型組（均P＜0.01）；模型組與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF的基因表達(dá)量比較（±s）

表1 各組腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF的基因表達(dá)量比較（±s）

與模型組比較，**P＜0.01；與正常對(duì)照組比較，△△P＜0.01。下同。

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圖1 各實(shí)驗(yàn)組腦組織中SDF-1、CXCR4、VEGF的基因表達(dá)量

2.2 各組腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF蛋白表達(dá)水平比較 見(jiàn)表2和圖2，圖3。造模結(jié)束后，每組各取5只大鼠進(jìn)行SDF-1、CXCR4、VEGF蛋白表達(dá)量檢測(cè)。圖2為 SDF-1、CXCR4、VEGF 3種蛋白的 Western Blot圖，進(jìn)行灰度值掃描后得到了各蛋白與Actin的相對(duì)表達(dá)水平。由表2和圖3可見(jiàn)SDF-1、CXCR4、VEGF 3種蛋白與Actin的相對(duì)表達(dá)水平由高到低依次為正常對(duì)照組、治療組、模型組及假手術(shù)組。正常對(duì)照組與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P＜0.01）；治療組中各蛋白的表達(dá)量均高于模型組（均P＜0.01）；模型組中各蛋白表達(dá)量均高于假手術(shù)組（均P＜0.01）。

表2 各組腦組織中SDF-1、CXCR4、VEGF的蛋白表達(dá)量比較（±s）

表2 各組腦組織中SDF-1、CXCR4、VEGF的蛋白表達(dá)量比較（±s）

與假手術(shù)組比較，##P＜0.01。

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圖2 各組腦組織中SDF-1、CXCR4、VEGF典型的蛋白表達(dá)量

圖3 各組腦組織中SDF-1、CXCR4、VEGF的蛋白表達(dá)量

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)元醒腦湯治療糖尿病腦梗死后大鼠的SDF-1、CXCR4和VEGF的基因表達(dá)與蛋白分泌均高于生理鹽水治療組。據(jù)報(bào)道EPCs具有修復(fù)缺血性腦損傷的能力［18］，SDF-1/CXCR4在腦缺血損傷后EPCs的“歸巢”中起著重要的調(diào)節(jié)作用［12］，而損傷局部VEGF的表達(dá)也對(duì)EPCs的“歸巢”起到相應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，從而增強(qiáng)缺血局部的神經(jīng)和血管再生［19］；我們因此推測(cè)復(fù)元醒腦湯治療糖尿病腦梗死大鼠可能的分子機(jī)制在于直接提高或通過(guò)提高其調(diào)節(jié)因子SDF-1、CXCR4和VEGF的基因表達(dá)及蛋白分泌而間接提高了EPCs的細(xì)胞功能，從而增強(qiáng)缺血局部的神經(jīng)和血管再生。

既往研究資料證實(shí)只有在病理狀態(tài)下SDF-1、CXCR4和VEGF 3種基因與蛋白才會(huì)有所表達(dá)和分泌［20-21］，這似乎與本實(shí)驗(yàn)中正常對(duì)照組上述因子高的結(jié)果相悖；經(jīng)過(guò)大量查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)糖尿病機(jī)體的SDF-1、CXCR4及VEGF的基因表達(dá)及蛋白分泌是顯著下調(diào)的［22］，本實(shí)驗(yàn)也得出同樣的結(jié)論。文獻(xiàn)亦報(bào)告了腦梗死機(jī)體SDF-1、CXCR4及VEGF基因與蛋白的表達(dá)與分泌是上調(diào)的［23-24］，因此推測(cè)在糖尿病腦腦梗死機(jī)體中，糖尿病對(duì)上述基因、蛋白的下調(diào)與腦梗死的上調(diào)聯(lián)合作用的結(jié)果是糖尿病的下調(diào)占了優(yōu)勢(shì)，因此本實(shí)驗(yàn)得出正常對(duì)照組基因表達(dá)與蛋白分泌高于假手術(shù)組的結(jié)果。此外以上基因、蛋白改變是否與時(shí)間有關(guān)本實(shí)驗(yàn)未涉獵，可以通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其確切變化趨勢(shì)及相關(guān)機(jī)制。

近年來(lái)，人們?cè)絹?lái)越多地關(guān)注糖尿病合并腦梗死的研究，在這些研究中，復(fù)方治療研究是最多的，這也表現(xiàn)了腦梗死疾病治療的主要方向。經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)總結(jié)后，現(xiàn)在的大部分研究人員普遍認(rèn)為糖尿病并發(fā)腦梗死中醫(yī)基本致病機(jī)是“氣陰兩虛、瘀痰阻絡(luò)”，“活血通絡(luò)”為糖尿病腦梗死的基本原則。由于糖尿病合并腦梗死是一個(gè)非常嚴(yán)重的病癥，該病致病機(jī)理以及治療手段不同于其他的一些疾病，因此在治療方案的運(yùn)用中常是中西醫(yī)結(jié)合，利用中成藥復(fù)方治療本病的同時(shí)配合西醫(yī)降低血糖、改善體內(nèi)細(xì)胞脫水等常規(guī)療法?？傊?，中醫(yī)治療糖尿病腦梗死有豐富的經(jīng)驗(yàn)和大量的實(shí)驗(yàn)支持。

本研究從SDF-1/CXCR4、VEGF生物學(xué)軸對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的調(diào)控，促進(jìn)血管修復(fù)與新生的角度，探討復(fù)元醒腦湯促進(jìn)糖尿病腦梗死缺血腦組織血管修復(fù)與新生的分子機(jī)制與有效作用靶點(diǎn)，是一個(gè)可行的全新思路與重要切入點(diǎn)。此外還從該角度對(duì)糖尿病腦梗死的作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究，為進(jìn)一步深入明確糖尿病腦梗死確切機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)，其研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步加深對(duì)糖尿病腦梗死等血管并發(fā)癥病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)和防治水平的提高。

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Experimental Study of Fuyuan Xingnao Decoction on the Gene Expression and Protein Secretion of SDF-1，CXCR4 and VEGF in Diabetic Cerebral Infarction Rats

SHEN Junyi，F(xiàn)ANG Bangjiang，LING Li，et al.Longhua Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China

R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

1004-745X（2016）08-1457-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.08.001

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81273725）

（電子郵箱：fangbji@163.com）

2016-06-24）