蔡巧青，江　麗，陳細(xì)英，陳丕績(jī)

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 深圳 518035；2深圳市第七人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518081)

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GSTM1和GSTP1基因多態(tài)性與卵巢癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

蔡巧青1，江麗1，陳細(xì)英1，陳丕績(jī)2

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 深圳 518035；2深圳市第七人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518081)

目的探討GSTM1和GSTP1基因多態(tài)性與卵巢癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。方法選擇2013年1月至2015年6月在北京大學(xué)深圳醫(yī)院確診為卵巢癌的手術(shù)患者124例為病例組，選取同時(shí)期來本院體檢的健康女性124例為對(duì)照組。于清晨抽取所有研究對(duì)象4mL外周靜脈血，用于multiplex-PCR和PCR-RFLP檢測(cè)研究對(duì)象的GSTM1和GSTP1基因的多態(tài)性，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果病例組GSTP1基因GG型分布頻率為28.2%，與健康對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.511，P<0.05),且GSTP1基因GG型可能會(huì)增加患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.259，95%CI：1.14～4.50，P<0.05)，攜帶GSTP1基因GG型患者患卵巢上皮性癌的比例明顯高于卵巢非上皮性癌(χ2=4.017，P<0.05)；而GSTM1各基因型分布與健康對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，且與卵巢癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)聯(lián)。結(jié)論GSTP1基因多態(tài)性與卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)聯(lián)，其GG型可能會(huì)增加卵巢上皮性癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；而GSTM1基因則與卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)。

卵巢癌；基因多態(tài)性；GSTP1基因；GSTM1基因；發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)

[Abstract]Objective To study the relationship between polymorphism of GSTM1 and GSTP1 genes and the risk of ovarian cancer. Methods Totally 124 patients with ovarian cancer identified in Peking University Shenzhen Hospital between January 2013 and June 2015 were selected in case group. At the same period 124 healthy females for physical examination in the hospital were selected in control group. In morning 4 mL peripheral venous blood was drawn from all cases for multiplex-PCR and PCR-RFLP to detect GSTM1 and GSTP1 gene polymorphism. Results were analyzed. Results The GG genotype frequency of GSTP1 gene in the case group was 28.2%, which was significantly different from that in the control group (χ2=5.511,P<0.05). And GG genotype of GSTP1 gene might increase the risk of ovarian cancer (OR=2.259，95%CI:1.14-4.50,P<0.05) . The cases carrying GG genotype had a higher proportion of developing ovarian epithelial neoplasms than non-epithelial ovarian cancer (χ2=4.017,P<0.05). However, the distribution of genotypes of GSTM1 was not significantly different from that of the control group (P>0.05), and there was no association with the risk of ovarian cancer. Conclusion There is a link between GSTP1 gene polymorphism and the risk of ovarian cancer, and GG genotypes may increase the risk of ovarian epithelial neoplasms. But GSTM1 gene is not associated with the risk of ovarian cancer.

[Key words]ovarian cancer；gene polymorphism；GSTP1；GSTM1； risk of occurrence

卵巢癌是嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌和宮頸癌，居第三位[1]。由于卵巢位于盆腔內(nèi)，發(fā)生癌變后早期不易觀察癥狀，待癌細(xì)胞發(fā)生擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移后才被發(fā)現(xiàn)。因此，70%以上的患者治療時(shí)已發(fā)展為卵巢癌晚期，也導(dǎo)致了其5年生存率極低[2]?；虻倪z傳變異與卵巢癌的發(fā)病有著密切的聯(lián)系。Ⅰ相代謝酶基因和Ⅱ相代謝酶基因是與腫瘤易感性相關(guān)的兩大類基因。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)作為人體重要的Ⅱ相代謝酶家族之一，存在于人體的許多組織中，具有較強(qiáng)的解毒作用，能保護(hù)細(xì)胞[3]。GSTs存在基因多態(tài)性，且會(huì)導(dǎo)致其酶活性發(fā)生改變，進(jìn)一步影響GSTs的解毒能力，增加了多種疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，如非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、肺癌等，并且對(duì)腫瘤患者治療后的生存也有影響。因此，本研究檢測(cè)卵巢癌患者的GSTM1和GSTP1基因多態(tài)性，探討GSTM1和GSTP1基因突變與卵巢癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，以期為卵巢癌的早期預(yù)防提供科學(xué)的診斷指標(biāo)。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2013年1月至2015年6月在北京大學(xué)深圳醫(yī)院確診為卵巢癌的手術(shù)患者124例為病例組，年齡為23～71歲，平均年齡(51.3±3.3)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)確診為卵巢癌患者；②無其他惡性腫瘤史；③未接受任何治療；④無年齡、病理類型及臨床分期的限制；⑤自愿參加本次研究。選取同時(shí)期來本院體檢的健康女性124例為對(duì)照組，年齡為22～69歲，平均年齡(50.7±4.3)歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：①無腫瘤病史；②與病例組無任何血緣關(guān)系；③自愿參加本次研究。納入的研究對(duì)象248例為我國廣東地區(qū)的漢族女性，本研究獲得所有研究對(duì)象及其監(jiān)護(hù)人的知情同意。

1.2方法

1.2.1資料分析

對(duì)所有卵巢癌患者的臨床資料(年齡、臨床表現(xiàn)、臨床病理分期及類型等)進(jìn)行分析。

1.2.2血液標(biāo)本采集

所有研究對(duì)象空腹12小時(shí)，于清晨抽取4mL外周靜脈血，經(jīng)EDTA.K2抗凝，于4小時(shí)內(nèi)保存于-80℃冰箱備用，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，1周內(nèi)集中提取DNA。

1.2.3 SNP測(cè)序

采用multiplex-PCR檢測(cè)GSTM1純合缺失。GSTM1基因分型：內(nèi)參照為擴(kuò)增白蛋白基因，GSTM1基因引物為20pmol，上游引物序列為5′-TTCCTTACTGGTCCTC-ACATCTC-3′，下游引物序列為5′-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3′。PCR反應(yīng)體系25μL，4×dNTP 3μL、10×buffer 2.5μL、MgCl2用量為3mmol/L、Taq DNA聚合酶1.5IU、DNA樣品1μL，上、下游引物各1μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5分鐘后、進(jìn)行35個(gè)循環(huán)(95℃ 45秒，62℃ 45秒，72℃ 45秒)、延伸7分鐘72℃。PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳基因型分析條件：含溴化乙啶2%瓊脂糖凝膠。

采用PCR-RFLP檢測(cè)GSTP1第303位堿基發(fā)生A→G突變。GSTP1基因分型：GSTP1基因引物為10pmol，上游引物序列為5′-ACGCACATCCTC2TTCCCCTC-3′，下游引物序列為5′-TACTTGGCTG2GTTGATGT2CC-3′。PCR反應(yīng)體系25μL，4×dNTP 2.0μL、10×buffer 2.5μL、MgCl2用量為2.5mmol/L、Taq DNA聚合酶1.0IU、DNA樣品0.5μL，上、下游引物各1μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2分鐘后，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)(94℃ 30秒，66℃ 30秒，72℃ 2分鐘)，最后72℃延伸5分鐘。取5μL PCR產(chǎn)物與0.5μL Alw 26I(10IU/μL)在37℃溫育2小時(shí)，限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物在含溴化乙啶的2.5%瓊脂糖凝膠電泳分析基因型。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所獲數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，基因型分布采用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，用比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(95%CI)表示風(fēng)險(xiǎn)度，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般資料的情況

本研究共采集了124例卵巢癌患者標(biāo)本，國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期：Ⅰ～Ⅱ級(jí)43例；Ⅲ～Ⅳ級(jí)81例；臨床表現(xiàn)：腹痛、腹脹104例，陰道不規(guī)則流血11例，排尿、排便困難9例；臨床病理類型：卵巢上皮性癌99例；卵巢非上皮性癌25例，見表1。

2.2 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果情況

GSTM1基因型判斷：PCR擴(kuò)增后，白蛋白基因產(chǎn)生350bp片段，GSTM1基因非缺失型(+)產(chǎn)生219bp片段；而GSTM1基因缺失型(-)無相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，見圖1A。

GSTP1基因型判斷：野生型(AA)為1個(gè)片段，440bp；純合突變型(GG)為2個(gè)片段，227bp和213bp；突變雜合型(AG)為3個(gè)片段，440bp、227bp和213bp。由于227bp和213bp這2個(gè)片段長度接近，所以在2.5%瓊脂糖凝膠中無法分開，但不影響結(jié)果判斷，在電泳圖譜上GG型可看到1條帶，AG型可看到2條帶，見圖1B。

變量病例組(n=124)對(duì)照組(n=124)χ2/tP平均年齡51.3±3.350.7±4.31.233>0.05月經(jīng)初潮年齡16.4±1.616.1±1.51.523>0.05妊娠0.261>0.05 0～3次58(46.8)54(43.5) >3次66(53.2)70(56.5)絕經(jīng)狀態(tài)0.261>0.05 是71(57.3)67(54.0) 否53(42.7)57(46.0)臨床病理分期 Ⅰ、Ⅱ級(jí)43(34.7)- Ⅲ、Ⅳ級(jí)81(65.3)-臨床表現(xiàn)- 腹痛、腹脹104(83.9) 陰道不規(guī)則流血11(8.9)- 排尿、排便困難9(7.2)-臨床病理類型 卵巢上皮性癌99(79.8)- 卵巢非上皮性癌25(20.2)-

注：A為GSTM1基因電泳圖；B為GSTP1基因電泳圖

圖1GSTM1和GSTP1的酶切產(chǎn)物

Fig.1Enzyme digestion products of GSTM1 and GSTP1

2.3 GSTM1和GSTP1多態(tài)性基因型和等位基因頻率以及與卵巢癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的情況

在124例晚期卵巢癌病例中，經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)證實(shí)GSTM1和GSTP1基因型分布符合遺傳平衡定律。經(jīng)非連續(xù)性χ2檢驗(yàn)，病例組和對(duì)照組GSTM1不同基因型頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.797，P>0.05)。病例組GSTP1基因GG型的分布頻率為28.2%，與健康對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.511，P<0.05)，提示等位基因G為危險(xiǎn)基因，GSTP1基因GG型可能會(huì)增加患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.259，95%CI：1.14～4.50，P<0.05)，見表2。

表2　GSTM1/GSTT1/GSTP1多態(tài)性基因型和等位基因頻率以及與卵巢癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的比較[n(%)]

注：*每對(duì)基因型含有2個(gè)等位基因，分母為248。

2.4 GSTM1和GSTP1多態(tài)性與卵巢癌易感性的分層分析

GSTM1基因的GSTM1(+)型患者罹患卵巢癌的比例與GSTM1(-)型患者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.797，P>0.05)，且攜帶GSTM1(+)基因型和GSTM1(-)基因型患者患上皮性癌的比例與患卵巢非上皮性癌相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.344，P>0.05)；攜帶GSTP1基因GG型患者患卵巢上皮性癌的比例明顯高于GSTP1基因AA基因型患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.660，P<0.05)，且GG型患者患卵巢上皮性癌的比例高于卵巢非上皮性癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.017，P<0.05)，見表3。

表3　　GSTM1和GSTP1多態(tài)性和卵巢癌易感性的分層分析[n(%)]

3討論

3.1谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因多態(tài)性

GSTs存在于人體的許多組織中，作為人體重要的毒物代謝酶之一，具有較強(qiáng)的解毒作用，能清除多種毒性物質(zhì)[4]。GSTs的基因多態(tài)性影響了其酶活性在人體中的表達(dá)，當(dāng)酶活性發(fā)生改變時(shí)，GSTs的解毒能力也會(huì)發(fā)生改變，增加了特定腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[5]。Ebrahimkhani等[6]發(fā)現(xiàn)GSTT1基因缺失型會(huì)增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，且危險(xiǎn)因素—吸煙和相關(guān)代謝酶多態(tài)性的聯(lián)合作用也會(huì)增加罹患結(jié)直腸癌的可能性。Jiang等[7]在研究中也指出GSTT1和GSTM1基因多態(tài)性與肺癌易感性有關(guān)。

3.2谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因多態(tài)性與腫瘤的相關(guān)性

GSTs家族成員GSTM1、GSTT1和GSTP1基因具有多態(tài)性，已有研究證實(shí)，GSTT1(-)可能會(huì)增加卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。GSTM1基因發(fā)生突變后，酶活性會(huì)降低甚至是完全喪失活性[8]。GSTP1基因第303位堿基發(fā)生A→G突變后酶活性降低，且不同基因型的酶活性也有差異，其中野生型(GG)表達(dá)的酶活性最低，對(duì)毒性物質(zhì)的清除能力也最低，增加了多種疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[9]，如非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、食管癌、急性髓系白血病等。已有大量研究[10-13]證實(shí)，GSTM1和GSTP1基因多態(tài)性增加多種腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，原因在于GSTs可以保護(hù)正常細(xì)胞免受親電子致癌物的侵襲，而GSTs多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致此能力下降，攜帶GSTM1和GSTT1基因缺失型以及GSTP1變異基因型者罹患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)增加。

3.3 GSTM1/GSTP1基因多態(tài)性與卵巢癌的相關(guān)性

目前鮮有關(guān)于GSTM1、GSTP1基因多態(tài)性與卵巢癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的研究。因此，本課題研究了GSTM1和GSTP1基因多態(tài)性對(duì)卵巢癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，病例組GSTP1基因GG型基因頻率顯著高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示攜帶GG基因型的個(gè)體患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)可能會(huì)增加，作用機(jī)制是GSTP1基因發(fā)生突變，導(dǎo)致攜帶GG型的患者酶活性顯著降低，不能及時(shí)清理毒性物質(zhì)，增加了患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)。石秀娥等[12]的研究也表明，急性髓系白血病患者的GSTP1基因GG型基因頻率低于健康人群。本研究還發(fā)現(xiàn)GSTP1基因GG型主要增加患卵巢上皮性癌的風(fēng)險(xiǎn)，與卵巢非上皮性癌無明顯關(guān)系。

本研究未發(fā)現(xiàn)GSTM1基因多態(tài)性與卵巢癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。Tecza等[14]的研究顯示GSTM1(-)基因型對(duì)卵巢癌具有保護(hù)作用。GSTM1多態(tài)性與卵巢癌易感性的研究結(jié)果存在很大的差異，造成此種現(xiàn)象的原因可能是地區(qū)和種族不同。本研究納入對(duì)象僅為廣東地區(qū)漢族女性，結(jié)果顯示GSTM1多態(tài)性與卵巢癌的易感性無關(guān)，而GSTP1基因GG型會(huì)增加罹患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是卵巢上皮性癌。其說明了GSTP1多態(tài)性可能會(huì)增加我國廣東地區(qū)漢族女性罹患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)。

3.4結(jié)論與展望

目前，國際上有關(guān)GSTs基因多態(tài)性與卵巢癌易感性的研究主要以白種人為研究對(duì)象，與其他特異性人種的研究甚少。因此，在亞洲人種中GSTs基因多態(tài)性與卵巢癌的相關(guān)性需要行進(jìn)一步研究。

綜上所述可以得出以下結(jié)論：GSTP1基因GG型可能會(huì)增加患卵巢上皮性癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本研究在臨床具較強(qiáng)的可行性，其結(jié)果也有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值，且患者1次基因分型終身收益。但本研究樣本量偏小，結(jié)果仍需在大樣本量、多地區(qū)、多民族、多基因人群中進(jìn)行重復(fù)研究和驗(yàn)證。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：楊筱鳳]

Correlation between polymorphisms of GSTM1 and GSTP1 genes and risk of ovarian cancer

CAI Qiao-qing1, JIANG Li1, CHEN Xi-ying1, CHEN Pi-ji2

(1.Department of Gynecology and Obstetrics,Peking University Shenzhen Hospital, Guangdong Shenzhen 518035, China;2.Shenzhen Seventh People’s Hospital, Guangdong Shenzhen 518081, China)

2016-03-06

蔡巧青(1983-)，女，主管護(hù)師，主要從事產(chǎn)科護(hù)理工作。

陳丕績(jī)，副主任技師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.08.010

R737.31

A

1673-5293(2016)08-0933-04