胡亞暖，姚永明，張澤敏，張　帆，王　君，楊彪炳

（1.濰坊醫(yī)學院整形外科　山東 濰坊　261053；2.費縣人民醫(yī)院　山東 臨沂　273400；3. 濰坊醫(yī)學院整形外科研究所　山東 濰坊 261053）

不同濃度EGF對兔ADSCs體外誘導分化為表皮細胞的實驗研究

胡亞暖1，姚永明1，張澤敏1，張帆2，王君1，楊彪炳3

（1.濰坊醫(yī)學院整形外科山東 濰坊261053；2.費縣人民醫(yī)院山東 臨沂273400；3. 濰坊醫(yī)學院整形外科研究所山東 濰坊 261053）

目的：探究表皮生長因子（EGF）對兔脂肪來源干細胞（ADSCs）體外誘導分化為表皮細胞以及所需最佳濃度的實驗研究，為組織工程在大面積皮膚缺損方面的研究提供進一步的理論依據(jù)。方法：取2個月齡健康新西蘭大白兔的脂肪組織，體外分離、培養(yǎng)并傳代ADSCs。實驗分為誘導組和未誘導組，誘導組分別用5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的EGF進行干預，未誘導組用等量的生理鹽水作空白對照。觀察不同濃度的EGF對ADSCs誘導分化為表皮細胞的形態(tài)學變化，并于1周后對細胞進行免疫熒光及熒光定量PCR檢測CK-19和整合素β（integrinβ）的表達情況。結果：光鏡下顯示誘導組細胞形態(tài)仍呈長梭形或多角形；免疫熒光結果顯示誘導組（10ng/ml組）表皮細胞特異性標記物CK-19表達呈陽性，且其表達量明顯高于其他組，未誘導組細胞呈陰性；熒光定量PCR結果顯示誘導組（10ng/ml組）表皮細胞的特異性因子CK-19和integrinβ的mRNA表達量均明顯高于其余組（P＜0.01）。結論：表皮生長因子能夠成功誘導兔脂肪來源干細胞定向分化為表皮細胞，且其最佳誘導濃度為10ng/ml。

脂肪來源干細胞；表皮生長因子；表皮細胞；濃度

Key worlds: adipose derived stem cells； EGF； epidermis cells； concentration

大面積皮膚缺損是外科領域中的一項重大難題。目前，自體皮膚移植是治療皮膚組織缺損的一種有效方法。然而，自體皮膚移植供區(qū)的皮膚來源有限，對患者的創(chuàng)傷較大，同時刃厚皮片存在不耐摩擦、缺乏彈性及易收縮等特點，中厚皮片又有瘢痕攣縮等問題。隨著組織工程技術的發(fā)展，皮膚替代物的研究取得了實質性的進展。脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是從脂肪組織中分離出來的多能干細胞，經(jīng)誘導后，可以向骨、軟骨、脂肪、肌肉、血管內(nèi)皮以及表皮細胞分化［1-2］，成為了繼骨髓間充質干細胞［3］之后的又一研究熱點。本實驗旨在探討不同濃度的表皮生長因子（ epidermal growth factor，EGF）對兔ADSCs誘導分化為表皮細胞的機制，以及尋找其最佳誘導濃度，以提高細胞培養(yǎng)成效，為今后臨床大面積皮膚組織缺損的治療提供了一定的理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1實驗動物及主要試劑、儀器：新西蘭大白兔（2～3個月齡）（購自濰坊醫(yī)學院動物中心）；DMEM培養(yǎng)基（高糖）（美國HyClone有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；EGF（北京博奧森生物技術有限公司）；CK-19單克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；反轉錄試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司）；SYBR Green熒光定量試劑盒（TAKARA）。

SW-CJ-1F型超凈工作臺（中國）；Heraews 二氧化碳培養(yǎng)箱（德國）；DMIL型倒置相差顯微鏡（德國Leica）；熒光PCR儀（澳大利亞Corbett）；KA-1000型低速離心機（鄭州南北儀器設備公司）；多功能冷凍離心機（德國Heraeus）。

1.2ADSCs的分離、培養(yǎng)、傳代以及鑒定：取大白兔新鮮脂肪，放置于無菌盤中，用PBS緩沖液沖洗3遍，剔除肉眼可見的小血管、包膜以及多余的組織，再次用無菌PBS沖洗3遍，剪成糊狀，于室溫環(huán)境中1 200r/min離心5min，用0.1%Ⅰ型膠原酶消化50min，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾后，加入DMEM培養(yǎng)液終止消化，室溫下1 200r/min離心10min，棄上清，留貼壁細胞；用低糖DMEM培養(yǎng)液重懸并接種至培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，24h后觀察細胞貼壁情況，48h進行首次換液，以后每2d換液一次。待細胞融合到培養(yǎng)瓶底80%～90%時，進行細胞傳代，每2d換液一次。取第3代細胞用細胞免疫熒光染色法檢測ADSCs表面特異性標記物CD34、CD44、CD29及CD106。

1.3EGF誘導ADSCs后CK-19的表達：用第3代ADSCs作為實驗細胞。將細胞接種于96孔板中，接種密度為1×103/孔，培養(yǎng)至生長階段，分為兩組：EGF誘導組和未誘導組。EGF實驗組在 96 孔板加入含有不同質量濃度EGF （ 5、10、20ng/ml）的DMEM培養(yǎng)液，各濃度設復孔；未誘導組不加EGF，亦設復孔。每隔48h換液1次，在 37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。1周后按照免疫熒光染色試劑盒說明對表皮細胞的特異性標志物CK-19進行檢測。

1.4熒光定量PCR檢測誘導后CK-19和integrinβ的mRNA表達：將定向誘導分化1周后的表皮細胞在培養(yǎng)瓶中用TRIZOL提取總的mRNA。以總的mRNA為模板，按照試劑盒說明書進行逆轉錄和PCR反應。逆轉錄采用20μl的反應體系：總RNA 4μl、5×gDNA Eraser buffer 2μl、RNase free dH2O 3μl、gDNA Eraser1μl，混勻后42℃ 2min；繼續(xù)加入5×PrimeScript Buffer2 4μl、RNase free dH2O 4μl，混勻離心加入RT Prime Mix 1μl，PrimeScript RT Enzyme MixI 1μl。反應條件：37℃15min、85℃5s。PCR采用12.5μl的反應體系：SYBR Green Mix 6.25μl、cDNA模板1μl、PCR Forward Primer 0.5μl、PCR Reverse Primer 0.5μl、RNase free dH2O 4.25μl。反應條件：94℃ 3min、94℃ 30s、60.8℃ 30s、72℃ 30s，40個循環(huán)，72℃延伸10min。檢測CK-19和integrinβ mRNA的表達。采用2-ΔΔCt方法計算各組基因相對表達量。

1.5統(tǒng)計學方法：采用目的基因Ct值/內(nèi)參Ct值進行CK-19和integrinβ mRNA的相對定量分析。相對定量值越低說明其表達量越高。采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，各組間比較采用方差分析，兩兩比較采用 SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1ADSCs形態(tài)學觀察及免疫熒光細胞化學染色鑒定：原代細胞最初呈圓形透亮，與脂滴共同漂浮于培養(yǎng)液中。6～8h開始沉降貼壁，貼壁后細胞多為短梭形、星形或小多角形。24h后貼壁細胞充分伸展，培養(yǎng)至第7天，細胞鋪滿瓶底，排列較整齊，并形成集落，彼此融合呈長梭形分布（圖1）。免疫熒光細胞化學染色檢測結果顯示，ADSCs特異性標志物CD44、CD29呈陽性表達（圖2），而造血系統(tǒng)相關抗原CD34、CD106則呈陰性表達，這說明分離培養(yǎng)的細胞為ADSCs。

2.2ADSCs經(jīng)不同濃度EGF誘導為表皮細胞后的形態(tài)學觀察：加入不同濃度EGF定向誘導ADSCs后細胞形態(tài)仍呈長梭形或多角形，且HE染色顯示細胞形態(tài)與未誘導組形態(tài)無明顯差別（圖3）。

圖1　倒置顯微鏡下觀察ADSCs的細胞形態(tài)（×40）（a：原代ADSCs培養(yǎng)20min；b：原代ADSCs培養(yǎng)4d；c：原代ADSCs培養(yǎng)7d）

圖2　第3代ADSCs免疫熒光細胞化學染色CD29（a）、CD44（b）呈陽性，CD34 （c）、CD106（d）呈陰性，×200

圖3　經(jīng)共培養(yǎng)誘導15d后，各誘導組經(jīng)倒置顯微鏡和HE染色觀察細胞形態(tài)無明顯變化，細胞仍呈長梭形或多角形并且呈魚群樣聚集（3a、3b、3c：×100；3d、3e、3f：×200）

2.3ADSCs誘導培養(yǎng)后免疫熒光細胞化學染色：免疫熒光檢測結果顯示，7d后誘導組相對于未誘導組CK-19的表達量都有不同程度的增多，且10ng/ml組CK-19的表達量明顯高于其他誘導組，20ng/ml組稍高于5ng/ml組。未誘導組未檢測到綠色熒光（圖4）。

圖4　ADSCs向表皮細胞分化鑒定：ADSCs成表皮誘導7d后，免疫熒光細胞化學染色，各誘導組（4a：5ng/ml，×200；4b：10ng/ml，×200；4c：20ng/ml，×200）CK-19表達呈陽性，未誘導組（4d：×200）呈陰性。而且10ng/ml組CK-19的表達明顯高于其他組

2.4熒光定量PCR檢測CK-19和integrinβ的mRNA表達：經(jīng)熒光定量PCR擴增，定向培養(yǎng)誘導后10ng/ml組的CK-19和integrinβ的mRNA表達明顯高于其他組（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計學意義。20ng/ml組略高于5ng/ml組（P＞0.05），差異無統(tǒng)計學意義（圖5）。

圖5　ADSCs經(jīng)不同濃度的EGF處理后表皮細胞的標志性因子CK-19和integrinβ的mRNA表達

3　討論

ADSCs來源于胚胎時期中胚層，具有向中胚層組織和神經(jīng)外胚層組織等分化的潛力［4］。與骨髓間充質干細胞相似，ADSCs也具有多向分化的潛能，在特定條件下可分化為脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞［5］、血管內(nèi)皮細胞、表皮細胞［6-7］，另外有大量學者報道了ADSCs亦可向星形膠質細胞［8］、神經(jīng)膜細胞［9］、尿路上皮細胞［10］和膀胱平滑肌細胞［11］誘導分化。相比骨髓干細胞，

脂肪干細胞具有來源豐富、易于獲得以及低免疫原性［12］等優(yōu)點。因此，ADSCs逐漸成為組織工程種子細胞的更優(yōu)選擇。研究表明，干細胞在誘導分化為表皮細胞的過程中，EGF可能是重要的誘導因素［13］，其通過參與損失后組織細胞的增殖分化而發(fā)揮作用，促進了細胞外基質的合成，也促進了真皮新生血管的生成［14-15］，而且還參與誘導皮膚干細胞增殖分化，加速表皮的再生。因此，我們希望ADSCs能夠成為理想的種子細胞來參與缺損創(chuàng)面的修復。本實驗旨在研究ADSCs被誘導分化為表皮細胞的可能性以及所需EGF最佳誘導濃度，為今后在皮膚組織工程上的應用及發(fā)展提供了一種可能。

在創(chuàng)面修復過程中，EGF起到了關鍵性的作用，它不僅誘導干細胞向表皮細胞分化，與其受體相結合，還通過G蛋白偶聯(lián)活化蛋白激酶系統(tǒng)引起細胞內(nèi)鈣含量的增加及蛋白磷酸化，并通過調(diào)節(jié)基因的表達，誘發(fā)DNA合成促進有絲分裂［16］，能促進細胞增殖、表皮再生、血管的形成；同時能夠刺激表皮細胞合成分泌膠原、透明質酸等細胞外基質從而促進結締組織細胞的生長［17］。據(jù)報道，CK-19和integrinβ是表皮干細胞的重要標記物［18-19］。因此，我們采用不同濃度的EGF誘導兔ADSCs，來觀察其向表皮細胞的轉歸情況。免疫熒光細胞化學染色顯示10ng/ml的誘導組細胞陽性表達CK-19的量明顯高于其他組，而在熒光定量PCR檢測培養(yǎng)誘導后的CK-19和integrinβ的mRNA表達中，10ng/ml的誘導組也明顯高于其他組。因此，筆者認為ADSCs誘導成為表皮細胞的過程中，EGF的最佳濃度為10ng/ml。本實驗旨在研究了ADSCs體外誘導分化為表皮細胞所需EGF的最佳誘導濃度，并未將其移植到在動物體內(nèi)以觀察其最終轉歸情況，這尚待我們更進一步的研究探索。

綜上所述，在治療皮膚缺損中，ADSCs是一種很有前景的治療方法，對臨床上解決嚴重創(chuàng)傷、大面積燒傷等患者的皮源缺乏問題以及促進創(chuàng)面愈合修復等問題開辟了一條新途徑。

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編輯/張惠娟

Effect of different concentrations of EGF on the source of adipose-derived stem cells in rabbits in vitro differentiation in the research of epidermal cells

HU Ya-uan1，YAO Yong-ming1，ZHANG Ze-min1，ZHANG Fan2，WANG Jun1，YANG Biao-bing3
（1.Department of Plastic Surgery，Graduate School，Weifang Medical University，Weifang 261053，Shandong，China；
2.Department of Plastic Surgery，Graduate， The People's Hospital Feixian，Linyi 273400， Shandong，China； 3.Institution of Plastic Surgery，Weifang Medical University，Weifang 261053，Shandong，China）

ObjectiveTo explore the EGF on ADSCs in rabbits in vitro differentiation of epidermal cells and the best concentration for tissue engineering on plastic surgery research provides theoretical basis for further .Explore the EGF on ADSCs in rabbits invitro differentiate of epidermal cells as well as the best optimal concentration needed for tissue engineering to provide further theoretical basis in plastic surgery.MethodsFat isolated from 2 months healthy white rabbit was isolated，cultured，generated ADSCs. Experiment is divided into induction group and not induced group，induced group with 8ng/ml，10ng/ml，20ng/ml of EGF to intervene，not induced group were compared with the same amount of saline.The work also includes observing the different concentration of EGF on ADSCs to epidermis cells in the change of morphology；ADSCs was induced 1 week and detection the expression and of CK-19，and Fluorescence PCR for testing the expression of CK-19 and integrinβ mRNA expression.ADSCs induced by one week of cells by immunofluorescence CK-19 expression was detected，and the fuorescence quantitative PCR to detect CK-19 integrin β of mRNA expression.ResultsInduction of groups with different concentration of EGF was not obvious change in morphology.The shape were still a long fusiform or polygon；Immunofuorescence showed that some cells of EGF for 10ng/ml can be induced group positive expression of the epidermal cells specific markers CK-19 and the number of expression is significantly higher than other groups，not induced group of cells in the test were negative； Fluorescence quantitative PCR results showed that the group of EGF for 10ng/ml expressing specifcity factor CK-19 and mRNA of integrinβ were signifcantly higher than the rest of the group （P＜0.01）.ConclusionEGF can successfully induced ADSCs to epidermal cells.Different concentrations of EGF on the source of ADSCs in rabbit in vitro differentiation，the best concentration of EGF is 10ng/ml.

Q813.1

A

1008-6455（2016）07-0047-04

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目（2014WS0470）

楊彪炳，主任醫(yī)師，碩士生導師；研究方向：整形外科，E-mail：ybiaobing@163.com

2016-04-08

2016-07-01