張　娜，李　琳，高　杉，朱　彥，王家明，張　鵬，于春泉

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津　300193；2.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，中藥新藥研發(fā)中心，天津　300457；3.天津科技大學，生物工程學院，天津 300457）

·中藥研究·

HS-SPEM-GC-MS分析丹蔞片中的揮發(fā)性化學成分*

張娜1，2，李琳1，高杉1，朱彥1，王家明3，張鵬1，于春泉1

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津300193；2.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，中藥新藥研發(fā)中心，天津300457；3.天津科技大學，生物工程學院，天津 300457）

［目的］用氣相色譜-質譜聯(lián)用（GC-MS）技術鑒定丹蔞片揮發(fā)性化學成分。［方法］采用頂空固相微萃取法（HS-SPEM）提取丹蔞片中的揮發(fā)性成分，利用GC-MS結合保留指數法（KI）對其主要揮發(fā)性成分進行分析鑒定。［結果］從丹蔞片揮發(fā)性成分中鑒定出44個組分，占總揮發(fā)性組分的72.46%。其中相對含量超過5%的成分有蒿本內酯（17.49%），β-欖香烯（11.07%），（-）斯巴醇（8.95%），3-丁烯基-1（3H）-異苯并呋喃酮（5.50%）等6個化合物。［結論］丹蔞片中的揮發(fā)性成分得到全面分析，根據其相對含量，丹蔞片中的揮發(fā)性成分主要來源于川芎、郁金、澤瀉，為丹蔞片的質量控制和進一步藥效研究提供一定的參考。

丹蔞片；揮發(fā)油；GC-MS分析

丹蔞片是臨床治療冠心病、心絞痛的常用復方制劑，由川芎、丹參、赤芍、澤瀉、郁金等10味中藥組成，主要用于治療痰瘀互結所致的胸痹心痛，癥見胸悶胸痛、憋氣、舌質紫暗、苔白膩，冠心病心絞痛見上述證候者；具有寬胸通陽，化痰散結，活血化瘀之功效［1-2］。丹蔞片復方藥味眾多，成分復雜，董娟等［3］已用液相色譜-質譜聯(lián)用（UPLC-MS）技術分析丹蔞片中的非揮發(fā)性成分，但對丹蔞片中的揮發(fā)性成分尚未有研究報道。丹蔞片中的郁金［4］、川芎［5］、澤瀉［6］等中藥的揮發(fā)性成分主要包括酚酸、酮類、萜類和酯類等，其中的某些揮發(fā)性成分對心、腦血管疾病具有一定的預防和治療作用［7-9］，因此對丹蔞片中揮發(fā)性成分值得研究。

氣相色譜質譜技術（GC-MS）對揮發(fā)性成分的定性分析與鑒定常用的是NIST譜庫檢索的方法、保留指數法、譜庫檢索和保留指數法相結合的方法［10］，其中保留指數（KI）是被國際公認的氣相色譜定性指標的一種參數，可以有效地區(qū)分結構上細微差別的同分異構體，將質譜檢索和保留指數相結合分析可顯著提高鑒定的準確性［11］。頂空固相微萃取技術（HS-SPEM）是固相微萃取技術的一種較常用的萃取模式，克服了水蒸氣蒸餾法、超臨界二氧化碳（CO2）萃取法等傳統(tǒng)方法中操作復雜，費用高等缺點［12-14］。對于中藥、生物樣本，該方法能夠很好的避免萃取固定相受到樣品中的大分子物質和難揮發(fā)性物質的污染與干擾［15］，并且在處理一些不穩(wěn)定的化學成分時，還可以防止它們出現(xiàn)加熱分解與轉化的現(xiàn)象［16］。該方法已經廣泛應用于食品、藥品、環(huán)境以及生物樣品的分析。本文采用HS-SPEM提取丹蔞片中的揮發(fā)性成分，利用GC-MS結合KI［17］對其主要成分進行分析鑒定。以期為丹蔞片藥效物質基礎的研究提供實驗基礎。

1　材料和方法

1.1材料、試劑與儀器Agilent7890A-5975CGCMS氣質聯(lián)用質譜儀（美國Agilent科技公司），色譜數據處理系統(tǒng)（MSD ChemStation E.02.01，美國Agilent科技公司），NIST08.L譜庫；HJ-3磁力攪拌加熱器（金壇市醫(yī)療儀器廠），100μm聚二甲基硅氧烷涂層固相萃取頭（PDMS，Supelco，Bellefonte，Pa），HP-5MS毛細管柱（美國Agilent科技公司），超純水機（天津市奧佳科技有限公司）。

正構烷烴對照品溶液C8-C20（美國FLUKA公司），氯化鈉為分析純（天津市化學試劑一廠）。

丹蔞片（吉林康乃爾藥業(yè)有限公司生產，批號20140602）。

1.2方法

1.2.1HS-SPEM法提取揮發(fā)油取5片丹蔞片粉碎，將粉碎過的樣品0.6584 g、飽和氯化鈉3.6g及12mL水放入頂空瓶中，在65℃磁力攪拌下萃取40min，取出，立即插入氣相色譜儀進樣口，解吸5min。進樣口溫度250℃，進樣模式為不分流進樣。

1.2.2色譜條件色譜柱：HP-5MS（60m×320μm× 0.25μm）；載氣He，流量1mL/min；汽化溫度：250℃；接口溫度：280℃；色譜柱初始溫度60℃（保持1min），以4℃/min升溫速率升至150℃（保持5 min），以4℃/min升溫速率升至240℃（保持3min）；溶劑延遲：0min。

1.2.3質譜條件電離方式：EI源，能量70 eV；離子源溫度:230℃；四極桿溫度:150℃；質量范圍：（35～800）AMU；電子倍增器電壓:1 400 V。譜圖檢索：采用NIST08.L譜庫進行檢索。

1.2.4KI值測定取正構烷烴混合對照品，按1.2.2項下條件分析，記錄各正構烷烴保留時間，根據化合物的保留時間找到相鄰的兩個正構烷烴后按下式計算待測化合物的KI值：KI=100Z+100［TR（x）-TR（z）］/［TR（z+1）-TR（z）］

式中：TR（x），TR（z），TR（z+1）分別代表待測化合物及碳數為Z，Z+1正構烷的保留時間。且TR（z）＜TR（x）＜TR（z+1）［18］。

2　結果

取1.1項下的丹蔞片供試品，按1.2.1項下條件提取供試品中的揮發(fā)性成分，按1.2.2項下條件對丹蔞片中的揮發(fā)性化學成分進行GC-MS分析，見圖1。

圖1丹蔞片在GC-MS中的TIC圖

采用峰面積歸一化法計算各組分相對含量，對總離子流圖中各色譜峰計算其KI值，利用各色譜峰對應的質譜圖進行NIST標準譜庫檢索，選取質譜匹配度高的10個可能物質，并檢索其理論保留指數（KI*）值，以質譜圖和KI值匹配度都高的化學結構為最佳鑒定結果，見表1。

3　討論

通過GC-MS分析丹蔞片中揮發(fā)性成分，經NIST08質譜庫檢索與保留指數雙重定性的方法鑒定出44種主要成分，其相對含量總和占總揮發(fā)性組分的72.46%。由總離子流圖和揮發(fā)性成分鑒定結果可知，丹蔞片揮發(fā)性成分十分復雜，種類較多，且相對含量差別較大。其中相對含量高于5%的成分有蒿本內酯、β-欖香烯等6個成分，相對含量1%～5%的成分有環(huán)氧香橙烯、吉馬酮等4個成分。

丹蔞片揮發(fā)性成分中含量最高的化合物通過NIST標準譜庫比對的匹配度只有69%，低于一般標準匹配度80%（匹配度高于一般標準的化合物，可直接定性）。為了確證該化合物的結構，根據其保留時間，選取了C8-C20正構烷烴，測定了其KI值，采用NIST匹配與保留指數法相結合方法鑒定該化合物，該化合物的實際KI值與反式蒿本內酯KI*值比較，標準偏差閾值小于10%［19］，可確定該化合物為反式蒿本內酯，對于保留時間在C8-C20正構烷烴范圍內的揮發(fā)性成分，本文同時計算了其KI值，對其進行了雙重定性。

反式蒿本內酯是本復方制劑中川芎的主要活性成分之一，具有改善微循環(huán)［20］、舒張血管［21］、抑制血管平滑肌細胞增殖［22］等作用。同時其他揮發(fā)性成分如β-欖香烯［23］等，也具有抗凝血、溶血栓、抗動脈粥樣硬化等的功效。由此推測，丹蔞片復方制劑中的揮發(fā)性成分也是其發(fā)揮抑制心肌缺血、抗動脈粥樣硬化、降脂等功效的活性成分，本實驗結果為后期進一步研究其藥效物質基礎提供了實驗依據。

［1］吳學芹，董娟，付愛珍，等.丹蔞片HPLC指紋圖譜研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2014，25（3）:319-322.

［2］李琳，王瑩，高杉，等.丹蔞片抗高脂血癥的研究進展［J］.天津中醫(yī)藥大學學報，2014，33（1）:61-64.

［3］Dong J，Zhu Y，Gao XM，etal.Qualitative and quantitative analysis of the majorconstituents in Chinese medicinal preparation Dan-lou tablet by ultra high performance liquid chromatography/diode-array detector/quadrupole timeof-flight tandem massspectrometry［J］.Journalofpharmaceuticaland biomedicalanalysis［J］.Journalof Pharmaceuti-caland BiomedicalAnalysis，2013（80）:50-62.

［4］楊昭武，李敏，茍寒陽，等.GC/MS內標法建立黃絲郁金揮發(fā)油特征圖譜研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2013，24（7）: 1652-1655.

［5］劉洪玲，于良生，紀恒勝，等.川芎揮發(fā)油的GC-MS指紋圖譜研究［J］.中國藥房，2012，23（43）:4101-4103.

［6］陳建忠，李彧，肖建平，等.藥對澤瀉-白術與其單味藥揮發(fā)油成分的比較分析［J］.福建中醫(yī)藥大學學報，2012，22（4）:43-46.

［7］岑顯娜.川芎藥理作用研究新進展［J］.實用醫(yī)技雜志，1996，3（2）:27-28.

［8］劉華鋼，劉俊英，賴茂祥，等.郁金化學成分及藥理作用的研究進展［J］.廣西中醫(yī)學院學報，2008，11（2）:81-83.

［9］鞏麗萍.澤瀉質量評價方法研究［D］.濟南:山東大學，2006.［10］趙晨曦，梁逸曾，胡黔楠，等.氣相色譜保留指數定性方法研究進展［J］.分析化學評述與進展，2005，33（5）:715-721.

［11］尹昌海，魏遠隆，左海根，等.GC-MS結合保留指數分析南豐蜜桔揮發(fā)性成分［J］.分析試驗室，2012，31（11）:58-62.

［12］Ma QL，Hamid N，Bekhit AED，et al.Optimization of headspace solid phase microextraction（HS-SPME）forgas chromatography mass spectrometry（GC-MS）analysis of aromacompounds in cooked beef using response surface methodology［J］.Microchemical Journal，2013（111）:16-24.

［13］賈偉娜，王春華，王宏濤，等.HS-SPME-GC/MS法分析連花清瘟膠囊制劑原料中的揮發(fā)性成分［J］.天津中醫(yī)藥，2015，32（2）:110-112.

［14］張義，高蓓，徐玉娟.頂空固相微萃取-氣質聯(lián)用方法分析龍眼中的揮發(fā)性化合物［J］.食品科學，2010，31（16）: 156-160.

［15］肖丹.頂空固相微萃取技術的應用與展望［J］.中國衛(wèi)生工程學，2015，14（1）:87-92.

［16］余倩，宋雙紅，李翠芹.SPME-GC-MS結合保留指數分析黃連木揮發(fā)性成分［J］.中藥材，2014，37（11）:2022-2025.

［17］梁晟，李雅文，趙晨曦，等.GC-MS結合保留指數對中藥揮發(fā)油的定性［J］.分析測試學報，2008，27（1）:84-87.

［18］陳邦杰，郭西見，彭少逸.程序升溫毛細管氣相色譜保留指數的計算［J］.色譜，1987，5（6）:335-338.

［19］楊帥，楊文文，胡金芳，等.GC-MS結合保留指數分析白花蛇舌草揮發(fā)性成分［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（9）:93-95.

［20］劉駿，魏玉平，劉永福，等.順式藁本內酯的提取方法及藥用用途［P］.中國:CN1552702A，2004-12-08.

［21］錢忠明，杜俊蓉，汪程遠.藁本內酯在制備預防和治療腦缺血性疾病的藥物中的應用［P］.中國:CN1732921A，2006-02-12.

［22］Kuang X，Yao Y，Du JR，et al.Neuroprotective role of Z-ligustilide against forebrain ischemic injury in ICRmice［J］. Brain research，2006（1102）:145-153.

［23］段文麗，白仁仁，鐘穎，等.β-欖香烯對RAW264.7巨噬細胞源性泡沫細胞作用的研究［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2014，14（31）:6014-6019.

HS-SPEM-GC-MSanalysisof the volatile componentsof Dan-lou tablets

ZHANGNa1，2，LILin1，GAOShan1，ZHUYan1，WANG Jia-ming3，ZHANGPeng1，YUChun-quan1
（1.Tianjin University of TraditionalChineseMedicine，Tianjin State Key Laboratory ofModern Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Tianjin International JointAcademy of Biomedicine，Research and DevelopmentCenter of Traditional Chinese Drug，Tianjin 300457，China；3.Tianjin University ofScienceand Technology，Engineering CollegeofBiology，Tianjin 300457，China）

［Objective］Using gas chromatography-mass spectrometry technology（GC-MS）to identify the chemical composition of volatile oil of Dan-lou tablets.［Method］In this paper，volatile components of Dan-lou tabletswere extracted by headspace solid phasemicroextraction（HS-SPEM）.Their structureswere identified based GC-MS database combined with Retention Index（KI）calculated.［Results］Fourty-four kinds of volatile oil compoundswere identified from Dan-lou tablet，which accounted 72.46%of the total volatile oil components.The ingredients which have content more than 5%were Ligustilide（17.49%），β-Elemenone（11.07%），（-）-Spathulenol（8.95%），3-butenyl-1（3H）-isobenzofuranone（5.502%）et al.［Conclusion］Volatile components of Dan-lou tablet are fully analyzed.The identifiedcompounds havemultiple activities according the prevent reports. Thisarticle providesa scientific basis forquality controland furtherpharmacological research ofDan-lou tablets.

Dan-lou tablet；volatile oil；GC-MS；analysis

R284

A

1673-9043（2016）04-0258-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.04.10

國家自然科學基金青年項目（81303183，81403198）；國家重點基礎研究發(fā)展計劃（“973”計劃）項目（2014CB542902）。作者簡介：張 娜（1990-）女，碩士研究生，主要從事藥物化學研究。

張鵬，E-mail:zhp8270@sina.com.cn；于春泉，E-mail:ycq-4@163.com。

2016-04-02）