吳轉(zhuǎn)娣，劉新龍，劉家勇，昝逢剛，趙培方，林秀琴，陳學(xué)寬，蘇火生，劉洪博，吳才文

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南開遠(yuǎn) 661699）

甘蔗獨(dú)腳金內(nèi)酯生物合成基因ScCCD8的克隆與表達(dá)分析

吳轉(zhuǎn)娣，劉新龍，劉家勇，昝逢剛，趙培方，林秀琴，陳學(xué)寬，蘇火生，劉洪博，吳才文

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南開遠(yuǎn) 661699）

【目的】克隆甘蔗的ScCCD8，分析其序列特征并預(yù)測(cè)其功能，研究在甘蔗不同組織部位、不同脅迫處理?xiàng)l件以及不同生長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)ScCCD8的表達(dá)情況，為該基因在甘蔗基因工程育種中的應(yīng)用提供理論支撐?！痉椒ā恳訬CBI中檢索的甘蔗CCD8同源片段EST序列為模板設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增甘蔗CCD8的片段，采用RACE和RT-PCR技術(shù)分別從甘蔗品種新臺(tái)糖22號(hào)中克隆CCD8的5′、3′目的片段和全長(zhǎng)cDNA序列，以生物信息學(xué)方法對(duì)序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，利用qRT-PCR方法分析CCD8在不同組織、不同逆境脅迫條件下和不同生長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)特性?！窘Y(jié)果】克隆獲得甘蔗CCD8，命名為ScCCD8，GenBank登錄號(hào)為KP742973.1。該cDNA全長(zhǎng)2 016 bp，含有1個(gè)1 623 bp的完整開放閱讀框（ORF），編碼540個(gè)氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)分子量為59.534 kD。生物信息學(xué)分析表明ScCCD8編碼的蛋白是定位于葉綠體上的非分泌性蛋白，不是典型的跨膜蛋白，沒(méi)有信號(hào)肽位點(diǎn)。存在著多個(gè)糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)等活性位點(diǎn)。序列分析表明，ScCCD8與其他植物的CCD8蛋白有很高的相似性。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，甘蔗ScCCD8與高粱的CCD8蛋白親緣關(guān)系較近。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析表明，ScCCD8的表達(dá)具有組織特異性，在根中的表達(dá)量最高，是老葉中表達(dá)量的18倍。其在模擬重度干旱脅迫（20% PEG）、鹽脅迫（200 mmol·L-1NaCl）、磷缺乏（1/8 mmol·L-1）和營(yíng)養(yǎng)缺乏（純水培養(yǎng)）4種脅迫處理下，莖尖中的ScCCD8均被誘導(dǎo)表達(dá)，且在處理24 h以后，ScCCD8的表達(dá)量增加較為明顯。在不同生長(zhǎng)時(shí)期，ScCCD8在甘蔗不同生長(zhǎng)時(shí)期的莖尖中均有表達(dá)，且在幼苗期的表達(dá)量高于萌芽期和分蘗期?！窘Y(jié)論】從甘蔗品種ROC22中克隆獲得的甘蔗獨(dú)腳金內(nèi)酯生物合成關(guān)鍵基因ScCCD8是CCD8基因家族成員，推測(cè)ScCCD8可能與甘蔗SLs響應(yīng)逆境脅迫有關(guān)。

甘蔗；ScCCD8；獨(dú)腳金內(nèi)酯；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；干旱脅迫

0　引言

【研究意義】獨(dú)角金內(nèi)酯（strigolactones，SLs）是MAX/RMS/D途徑產(chǎn)生的一種控制植物分枝的新激素［1-3］，抑制植物分枝生長(zhǎng)［2-4］，控制中胚軸伸長(zhǎng)［5］，促進(jìn)側(cè)根形成和誘導(dǎo)根毛伸長(zhǎng)等［6-8］。SLs與生長(zhǎng)素（Auxins）相互作用進(jìn)而抑制側(cè)芽的生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)素是通過(guò)調(diào)節(jié)CCD8而促進(jìn)SLs生物合成，最終抑制側(cè)芽的生長(zhǎng)［9-11］。分蘗是決定甘蔗（Saccharum spp.）有效莖數(shù)和產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一，甘蔗作為最重要的糖料作物，研究其分蘗具有重要的實(shí)踐與理論意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】CCD8是獨(dú)腳金內(nèi)酯生物合成途徑中的第三個(gè)酶，主要負(fù)責(zé)合成一種與SLs結(jié)構(gòu)相似的可移動(dòng)的前體--己內(nèi)酯［12］，目前，已經(jīng)從擬南芥［13］、水稻［9］中分離編碼CCD8的同源基因MAX4、D10等。HARRISON等［14］通過(guò)體外酶抑制試驗(yàn)表明，植物分蘗表型的改變很可能是通過(guò)抑制 CCD8的酶活性進(jìn)而抑制SLs生物合成途徑而實(shí)現(xiàn)的，而非D27 或CCD7，因此，CCD8被認(rèn)為是SLs調(diào)節(jié)植物分蘗作用中的關(guān)鍵酶。甘蔗CCD8功能的研究將為甘蔗的分蘗調(diào)控研究提供重要理論基礎(chǔ)。SLs能通過(guò)抑制腋芽的生長(zhǎng)來(lái)抑制分枝，與生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素相互作用，共同調(diào)控植物分枝的發(fā)育［10，15］，最終影響植株分枝形態(tài)的建成［16-17］。SLs能夠調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的資源分配，能保持磷和氮的平衡，在不良環(huán)境條件下，能改變植物的生長(zhǎng)方式，使植物中的資源流向特定的組織，以達(dá)到長(zhǎng)期生存的目的。通過(guò)大量的矮化多分蘗突變體的分離鑒定、相關(guān)基因的克隆、表達(dá)調(diào)控模式分析及功能解析，植物SLs生物合成、運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和降解途徑的研究取得了許多重大的研究成果［12，18-21］。CCD8是ARITE等［22］以d10多分蘗突變體材料通過(guò)圖位克隆的方法分離出來(lái)的，是MAX4/RMS1/DAD1/ D10的同源基因，編碼類胡蘿卜素裂解雙加氧酶 CCD8。利用 RNAi干擾獼猴桃AcCCD8，導(dǎo)致AcCCD8表達(dá)量減少，分枝增多并延遲了葉片的衰老［23］。西紅柿 SICCD8沉默后表現(xiàn)出分枝、節(jié)點(diǎn)、不定根增多，矮化，花小，果實(shí)小，且種子細(xì)少等［24］。因此，CCD8可能不僅與 SLs的生物合成有關(guān)，還參與或影響其他的生物學(xué)通路而影響植物的生殖發(fā)育［24］。多種植物的CCD8都在根中高表達(dá)［22-28］。在擬南芥中，CCD8（MAX4）在根尖、成熟花的氣孔和長(zhǎng)角果中高表達(dá)，在芽中沒(méi)有表達(dá)［13，29］。這些基因差異表達(dá)的原因還未知，推測(cè)其也可能參與其他的信號(hào)通路［30］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】CCD8在植物分蘗及生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段起重要的調(diào)控作用，但目前關(guān)于甘蔗獨(dú)腳金內(nèi)酯生物合成相關(guān)基因的研究仍鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究利用同源克隆的方法獲得了甘蔗獨(dú)腳金內(nèi)酯生物合成關(guān)鍵基因ScCCD8的cDNA全長(zhǎng)序列，利用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)ScCCD8的功能，并以qRT-PCR分析 ScCCD8在不同組織、不同脅迫處理?xiàng)l件下和不同生長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)模式，以期為研究 ScCCD8在甘蔗 SLs生物合成過(guò)程中的作用及其參與甘蔗分蘗調(diào)控響應(yīng)逆境脅迫的作用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

選用中國(guó)蔗區(qū)的主栽品種之一 ROC22為材料，選取處于分蘗期的甘蔗莖尖作為研究材料，提取總RNA。甘蔗材料由云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2材料處理

大田中選取生長(zhǎng)健壯并長(zhǎng)勢(shì)一致的 ROC22蔗莖，砍成單芽莖段，洗凈并 52℃溫水脫毒處理 30 min。溫室中以45 d的甘蔗幼苗為材料，分別給予6種處理，（以10%（w/v）PEG6000的MS培養(yǎng)基處理）中度干旱、（以 20%（w/v）PEG6000的 MS培養(yǎng)基處理）重度干旱、（以200 mmol·L-1NaCl的MS培養(yǎng)基處理）中度鹽脅迫、（以300 mmol·L-1NaCl 的MS培養(yǎng)基處理）重度鹽脅迫、（1/8 mmol·L-1）磷缺乏、（純水培養(yǎng)）營(yíng)養(yǎng)缺乏，以不同時(shí)間段0 h（對(duì)照）、6、12、24、48、72和96 h取樣，以莖尖作為材料，取樣后，液氮速凍，并于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2014年7月2日，在云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室溫室大棚中，以甘蔗渣和紅壤土作為營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，在種植桶中栽種經(jīng)溫水脫毒處理的甘蔗莖段材料，栽種30 d內(nèi)蓋膜處理，于不同時(shí)間段取樣（7、14、30、45、60、90和120 d），以莖尖作為材料，液氮冷凍，并于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3甘蔗ScCCD8的EST克隆

以甘蔗莖尖分生組織為材料，提取總RNA，方法參照TaKaRa公司RNA Plant Kit試劑盒說(shuō)明書操作，用NanoDrop法測(cè)定RNA的濃度，根據(jù)OD260/ OD280及 OD260/OD230評(píng)估 RNA的質(zhì)量，并以瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果檢測(cè)RNA的完整性，以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，于-70℃貯存?zhèn)溆?。? μg莖尖總RNA用于cDNA的合成，方法按照TaKaRa公司的RNA PCR Kit試劑盒說(shuō)明書操作，使用隨機(jī)引物olig（dT）18。

以 NCBI檢索的甘蔗 ScCCD8的 EST序列（CA191025.1和CA100587.1），以DNAMAN軟件分析并拼接2個(gè)片段。設(shè)計(jì)1對(duì)引物ScCCD8EST-F 和ScCCD8EST-R（表1），由生工生物公司合成。

以cDNA第一鏈為模板，PCR條件為94℃ 3 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 45 s，32個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并以TaKaRa公司的凝膠回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增的條帶進(jìn)行回收、純化，并連接到pEASYTM-T5 Zero-Vector載體中，轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌中，陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR鑒定后，送上海生工測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)分析。

1.4ScCCD8 5′端和3′端的克隆

3′RACE和5′RACE均按SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。根據(jù)已得到的cDNA片段序列設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增目的基因的3′和5′末端?；厥?、測(cè)序、比對(duì)方法同1.3，測(cè)序結(jié)果用DNAMAN 6.0對(duì)測(cè)序結(jié)果與已知EST序列進(jìn)行迸接。

以 1.2中保存的 cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物ScCCD8F和ScCCD8R（表1），擴(kuò)增ScCCD8的編碼區(qū)序列，擴(kuò)增條件為94℃ 3 min；94℃ 30 s，57℃30 s，72℃ 45 s，32個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。回收、測(cè)序、比對(duì)方法同1.3。

1.5ScCCD8的生物信息學(xué)分析

采用NCBI平臺(tái)對(duì)甘蔗ScCCD8進(jìn)行BLAST同源比對(duì)分析，使用ORF Finer在線工具尋找編碼框，將目的片段序列與其他物種的 CCD8核苷酸序列在DNAMAN進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)開放閱讀框（ORF）分析并進(jìn)行氨基酸BLAST比對(duì)，利用Clustal W軟件進(jìn)行多序列對(duì)齊和排序，用MEGA5.0構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用ProtParam（http://web.expasy.ory/ProtParam/）軟件對(duì)蛋白序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)蛋白的分子量和等電點(diǎn)；利用ProtScale進(jìn)行蛋白質(zhì)疏水性分析；Motif Scan分析蛋白質(zhì)生物活性位點(diǎn)分析；TMHMM Sever2.0（http：// www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/）分析蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；SignalP4.1（http：//www. cbs. dtu. dk/services/ SignalP/）分析蛋白的信號(hào)肽；wolf PSORT（http：//wolfpsort.seq. cbrc. jp/）預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位；使用SOPMA軟件預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；使用NCBI平臺(tái)對(duì)進(jìn)行BLAST同源比對(duì)分析，用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；分別運(yùn)用NetPhos 2.0Serve、DictyOGlyc 1.1 Server 在線軟件預(yù)測(cè)ScCCD8翻譯后磷酸化、O-糖基化修飾情況。

1.6ScCCD8在甘蔗不同組織部位的表達(dá)分析

根據(jù)ScCCD8序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，以GAPDH作為內(nèi)參基因［31］。選用 TaKaRa公司的PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，定量PCR體系為20 μL，包括DNA模板（50 mg·μL-1）2 μL、SYBR?Premix Ex TaqII（Tli RNaseH Plus）（2×）10.0 μL、上下游引物（10 μmol·L-1）0.8 μL、ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL和H2O 6 μL，3次重復(fù)。采用兩步法PCR擴(kuò)增：95℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s；60℃ 1 min；95℃ 15 s。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，在ABI Vii7 Real time PCR System（Applied Biosystems，USA）上進(jìn)行試驗(yàn)。利用2-ΔΔCT法計(jì)算ScCCD8的相對(duì)表達(dá)量。

表1　CCD8的PCR引物序列Table 1 Primers used for the CCD8 gene amplification

2　結(jié)果

2.1甘蔗ScCCD8的cDNA全長(zhǎng)序列

如圖1所示，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為481 bp的甘蔗ScCCD8的EST片段；3′RACE獲得的產(chǎn)物為567 bp；5′RACE獲得一條長(zhǎng)度為1 667 bp的5′端序列。通過(guò)將中間片段、3′RNAC序列和5′端序列拼接，得到全長(zhǎng)為2 016 bp的甘蔗CCD8全長(zhǎng)cDNA序列，預(yù)測(cè)其ORF框（圖2），并設(shè)計(jì)上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的編碼區(qū)序列長(zhǎng)度為1 623 bp。甘蔗CCD8全長(zhǎng)2 016 bp，包含一個(gè)35 bp的5′非翻譯區(qū)和一個(gè)358 bp的3′非翻譯區(qū)，以及一個(gè)1 623 bp的編碼540個(gè)氨基酸的開放閱讀框，命名為 ScCCD8，GenBank登錄號(hào)為KP742973.1。

圖1　甘蔗ScCCD8的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR amplification of sugarcane ScCCD8

2.2甘蔗ScCCD8的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)分析ORF框并進(jìn)行氨基酸BLAST比對(duì)，甘蔗ScCCD8與其他物種的CCD8的氨基酸序列同源性與核苷酸序列相似，特別是與禾本科植物的同源性均高達(dá)80%以上（圖3），與高粱（XM_002458432.1）和玉米（NM_001197000.1）的氨基酸序列相似性達(dá)到 97%，與谷子（XM_012846216.1）、水稻（NM_ 001050764.2）和二穗短柄草（XM_003569750.3）的相似性分別高達(dá)96%、96%和89%。與其他雙子葉植物如小果野芭蕉（XM_009391093.1）、海棗（XM_008806408.1）、油棕（XM_010919038.1）、梅（XM_008221883.1）、碧桃（XM_007222324.1）分別為88%、88%、78%、79%和79%。結(jié)果表明，不同植物的 CCD8蛋白結(jié)構(gòu)與功能高度保守，甘蔗ScCCD8與其他單子葉或雙子葉植物可能具有較相似的功能。

圖2　ScCCD8的編碼區(qū)序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and predicted amino acid sequences of ScCCD8

在NCBI上篩選出與甘蔗ScCCD8氨基酸序列相似性較高的17個(gè)物種的CCD8蛋白，并進(jìn)行多序列比對(duì)。結(jié)果顯示，甘蔗ScCCD8的氨基酸序列與其他氨基酸序列有高度的保守性，特別是可變結(jié)構(gòu)域、糖基化位點(diǎn)及磷酸化位點(diǎn)等重要功能位點(diǎn)的序列保守性更高。利用 MEGA5.0構(gòu)建甘蔗與其他 17個(gè)物種的NJ進(jìn)化樹（圖4）顯示具有相同種屬關(guān)系的物種被聚為一類?？傮w上，甘蔗ScCCD8的氨基酸序列與山羊草、水稻和二穗短柄草的親緣關(guān)系最近，與高粱、玉米和谷子的親緣關(guān)系較近，與柚、甜橙、海棗、野菊花、蘋果、煙草和秋海棠等雙子葉植物的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

2.3甘蔗ScCCD8的生物學(xué)信息學(xué)分析

2.3.1ScCCD8蛋白質(zhì)特征分析 經(jīng)生物學(xué)信息學(xué)在線軟件ProtParam分析甘蔗ScCCD8的蛋白質(zhì)特性，結(jié)果表明，ScCCD8所編碼的蛋白分子式為C2652H4093N737O781S23，分子量為59.534 kD，等電點(diǎn)為6.00，Ala、Gly、Val、Leu 4個(gè)氨基酸出現(xiàn)頻率較高，分別為8.9%、9.3%、8.1%和8.2%，而另一些氨基酸如Pyl、Sec在氨基酸序列中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。穩(wěn)定性系數(shù)為43.44，為不穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)＜40 是穩(wěn)定蛋白，＞40是不穩(wěn)定蛋白），總平均親水性（GRAVY）為-0.277，為親水蛋白（蛋白質(zhì)親水區(qū)域多于疏水區(qū)域）。無(wú)信號(hào)肽位點(diǎn)（圖5），沒(méi)有跨膜區(qū)，不是跨膜蛋白。wolf PSORT預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位于葉綠體中。

使用SOPMA軟件預(yù)測(cè)ScCCD8蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖6），該蛋白α-螺旋（h）占25.93%、β-折疊（e）占22.78%、β-轉(zhuǎn)角（t）占10.19%和無(wú)規(guī)則卷曲（c）41.11%。結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的大部分由無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成，α-螺旋在N端與中部所占比例較大，β-轉(zhuǎn)角則主要在中部和前部，延伸鏈主要集中在中部及C端，無(wú)規(guī)則卷曲的分布則比較平均（圖6）。

圖3　ScCCD8與其他作物同源蛋白的序列分析結(jié)果Fig.3 Sequence alignment of amino acid residues of ScCCD8 with other related proteins

作為蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動(dòng)力，蛋白質(zhì)的親水、疏水氨基酸的組成能夠影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和特性，經(jīng)在線軟件ProtScale采用Hyhob/Kyte & Doolittle的方法分析（圖7）顯示，第358位具有最高分值為1.922，疏水性最強(qiáng)；第 349位最低分值，為-3.067，親水性最強(qiáng)。整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性，沒(méi)有特別明顯的疏水區(qū)或親水區(qū)，總體上親水區(qū)多于疏水區(qū)，故推測(cè)甘蔗ScCCD8蛋白是一種親水蛋白。

2.3.2ScCCD8蛋白的生物活性位點(diǎn)分析 蛋白質(zhì)的修飾方式主要包括蛋白質(zhì)的磷酸化和糖基化，它可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活力和功能。運(yùn)用DictyOGlyc 1.1 Server 和NetPhos 2.0 Server在線軟件預(yù)測(cè)ScCCD8翻譯后磷酸化、O-糖基化修飾情況，結(jié)果顯示ScCCD8蛋白有可能發(fā)生磷酸化修飾的位點(diǎn)有 30個(gè)，其中色氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）可能發(fā)生磷酸化修飾的位點(diǎn)分別有13、9和8個(gè)（圖8）；有可能發(fā)生 O-糖基化修飾的位點(diǎn)有 4個(gè)，均為蘇氨酸（Thr），分別在肽鏈的第2、第23、第25、第27位（圖 9）。磷酸化位點(diǎn)分布都較為平均，糖基化位點(diǎn)則主要分布在N端。

圖4　不同物種CCD8氨基酸序列的聚類分析Fig.4 Clustering analysis of the deduced amino acid sequences of CCD8 with homologous among sugarcane and other plants

圖5　ScCCD8蛋白的信號(hào)肽分析Fig.5 Signal peptide analysis of ScCCD8 protein

圖6　SOPMA軟件預(yù)測(cè)ScCCD8蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 Secondary structure analysis of ScCCD8 protein

圖7　ScCCD8蛋白的親水性/疏水性預(yù)測(cè)Fig.7 Hydrophobicity/ hydrophilicity prediction of ScCCD8

圖8　ScCCD8蛋白氨基酸序列翻譯后磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.8 Prediction of phosphorylation site modification in amino acid sequence of ScCCD8 protein

利用Motif Scan分析蛋白質(zhì)生物活性位點(diǎn)，結(jié)果表明，該蛋白序列含有：1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分別位于367—370氨基酸段；10個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，分別為50—53、112—115、168—171、227—230、369—372、383—386、410—413、454—457、497—500 和512—515氨基酸段；10個(gè)N-肉豆蔻酰化作用位點(diǎn)，分別位于47—52、158—163、166—171、217—222、402—407、420—425、470—475、490—495、501—506和528—533氨基酸段；7個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)分別位于 59—61、112—114、191—193、212—214、324—326、462—464和497—499氨基酸段；1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，位于249—257氨基酸段；1個(gè)酰胺化位點(diǎn)，位于461—434。

2.4ScCCD8在甘蔗不同組織部位和脅迫誘導(dǎo)中的表達(dá)分析

提取甘蔗不同組織來(lái)源的總 RNA，以甘蔗的GAPDH作為內(nèi)參，對(duì)ScCCD8進(jìn)行qRT-PCR分析（圖10），結(jié)果表明，甘蔗ScCCD8在各器官中的表達(dá)量差異比較大，在甘蔗的根尖、分蘗芽、腋芽、莖尖的表達(dá)量相對(duì)較高，老根、嫩葉（距莖尖分生組織處約5 cm）、老葉（第四葉中段）、節(jié)（第五節(jié)）和葉鞘中的表達(dá)量相對(duì)較少。莖尖中的表達(dá)量是老葉中的18倍左右，因此可以說(shuō)ScCCD8在甘蔗中的表達(dá)有較高的組織特異性，且主要是在甘蔗的幼嫩組織中強(qiáng)表達(dá)。

圖9　ScCCD8蛋白氨基酸序列翻譯后O-糖基化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.9 Prediction of O-glycosylation site modification in amino acid sequence of ScCCD8 protein

圖10　甘蔗不同組織ScCCD8的qRT-PCR分析Fig.10 Expression analysis of ScCCD8 gene in different sugarcane tissues by qRT-PCR

溫室中以45 d的甘蔗幼苗為材料，分別給予4種處理，3個(gè)重復(fù)，（以10%（w/v）PEG6000的MS培養(yǎng)基處理）干旱、（以200 mmol·L-1NaCl的MS培養(yǎng)基處理）鹽脅迫、（1/8 mmol·L-1）磷缺乏、（純水培養(yǎng)）營(yíng)養(yǎng)缺乏，以不同時(shí)間段0 h（對(duì)照）、6、12、24、48、72和96 h取樣，以莖尖作為材料，提取總RNA，對(duì)ScCCD8進(jìn)行qRT-PCR分析（圖11），結(jié)果表明，在不同脅迫條件下，ScCCD8能夠響應(yīng)逆境的脅迫，在處理24 h以后ScCCD8的表達(dá)量的增加較為明顯。結(jié)果表明，在甘蔗莖尖中的ScCCD8受到脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。

利用qRT-PCR技術(shù)分析甘蔗莖尖ScCCD8從7 月2日栽種到至11月份進(jìn)入分蘗期之間不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量，以甘蔗莖尖作為材料，均設(shè)6個(gè)重復(fù)，其中3個(gè)為溫室中的桶栽試驗(yàn)，另外3個(gè)為大田栽種的試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因在甘蔗在不同生長(zhǎng)時(shí)期的莖尖中均有表達(dá)，且在幼苗期的表達(dá)量高于萌芽期和分蘗期（圖12），結(jié)果表明，在不同生長(zhǎng)時(shí)期，ScCCD8的表達(dá)量存在差異。

圖11　甘蔗不同脅迫條件下ScCCD8的qRT-PCR分析Fig.11 Expression analyses of ScCCD8 gene under different stressed conditions by qRT-PCR

圖12　甘蔗不同生長(zhǎng)時(shí)期ScCCD8的qRT-PCR分析Fig.12 Expression analyses of ScCCD8 gene at different stages of terminal by qRT-PCR

3　討論

CCD8參與獨(dú)腳金內(nèi)酯的生物合成，CCD8的轉(zhuǎn)錄是調(diào)節(jié)分枝抑制通路的關(guān)鍵步驟［22］，它可能在生長(zhǎng)素反饋調(diào)控獨(dú)角金內(nèi)酯及其衍生物的過(guò)程中有重要作用［32］，另外，SLs也是通過(guò)與生長(zhǎng)素的交叉應(yīng)答，抑制生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸能力來(lái)抑制側(cè)芽生長(zhǎng)［33］。因此，CCD8可能是在其他植物激素的共同作用下調(diào)控 SLs生物合成并最終影響植物分枝的關(guān)鍵基因。

本研究從甘蔗主栽品種 ROC22中克隆獲得與甘蔗分蘗相關(guān)的基因 ScCCD8，該基因序列全長(zhǎng) 2 016 bp，其開放閱讀框?yàn)? 623 bp，編碼540個(gè)氨基酸，ScCCD8可能定位于葉綠體中［21］。通過(guò)同源性分析和進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，甘蔗ScCCD8的氨基酸序列與高粱、玉米、谷子和水稻等禾本科植物的同源性比較高，與小果野芭蕉、海棗、油棕、梅、碧桃和甜橙等雙子葉植物的同源性也達(dá)到80%左右，經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析 表明分離獲得的ScCCD8是CCD8在甘蔗中的同系物，且氨基酸序列具有較高的保守性，推測(cè)這些基因在功能上可能高度相似。

ScCCD8是甘蔗合成獨(dú)腳金內(nèi)酯所必需的，其具有較高的組織特異性，主要是在幼嫩分生組織處表達(dá)，在根尖的表達(dá)量最高，其次是莖尖、分蘗芽和腋芽，而在老葉、老根和節(jié)等部位的表達(dá)量相對(duì)低。在受到非生物脅迫的情況下，該基因在甘蔗莖尖的表達(dá)受到脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，表明該基因與甘蔗非生物脅迫的響應(yīng)有關(guān)。ScCCD8在不同生長(zhǎng)時(shí)期的甘蔗莖尖中的表達(dá)量分析表明它在甘蔗生長(zhǎng)過(guò)程中存在差異表達(dá)。

水稻CCD8是一個(gè)定位于葉綠體中的蛋白質(zhì)，在甘蔗中的ScCCD8通過(guò)在線分析表明其同樣定位于葉綠體［21，34］，該推斷還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

參與甘蔗獨(dú)腳金內(nèi)酯生物合成基因的其他基因，如D27、CCD7、MAX1以及相關(guān)的調(diào)控因子的研究還相對(duì)較少，作者已經(jīng)從甘蔗中克隆獲得了這些基因的cDNA全長(zhǎng)序列，下一步將會(huì)結(jié)合 ScCCD8，進(jìn)一步開展基因功能的鑒定和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面的研究，深入研究甘蔗獨(dú)腳金內(nèi)酯的生物合成基因與甘蔗逆境脅迫的關(guān)系，為進(jìn)一步了解SLs調(diào)控植物分蘗的作用機(jī)制研究提供新的線索。

4　結(jié)論

獲得甘蔗獨(dú)腳金內(nèi)酯生物合成基因ScCCD8的全長(zhǎng)cDNA。ScCCD8蛋白具有CCD8家族的一般特性。該基因全長(zhǎng)2 016 bp，ORF框?yàn)? 623 bp，編碼540個(gè)氨基酸，ScCCD8定位于葉綠體上的非分泌性蛋白，不是典型的跨膜蛋白，還存在著糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)等活性位點(diǎn)，ScCCD8在不同部位的表達(dá)具有組織特異性，在非生物脅迫作用下被誘導(dǎo)表達(dá)。在不同生長(zhǎng)時(shí)期ScCCD8的表達(dá)存在差異，推測(cè)ScCCD8可能參與了甘蔗的非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Cloning and Expression Analysis of Strigolactones Biosynthesis-Related Gene ScCCD8 in Sugarcane

WU Zhuan-di，LIU Xin-long，LIU Jia-yong，ZAN Feng-gang，ZHAO Pei-fang，LIN Xiu-qin，CHEN Xue-kuan，SU Huo-sheng，LIU Hong-bo，WU Cai-wen
（Sugarcane Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement，Kaiyuan 661699，Yunnan）

【Objective】The gene of Carotenoid Cleavage Dioxygenase8 （CCD8） from sugarcane （Saccharum officinarum L.）was cloned，then the sequence signature and functions were investigated，furthermore the gene expression in different tissues，different abiotic stresses and different growth times were analyzed. The objectives of the present study were to provide theoretical supports for the application of the ScCCD8 gene in sugarcane genetic engineering breeding.【Method】Using homologous cloning method to obtain the sequence of ScCCD8 gene from ROC22，reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） and rapid amplification of cDNA ends PCR （RACE-PCR） were used to clone the full-length sequence of ScCCD8. The bioinformaticcharacteristics of the ScCCD8 was analyzed using online service. The expression profiles of ScCCD8 in various tissues，in response to different stress treatments and different growth times were investigated using quantitative real-time PCR （qRT-PCR）. 【Result】CCD8 was isolated from sugarcane，named ScCCD8，which was submitted to GenBank with accession number KP742973.1. It has 2 016 bp in length containing a 1 623 bp open reading frame （ORF） and encoding 540 amino acid residues. The molecular weights of ScCCD8 encoding protein were 59.534 kD，it is not a transmembrane protein that did not contain the signal peptide sites，indicating that it is not the secretory protein. Subcellular localization prediction showed that ScCCD8 might localize in chloroplast，and it contains several active sites such as phosphorylation sites and glycosylation sites. Comparison of protein sequences similarity analysis showed that ScCCD8 had more similarity with CCD8 from different plants. Phylogenetic tree analysis showed that ScCCD8 had the closest genetic relationship with Sorghum bicolor. Expression quantity of ScCCD8 was the highest in root，which is 18 times more than in old leaves. Analysis of the expression patterns in response to abiotic stress revealed that ScCCD8 is up-regulated by PEG（20% PEG），NaCl（200 mmol·L-1NaCl） and phosphorus deficiency （1/8 mmol·L-1）and nutritional deficiency（cultured in pure water） in stem tip，and the obviously increase expression was found after treated 24 hours. The expression of ScCCD8 in stem tip were various in different growth times，moreover the expression was higher in germination stage then in tillering stage.【Conclusion】Sugarcane strigolactones biosynthesis-related gene ScCCD8 was cloned from ROC22，which is the member of CCD8 gene family. It is speculated that ScCCD8 might participated in plant resistance to abiotic stresses.

sugarcane； carotenoid cleavage dioxygenase 8； strigolactones； qRT-PCR； drought stress

2016-03-16；接受日期：2016-05-16

國(guó)家自然科學(xué)基金（31360359）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金（CARS-20-1-1）、云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃（2016FB071）、云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才（2014HB038）

聯(lián)系方式：吳轉(zhuǎn)娣，E-mail：judith1123@126.com。劉新龍，E-mail：lxlgood868@163.com。吳轉(zhuǎn)娣和劉新龍為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者吳才文，E-mail：gksky_wcw@163.com