程德軍，黃　斌

(四川理工學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，四川 自貢 643000)

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六氫吡啶類小分子化合物的合成及性質(zhì)研究

程德軍，黃斌*

(四川理工學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，四川 自貢 643000)

在介導(dǎo)HIV-1進(jìn)入正常細(xì)胞的協(xié)同受體中，趨化因子受體CCR5具有重要的藥理學(xué)意義，因此開發(fā)具有藥代動力學(xué)性質(zhì)良好、高選擇性及高活性的小分子拮抗劑已成為研究的熱點(diǎn)，活性的苯甲酰胺類非肽類小分子備受關(guān)注.以4-六氫吡啶酮鹽酸鹽合成了N-乙基-N-(4-六氫吡啶)-4-氯苯甲酰胺(中間體4)，以2-羥基-5-溴苯甲醛為原料，通過還原、消去及取代反應(yīng)合成了4-氯苯甲氧基-4-溴-2-溴甲基苯(中間體7)，通過中間體制備了一種新的抗HIV-1候選化合物N-乙基-N-(N-(2-對氯苯甲氧基-5-溴苯甲基)-4-六氫吡啶)-4-氯苯甲酰胺(8)，目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)經(jīng)13CNMR、1HNMR、MS及IR確征，生物活性經(jīng)CalciumFluxAssay，PBMC及SPAGTPγSAssay檢測，表明該產(chǎn)物具有較高的生物活性.

甲酰胺；非肽類小分子化合物；六氫吡啶

獲得性免疫缺陷(HIV-1)正在全球蔓延，嚴(yán)重破壞了人類的免疫能力.苯甲酰胺類非肽類小分子是一類新型的CCR5拮抗劑，具有高效的抗艾滋病活性，通過對苯甲酰胺以及取代官能團(tuán)的轉(zhuǎn)換和修飾有助于CCR5先導(dǎo)化合物的研發(fā)，用以防治人類HIV-1感染[1-5].日本Takeda公司研發(fā)了一種非肽類小分子拮抗劑TAK779，苯甲酰胺類基因突變型非肽類小分子具有抗HIV-1的功能[6].具有苯甲酰胺、六氫吡啶及活性鹵素原子的非肽類小分子已成為關(guān)注重點(diǎn).

基于非肽類小分子的苯甲酰胺、六氫吡啶環(huán)基本結(jié)構(gòu)，作者采用Boc酸酐保護(hù)氨基，通過苯甲酰氯與氨基的氨解化得到中間體4(N-乙基-N-(4-六氫吡啶)-4-氯苯甲酰胺)；通過5-溴-2-羥基苯甲醛的羥基化反應(yīng)得到中間體 7(4-氯苯甲氧基-4-溴-2-溴甲基苯)，最后通過氨基與溴原子氨解化，制備了一種新的苯甲酰胺類拮抗劑，反應(yīng)溫度不高，合成路線較短，總產(chǎn)率較高，采用13CNMR、1HNMR、MS及IR對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證.CalciumFluxAssay，SPAGTPγSAssay及PBMC測試目標(biāo)產(chǎn)物的生物活性和抗病毒性.合成路線如圖1.

圖1　N-乙基-N-(N-(2-對氯苯甲氧基-5-溴苯甲基)-4-六氫吡啶)-4-氯苯甲酰胺的合成路線Fig.1　　　　Synthetic route to N-ethyl-N-(N-(2-((p-chlorobenzoxyyl) -5-bromobenzyl)-　　　4- hexahydropyridine)- 4-chlorobenzamide

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要儀器與試劑

對氯苯甲氯，AR，英國Alfa公司；丙酮、甲醇、二氯甲烷、三氟乙酸、硼氫化鈉、乙酸乙酯(EAC)、碳酸鉀，AR，重慶川東化工有限公司；5-溴-2-羥基苯甲醛、4-六氫吡啶酮，AR，上海金賽醫(yī)藥化工有限公司；二碳酸二叔丁酯((Boc)2O)、三乙酰氧基硼氫化鈉(STAB)、N-溴代丁二酰亞胺(NBS)，AR，上海隆盛化工有限公司；二甲基甲酰胺(DMF)，AR，上海諾泰化工有限公司.

質(zhì)譜儀，MSDVL，美國安捷倫科技公司；傅里葉變換紅外光譜儀，TENSOR27，德國布魯克公司；核磁共振波譜儀，AV600 600MHz，德國布魯克公司.

1.2N-乙基-N-(4-六氫吡啶)-4-氯苯甲酰胺(中間體 4)的合成

1.2.1N-Boc-4-六氫吡啶酮(中間體 1)的合成

取丙酮50.0mL、4-六氫吡啶酮鹽酸鹽15.29g(0.10mol) 及水300mL依次加入250mL三口燒瓶中，攪拌15min后緩慢加入0.38g·mL-1的(Boc)2O丙酮溶液60.0mL，常溫?cái)嚢?2h，蒸餾除去溶劑后用水及EAC萃取，用少量EAC再次萃取，無水Na2SO4干燥EAC層，過濾并蒸餾除去有機(jī)相得粉末狀白色固體(中間體1)19.78g，產(chǎn)率88.1%.

1.2.21-Boc-4-乙胺六氫吡啶(中間體2)的合成

參照文獻(xiàn)[7-8]的方法，取2.25g(0.027mol)乙胺鹽酸鹽及4.97g(0.026mol)中間體1加入裝有10.0mL甲醇和60.0mLTHF的三口燒瓶中，攪拌15min后分批加入7.94g(0.037mol)STAB，40min后用少量水及50.0mLEAC萃取，有機(jī)相用無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾得黃色油狀液體(中間體2)3.67g，產(chǎn)率64.6%.

1.2.3N-乙基-N-(N-Boc六氫吡啶)-4-氯苯甲酰胺(中間體3)的合成

參照文獻(xiàn)[8-10]的方法，取2.5mLN,N-二乙基乙胺、20.0mLCH2Cl2及1.15g(0.005mol)中間體2加入250mL三口燒瓶中，加入新制的對氯苯甲酰氯1.15g，攪拌50min，蒸餾除去CH2Cl2，用少量水和50.0mLEAC萃取，無水Na2SO4干燥有機(jī)相，經(jīng)柱層析(硅膠200～300目，石油醚(PE)∶乙酸乙酯(EA)=5∶1)純化、干燥得無色油狀液體(中間體3)1.43g，產(chǎn)率77.8%.

1.2.4N-乙基-N-(4-六氫吡啶)-4-氯苯甲酰胺(中間體4)的合成

取0.52g(0.001 4mol)中間體3、1.0mL的TFA及10.0mLCH2Cl2加入250mL三口燒瓶中，薄層色譜(TLC)檢測無中間體 3后，蒸干CH2Cl2，再加入20.0mLCH2Cl2，蒸餾以除去殘余的TFA，經(jīng)柱層析(硅膠200～300目，PE∶EA= 10∶1)純化、干燥得白色固體(中間體4) 0.42g，產(chǎn)率90.9%.

1.34-氯苯甲氧基-4-溴-2-溴甲基苯(中間體 7)的合成

1.3.12-對氯苯甲氧基-5-溴苯甲醛(中間體 5)的合成

參照文獻(xiàn)[11]的方法，取100mLDMF、4.25g(0.03mol)碳酸鉀、4.86g(0.03mol)對氯苯甲氯、5.00g(0.025mol)5-溴-2-羥基苯甲醛加入250mL三口燒瓶中，常溫下攪拌回流，TLC檢測無5-溴-2-羥基苯甲醛后，終止反應(yīng).倒入分液漏斗，并加入150mLEAC萃取2次，EAC用NaHCO3溶液和飽和NaCl洗滌；蒸干EAC得灰白色粉末(中間體 5)7.35g，產(chǎn)率90.2%.

1.3.22-對氯苯甲氧基-5-溴苯甲醇(中間體 6)的合成

參照文獻(xiàn)[11]的方法，取100mL甲醇和6.50g(0.02mol)中間體5加入250mL三口燒瓶中，分批加入0.90g(0.023mol)NaBH4，常溫?cái)嚢?h，TLC檢測無中間體5后，用NaOH溶液(2.0mol·L-1)淬滅反應(yīng)，過濾并蒸干甲醇，用EAC及少量水萃取，蒸干有機(jī)相得白色粉末(中間體 6)6.10g，產(chǎn)率92.5%.

1.3.34-氯苯甲氧基-4-溴-2-溴甲基苯(中間體 7)的合成

參照文獻(xiàn)[11]的方法，取5.35g(0.03mol)NBS、100mLCH2Cl2和7.52g(0.024mol)中間體6加入250mL三口燒瓶中，冰水浴并快速攪拌，分批加入8.0g(0.03mol)PPh3，加熱至20 ℃，TLC檢測無中間體6后，終止反應(yīng).過濾，飽和NaCl萃取，無水Na2SO4干燥有機(jī)相，濃縮并柱層析(硅膠200～300目，PE∶EA= 10∶1)分離，蒸干餾分得白色粉末(中間體7)8.81g，產(chǎn)率98.8%.

1.4N-乙基-N-(N-(2-對氯苯甲氧基-5-溴苯甲基)-4-六氫吡啶)-4-氯苯甲酰胺的合成(目標(biāo)產(chǎn)物 8)

取0.17g(0.001 2mol) 碳酸鉀、10.0mLDMF、0.28g(0.001mol) 中間體4以及0.40g(0.001mol)中間體7加入50mL單口燒瓶中，20 ℃下攪拌，TLC檢測無中間體7后終止反應(yīng)，加入EAC萃取，EAC層經(jīng)飽和NaCl洗滌，濃縮并柱層析(硅膠200～300目，PE∶EA= 10∶1)分離，蒸干餾分得白色粉末(目標(biāo)產(chǎn)物8)0.34g，產(chǎn)率59.3%.

1.5生物結(jié)合性及抗病毒活性測試

SPAGTPγSAssay結(jié)合實(shí)驗(yàn)采用文獻(xiàn)[12]的方法，細(xì)胞CHO/K1經(jīng)離心處理，分散于裂解液 (pH7.5，5mmol·L-1EDTA，5mmol·L-1Tris-HCl，5mmol·L-1EGTA)中，經(jīng)胰島素針抽提、沉淀，再分散于緩沖液(pH7.5，1mmol·L-1EDTA，50mmol·L-1Tris-HCl，100mmol·L-1NaCl，5mmol·L-1MgCl2)中，在30 ℃中溫育，加入已報(bào)道藥物TD0232-2-25b、TD0232-2-25c及目標(biāo)產(chǎn)物8(N-乙基-N-(N-(2-對氯苯甲氧基-5-溴苯甲基)-4-六氫吡啶)-4-氯苯甲酰胺)，當(dāng)化合物的抑制率達(dá)到或大于50%時(shí)，研究產(chǎn)物的[35S]GTPγS生物結(jié)合性，化合物的抑制率按公式處理：抑制率=100%×[1-(cpmcompound-cpmbasal)/(cpmagonist-cpmbasal)]；同樣采用文獻(xiàn)[12]的方法在CHO/CCR5上測定產(chǎn)物 8的生物活性(CalciumFluxAssay)和抗病毒活性(PBMC).

2　結(jié)果與討論

2.1主要中間體及產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征

兩種中間體4、7及目標(biāo)產(chǎn)物8以核磁共振氫譜(1HNMR600MHzCDCl3)測定化學(xué)位移值；核磁共振碳譜(1HNMR150MHzCDCl3)測定化學(xué)位移值；用質(zhì)譜(MS)測定分子離子峰，以表征中間體及目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu).所表征的結(jié)果見表1.

表1　中間體4、7及目標(biāo)產(chǎn)物8的MS、13C NMR及1H NMR數(shù)據(jù)

以上分析測試結(jié)果表明，中間體 4為N-乙基-N-(4-六氫吡啶)-4-氯苯甲酰胺；中間體 7即是2-溴甲基-4-溴-1-((4-氯芐基)氧)苯；產(chǎn)物 8為N-乙基-N-(N-(2-對氯苯甲氧基-5-溴苯甲基)-4-六氫吡啶)-4-氯苯甲酰胺.

2.2活性檢測結(jié)果

產(chǎn)物8的生物結(jié)合性分析為SPAGTPγSAssay(IC50=7.14nM)和CalciumFluxAssay(IC50= 22.4nM)，抗病毒活性測試(EC50= 52nMPBMC細(xì)胞).與已知拮抗劑TD0232[12]相比，產(chǎn)物8的生物結(jié)合性CalciumFluxAssay半數(shù)抑制率稍高于TD0232(IC50= 18.1nM)，生物結(jié)合活性SPAGTPγSAssay優(yōu)于TD0232的半數(shù)抑制濃度(IC50= 11.4nM)，雖然抗病毒活性稍不如TD0232-2-25b(EC50= 16.0nM)，但其抗病毒活性高于TD0232-2-25c的(EC50= 88.0nM)，表明該苯甲酰胺有一定的抗病毒活性以及較好的受體結(jié)合活性.

3　討　論

為解決非肽類小分子抑制劑只能作用于CCR5的單個(gè)位點(diǎn)的問題，作者設(shè)計(jì)并合成了一種新的非肽類小分子，該小分子不但含有活性的苯甲酰胺基本結(jié)構(gòu)，同時(shí)具有活性的氯代芳香環(huán)；在人體體液pH下，該分子的叔胺結(jié)構(gòu)可以被質(zhì)子化形成季銨鹽，該產(chǎn)物具有兩個(gè)叔胺原子；在苯環(huán)上引入疏水基團(tuán)氯原子；親水與疏水基團(tuán)間以活性的六氫吡啶連接.通過這些結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)以增加目標(biāo)產(chǎn)物的抗病毒活性和生物結(jié)合性.

中間體4(N-乙基-N-(4-六氫吡啶)-4-氯苯甲酰胺)以1-芐基-4-六氫吡啶酮為原料，為避免氨解化對氨基的影響，通過Boc酸酐保護(hù)氨基；中間體 7(4-氯苯甲氧基-4-溴-2-溴甲基苯)以5-溴-2-羥基苯甲醛、對氯苯甲氯為原料，通過羥基化、醛基還原及NBS溴化得到；最后，通過中間體 4、中間體 7的氨基化合成了一種新的苯甲酰胺類小分子拮抗劑N-乙基-N-(N-(2-對氯苯甲氧基-5-溴苯甲基)-4-六氫吡啶)-4-氯苯甲酰胺，其結(jié)構(gòu)經(jīng)MS、13CNMR、1HNMR及IR表征，采用的合成路線遠(yuǎn)少于其他CCR5拮抗劑[12-13]的合成步驟，其總產(chǎn)率(約為19.7%)較高，而且，反應(yīng)條件不高.

產(chǎn)物顯示了較好的生物結(jié)合性(SPAGTPγSAssay(IC50=7.13nM)、CalciumFluxAssay(IC50=22.3nM))；抗病毒活性測試結(jié)果(EC50= 52nM)顯示，主要為苯環(huán)結(jié)構(gòu)對抗病毒活性有影響，阻擋了非肽類小分子與CCR5的位點(diǎn)結(jié)合；抗病毒活性測試表明該產(chǎn)物有一定的抗病毒活性，可以作為一種潛在的CCR5拮抗劑.

目前，針對苯甲酰胺及六氫吡啶小分子拮抗劑的研究剛剛起步，這類非肽類小分子具有較好的抗病毒活性及生物結(jié)合性，可能在治療HIV-1領(lǐng)域內(nèi)具有潛在醫(yī)用價(jià)值.

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(責(zé)任編輯于敏)

Studyonthesynthesisandpropertiesofhexahydropyridinesmallmoleculecompounds

CHENGDejun,HUANGBin*

(DepartmentofMaterialsandChemicalEngineering,SichuanUniversityofScience&Engineering,Zigong643000,China)

ChemokinereceptorCCR5hasanimportantsignificanceforpharmacologywhenmediatedHIV-1goesintotheco-receptorinnormalcells.Itisnecessarytodevelopsmallmoleculeantagonistswithgoodpharmacokineticproperties,highselectivityandhighactivity,whichhasbecomeahotspot.Amongthesesmallmoleculeantagonists,benzamidenon-peptidesmallmoleculecompoundshaveattractedmoreresearchfocus.Inthiswork,N-ethyl-N-(4-hexahydropyriddine)-4-chlorobenzamide(intermediate4)wassynthesizedfrom4-piperidinone,and4-chlorobenzoxyyl-4-bromo-2-bromomethylbenzene(intermediate7)wassynthesizedfrom2-hydroxy-5-bromobenzaldehyde.FurthermoreanewHIV-1candidatecompoundN-ethyl-N-(N-(2-((p-chlorobenzoxyyl) -5-bromobenzyl)-4-hexahydropyridine)-4-chlorobenzamide(intermediate8)waspreparedbytheintermediate4and7.Inaddition,thecompoundswerecharacterizedby13CNMR,1HNMR,IRandMS.ThebiologicalactivitywasdetectedbytheCalciumFluxAssay,PBMCandSPAGTPγSAssay.Theseresultsindicatedtheproductshadhighlybiologicalactivity.

formamide;non-peptidesmallmoleculecompounds;hexahydropyridine

10.3969/j.issn.1000-2162.2016.02.014

2015-07-09

四川省教育廳科研項(xiàng)目(15ZB0215)；四川省自貢市重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014ZC01)

程德軍(1976-),男，四川仁壽人，四川理工學(xué)院講師，碩士; *黃斌(通信作者)，四川理工學(xué)院教授，E-mail:huangbin731026@126.com.

O621.3

A

1000-2162(2016)02-080-05