于　洋，倪永清*

（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

干酪中腸球菌種群的遺傳差異及萬古霉素抗性基因分析

于洋，倪永清*

（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

通過種、屬引物特異性擴增、重復序列PCR（rep-PCR）技術和萬古霉素抗性基因檢測對新疆北疆地區(qū)干酪樣品中球菌的遺傳結構差異進行分析。結果表明，15份樣品共分離52株腸球菌，包括31株耐久腸球菌（Enterococcusdurans）、18株糞腸球菌（Enterococcusfaecalis）和3株屎腸球菌（Enterococcusfaecium）。依據(jù)rep-PCR遺傳指紋帶譜分析，52株菌可以聚類成7個群，其中4個由E.durans構成。24株腸球菌檢測到了萬古霉素抗性基因，17株E.durans為VanC2/C3型，4株E.faecalis為VanC1型，2株E.faecium為VanB型，只有1株E.faecium為VanA型。新疆北疆地區(qū)干酪中腸球菌種群分布較為廣泛，地域之間優(yōu)勢種群和基因型不同，同種腸球菌菌株之間存在廣泛的遺傳差異。

干酪；腸球菌；重復序列PCR；萬古霉素

腸球菌（enterococci）屬于乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB），是一類共生于人和其他哺乳動物腸道的革蘭氏陽性菌，也是人和哺乳動物腸道菌群的重要組成。最早分離的菌株大多來自人和哺乳動物腸道，陸續(xù)研究發(fā)現(xiàn)腸球菌廣泛分布于自然界的其他生態(tài)環(huán)境中，如健康人體的上呼吸道、口腔，甚至昆蟲體內［1］。除此之外，腸球菌更廣泛的存在于各種食品中，如干酪、牛奶、肉制品和蔬菜等［2］。

我國新疆北疆地區(qū)氣候季節(jié)變化明顯，有遼闊的天然牧場，生活在該地區(qū)的哈薩克族和維吾爾族等少數(shù)民族世代以原奶制作各種傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，其中干酪（維語“庫魯特”）是生活在牧區(qū)的牧民最常見的食物。到目前為止，雖然關于新疆地區(qū)乳制品中乳酸菌多樣性的研究報道較多［3-6］，但針對專一屬的同一類乳酸菌深入開展群體表型和遺傳差異的研究很少。此外，由于人類對抗生素的濫用，人們非常關注棲息于人體的腸球菌耐藥性及其致病性，對其遺傳結構差異的研究非常深入，其中萬古霉素抗性腸球菌（vancomycin-resistant enterococci，VRE）可攜帶相關抗性基因通過食物鏈進入人體，大大增強了致病風險而更加備受關注［7］。與此相比較，對于棲息于乳制品中的腸球菌，作為非主流的乳酸菌，對它們的遺傳多樣性和代謝特征、耐藥性研究報道相對較少。

本研究對新疆北疆3個地區(qū)5個縣的15份干酪樣品中的腸球菌進行了分離篩選，在種屬特異引物鑒定的基礎上，采用基于聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）的兩種指紋分型技術和萬古霉素抗性基因檢測，對不同地域來源干酪中腸球菌的種群分布和遺傳差異進行了分析，為開發(fā)具有特殊益生功能的、安全的腸球菌菌種資源，加工制作不同風味、不同感官品質的肉、乳制品的生產(chǎn)實踐提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1樣品來源及模式菌株

樣品采集自新疆北疆地區(qū)5個縣，即伊寧縣、昭蘇縣、尼勒克縣、哈巴河縣及和豐縣，每個采樣區(qū)各3份樣品，共15份。貼上標簽，置于4℃車載冰箱內，運回實驗室，保存于-20℃。模式菌株糞腸球菌（Enterococcus faecalis）CGMCC 1.2135T、屎腸球菌（Enterococcus faecium）CGMCC 1.2136T、耐久腸球菌（Enterococcus durans）CGMCC 1.2489T、海氏腸球菌（Enterococcus hirae）CGMCC1.2490T和鳥腸球菌（Enterococcus avium）CGMCC 1.2505T購于中國普通微生物菌種保藏管理中心（ChinaGeneralM icrobiologicalCulture Collection Center，CGMCC）；萬古霉素抗性菌株糞腸球菌（E.faecalis）ATCC 700802、鶉雞腸球菌（Enterococcus gallinarum）ATCC 49573T和鉛黃腸球菌（Enterococcus cas seliflavu）ATCC 25788T購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American for Type Culture Collection，ATCC）。

1.1.2培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基、膽汁七葉靈苷疊氮鈉（bile esculin azide，BEA）培養(yǎng)基：青島高科技園海博生物技術有限公司。

1.1.3主要試劑

PCR反應試劑：生工生物工程（上海）有限公司；擴增引物：上海捷瑞生物工程有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、不同分子質量Marker：北京全式金生物技術（TransGen Biotech）有限公司。

1.2儀器與設備

5810R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；TC-512 PCR擴增儀：英國Techne公司；PowerPacUniversal水平電泳儀、SUBCELLGT（20 cm×25 cm）電泳槽：美國Bio-Rad公司；QUANTUM-ST5凝膠成像系統(tǒng)：法國Vilber Lourmat公司。

1.3方法

1.3.1菌株的分離與純化

每份樣品取10 g加入190 m L無菌水于37℃搖床振蕩1 h制成樣品菌懸液。采用梯度稀釋法稀釋至10-5，取0.2 m L 10-3、10-4、10-5的稀釋液分別涂布于MRS和BEA選擇性瓊脂培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h。根據(jù)菌落顏色、形態(tài)、大小進行初步篩選，對疑似菌落繼續(xù)進行純化培養(yǎng)，純化2～3次，直至為單一菌落。然后對單菌落進行革蘭氏染色以及接觸酶試驗［8］進一步篩選疑似菌株。將篩選出的菌株液體純培養(yǎng)物補充20%的滅菌甘油，冷凍保存于-80℃冰箱。

1.3.2菌株DNA的提取

參考ATUL K S等［9］提取菌株DNA的方法，略有改動。1 m L菌株純培養(yǎng)物5 000 r/m in離心3 m in，棄上清液，用磷酸緩沖液（pH 7.4）洗滌3次，無菌水洗滌1次；加入0.5 m L 6mol/L尿素和0.1m L 10%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）重懸；37℃水浴20min，沸水浴5min；8000 r/min離心10 m in，棄上清液，加入0.1 m L 0.2 mol/L NaOH溶液37℃水浴10 min；3 000 r/m in離心3 min，吸取上清液，加入2.5倍體積的無水乙醇-20℃條件下靜置2 h；4℃條件下12 000 r/min離心15min，體積分數(shù)為70%預冷酒精洗滌2次，最后溶解于0.1 m L TE緩沖溶液中。

1.3.3腸球菌種屬特異引物鑒定

先采用腸球菌屬特異引物（Ent1/Ent2）［7］擴增疑似菌株確定其為腸球菌屬，模式菌株作為陽性對照，再采用種特異引物（Fk1/Fk2、Fae1/Fae2、Dur1/Dur2、Hi1/Hi2和Av1/Av2）［7］進行多重PCR擴增，確定其具體種。屬擴增PCR反應程序為：變性96℃、3 min；變性95℃、1 min，退火55℃、30 s，延伸72℃、1 min，35個循環(huán)，終延伸7 min。種擴增PCR反應程序為：變性96℃、3 m in；變性95℃、1 m in，退火60℃、30s，延伸72℃、1 min，35個循環(huán)，終延伸7 min。PCR反應體系詳見參考文獻［7］。

1.3.4rep-PCR分型

指紋圖譜所采用的引物及PCR反應條件如表1所示，取10 μL擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠、0.5×Tris硼酸電泳緩沖液（TBE），在160 V條件下電泳2 h 15 min，凝膠用溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色30 min，于凝膠成像系統(tǒng)觀察。對所得基因組重復序列聚合酶鏈式反應（repetitive extragenic palindromic polymerase chain reaction，rep-PCR）指紋圖譜采用GelCompar II 5.10軟件進行分析，相似性分析采用Pearson系數(shù)，使用UPGMA輸出樹狀圖。

表1　rep-PCR引物和PCR反應條件Table 1 Primers of rep-PCR and PCR reaction conditions

1.3.5萬古霉素抗性基因擴增

采用多重PCR來鑒定萬古霉素抗性腸球菌（VRE），引物和反應體系詳見文獻［7］，菌株E.faecium BM 4147（van A）、E.faecalis ATCC 700802（van B）、E.gallinarum ATCC 49573T（van C1）、E.casseliflavu ATCC 25788T（van C2/C3）作為陽性對照。擴增PCR反應程序為：變性94℃、3min；變性94℃、1 min，退火56℃、1 min，延伸72℃、1 min，30個循環(huán)，終延伸5 min。

2　結果與分析

2.1菌株分離鑒定及種群分布

利用MRS和BEA選擇性瓊脂培養(yǎng)基對干酪中腸球菌進行初篩，依據(jù)菌落大小、形態(tài)和顏色，油鏡觀察以及革蘭氏染色和接觸酶試驗對菌株進行篩選，呈現(xiàn)球狀，革蘭氏陽性，接觸酶陰性的疑似菌株87株。圖1顯示了部分菌株擴增結果，經(jīng)屬特異性引物鑒定，有52株菌株鑒定結果顯示為陽性（圖1a）屬特異引物擴增產(chǎn)物大小為112 bp），再利用種特異性引物鑒定，52株腸球菌分別隸屬于3個種，耐久腸球菌（E.durans）31株、糞腸球菌（E.faecalis）18株和3株屎腸球菌（E.faecium）（圖1b）耐久腸球菌（E.durans）特異引物擴增產(chǎn)物大小為295 bp，糞腸球菌（E.faecalis）特異引物擴增產(chǎn)物大小為941 bp，屎腸球菌（E.faecium）特異引物擴增產(chǎn)物大小為550 bp）。其中伊寧縣樣品9株（9株E.durans），昭蘇縣樣品13株（3株耐久腸球菌（E. durans），9株糞腸球菌（E.faecalis），1株屎腸球菌（E.faecium），尼勒克縣樣品12株（2株耐久腸球菌（E.durans），9株糞腸球菌（E.faecalis），1株屎腸球菌（E.faecium）），哈巴河縣10株（10株均為耐久腸球菌（E.durans）），和豐縣8株（7株耐久腸球菌（E.durans），1株屎腸球菌（E.faecium）。

圖1　部分菌株屬特異引物（a）及種特異引物（b）擴增產(chǎn)物電泳圖Fig．1 Am plification products electrophoregram of genus specific primers（a）and species specific primers（b）of partial strains

不同取樣點的干酪中腸球菌種群的分布情況見圖2。由圖2可知，伊寧縣、哈巴河縣及和豐縣樣品中的優(yōu)勢種為耐久腸球菌（E.durans），而昭蘇縣和尼勒克縣樣品的優(yōu)勢種為糞腸球菌（E.faecalis）。IRIGOYEN A等［7，11-12］研究發(fā)現(xiàn)干酪中糞腸球菌（E.faecalis）和屎腸球菌（E.faecium）是常見的優(yōu)勢種，也有研究表明屎腸球菌（E.faecium）和耐久腸球菌（E.durans）是干酪中的優(yōu)勢種［13］。結果表明，在完全成熟的干酪中糞腸球菌（E.faecalis）和屎腸球菌（E.faecium）占據(jù)優(yōu)勢，而耐久腸球菌（E.durans）則在未完全成熟的干酪中大量存在［14-15］。

圖2　各采樣點腸球菌種群的分布Fig．2 Species d istribution o f enterococci at various sam p ling points

2.2rep-PCR分型結果

為了得到準確的分析，對所得52株腸球菌的rep-PCR指紋圖譜采用GelCompar II 5.10凝膠分析軟件進行分析，輸出樹狀圖，結果如圖3所示。由圖3可知，引物BOXAIR擴增產(chǎn)物的大小在300～3 000 bp之間，條帶數(shù)為2到16不等，大多數(shù)產(chǎn)物的條帶數(shù)都多于4條。引物（GTG）5擴增產(chǎn)物的大小在100～5 000 bp之間，條帶數(shù)為3到20不等，大多數(shù)產(chǎn)物的條帶數(shù)在10條以上。

由圖3可知，52株腸球菌大約在40%的相似水平上被聚類為7群（Cluster），ClusterⅠ為5株耐久腸球菌（E.durans），帶型相近；ClusterⅡ僅僅包括帶型極為相近的2株屎腸球菌（E.faecium）；ClusterⅢ包括4株耐久腸球菌（E.durans）和1株屎腸球菌（E.faecium），4株耐久腸球菌（E.durans）中，菌株HF3-B-1、HF3-R-6和HF3-R-3的帶型更相似，菌株ZS2-R-4的帶型與它們相差較大，尤其是BOXAIR引物擴增圖譜中比較明顯，而另1株屎腸球菌（E.faecium）HF3-R-2也被劃分在這一組中，與另外2株屎腸球菌（E.faecium）不同，預示了該菌株獨特的遺傳結構；ClusterⅣ由15株耐久腸球菌（E.durans）組成，在45%的相似性水平上可進一步分為三小組，其中菌株NLK3-R-2與其它菌株的帶型相差很大，獨自成1組，菌株YN3-B-4是第二小組中差異最大的菌株；ClusterⅤ由16株帶型相近糞腸球菌（E.faecalis）組成，在45%的相似性水平上仍然可分為3小組，其中菌株NLK 3-B-4兩種指紋帶譜與其他菌株明顯不同，遺傳差異較大；ClusterⅥ僅有2株E.faecalis組成，與劃分在ClusterⅤ的所有其他糞腸球菌（E.faecalis）菌株相比，BOXAIR指紋帶譜差異更顯著，顯示了明顯的種內遺傳差異；耐久腸球菌（E.durans）顯示了最大種內遺傳差異，ClusterⅦ也由7株耐久腸球菌（E.durans）構成，但與隸屬于前四組的耐久腸球菌（E.durans）相比，帶譜差異極其明顯，其中HBH3-R-2是本組遺傳差異最大的菌株。帶型統(tǒng)計顯示，31株耐久腸球菌（E.durans）有10種帶型，18株糞腸球菌（E.faecalis）有3種帶型，3株屎腸球菌（E.faecium）有2種帶型。

圖3　52株腸球菌基于rep-PCR擴增的聚類圖及萬古霉素抗性腸球菌鑒定結果Fig.3 Dendrogram of 52 strains of enterococci based on rep-PCR am plification and identification results of enterococci w ith vancomycin-resistance

rep-PCR分型結果顯示3個腸球菌種間具有明顯的差異，種內帶型多樣，存在極高的遺傳多態(tài)性，與DALBB等［16］的研究結果一致。屎腸球菌（E.faecium）和耐久腸球菌（E.durans）兩個種間的系統(tǒng)發(fā)育關系較糞腸球菌（E.faecalis）更為接近，但作為優(yōu)勢種群的耐久腸球菌（E.durans）表現(xiàn)出更大的遺傳多態(tài)性。指紋圖譜以及綜合實驗結果發(fā)現(xiàn)，引物（GTG）5產(chǎn)生的指紋更清晰、條帶數(shù)有較高的多樣性，擴增效果明顯優(yōu)于引物BOXAIR的擴增效果。因此，（GTG）5更適合于Enterococcus的遺傳差異研究，與VANCANNEYT M等［17］的研究結論基本一致。

2.3萬古霉素抗性基因腸球菌的鑒定

本研究分離的52株腸球菌，采用4種萬古霉素抗性基因特異引物檢測到其中24株腸球菌攜帶有萬古霉素抗性基因，包括4種基因型，其中VanC2/C3型出現(xiàn)在17株耐久腸球菌（E.durans）中，這17株菌均來自耐久腸球菌（E.durans）構成的ClusterⅠ、Ⅲ和Ⅳ，而同樣由耐久腸球菌（E.durans）菌株組成的ClusterⅦ中沒有檢測到（見圖3）。在4株糞腸球菌（E.faecalis）中檢測到VanC1型，而隸屬于ClusterⅡ的2株屎腸球菌（E.faecium）為VanB型，僅有屎腸球菌（E.faecium）HF3-R-2檢測到vanA基因（見圖3）。部分菌株萬古霉素抗性基因擴增產(chǎn)物電泳圖見圖4。由圖4可知，van A基因擴增產(chǎn)物大小為732 bp；van B基因擴增產(chǎn)物大小為635 bp，van C基因擴增產(chǎn)物大小為822 bp，van C2/C3基因擴增產(chǎn)物大小為438 bp。

圖4　部分菌株萬古霉素抗性基因擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Am plification products electrophoregram of vancomycinresistance genes of partia l strains

2株屎腸球菌（E.faecium）含有基因van B，1株屎腸球菌（E.faecium）含有基因van A，而在干酪中分布廣泛的耐久腸球菌（E.durans）和糞腸球菌（E.faecalis）種群均沒有檢測到這兩種抗性基因。迄今為止，中國的臨床環(huán)境中萬古霉素抗性腸球菌普遍存在［18］，但是養(yǎng)殖動物中很少報道萬古霉素抗性腸球菌的存在。雖然可以認為新疆地區(qū)干酪中的腸球菌有可能來自養(yǎng)殖動物，但是干酪大部分是家庭作坊式手工加工，來自加工者自身的腸球菌也有可能進入干酪，而且可能攜帶萬古霉素抗性腸球菌的概率更高。本研究從干酪中篩選到的屎腸球菌（E.faecium）菌株較少，但都攜帶有萬古霉素抗性基因，因此實驗室后期對于屎腸球菌（E.faecium）將會進一步關注，分離到更多的菌株，以便更全面地評價干酪、人體和動物原奶中腸球菌的安全性，為科學評價近年來我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)中濫用抗生素引起的耐藥基因擴散問題提供理論參考依據(jù)。

3　結論

與食品相關的乳酸菌中，腸球菌是最受爭議的一類，最近越來越受到大家的關注，成為國內外研究的熱點。本研究從新疆北疆地區(qū)5個縣的干酪樣品中分離培養(yǎng)腸球菌，采用屬、種特異引物擴增鑒定最終確定52株腸球菌，分別屬于耐久腸球菌（E.durans）、糞腸球菌（E.faecalis）和屎腸球菌（E.faecium）這三個種。根據(jù)rep-PCR分型結果，52株菌可以聚類成7個群，其中4個由E.durans構成。萬古霉素耐藥基因檢測結果顯示，24株腸球菌含有萬古霉素耐藥基因，分屬4種基因型。

新疆北疆地區(qū)干酪中腸球菌種群分布較為廣泛，地域之間優(yōu)勢種群和基因型不同，同種內腸球菌菌株之間存在比較廣泛的遺傳差異。在24株腸球菌中檢測到萬古霉素抗性基因，且在兩株E.faecium中檢測到含有van B，1株E.faecium含有van A，這是國內首次報道干酪中腸球菌檢測到有van A和van B抗性基因，本實驗室后續(xù)會做進一步研究。

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Genetic divergence and vancomycin-resistance genes analysis ofenterococci isolated from cheese samples

YU Yang，NI Yongqing*
（School of Food Science，Shihezi University，Shihezi 832000）

The genetic structure differences of coccus from cheese samples in the north of Xinjiang were analyzed by specific amplification of species and genus primers，rep-PCR technology and the detection of vancomycin-resistance gene.The results showed that 52 strains of enterococci were obtained from 15 samples，including 31 strains of Enterococcus durans，18 strains of Enterococcus faecalis and 3 strains of Enterococcus faecium.According to the analysis of rep-PCR genetic fingerprint spectrum，the 52 strains could be clustered into seven groups，in which four groups were constituted by E.durans.The vancomycin-resistance gene was detected from 24 strains of enterococci，in which 17 strains of E.durans were identified as VanC2/C3，4 strains of E.durans were identified as VanC1，2 strains of E.durans were identified as VanB，only one of E.durans was VanA.The enterococci strains were w idely distributed in cheese from the north of Xinjiang.The dom inant population and genotype were different between different regions.There were high genetic differences among enterococci intraspecies.

cheese；enterococci；rep-PCR；vancomycin

Q566

0254-5071（2016）05-0149-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．031

2016-03-25

國家自然科學基金項目（31360001）；新疆兵團現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技攻關與成果轉化項目（2015AC003）

于洋（1989-），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。

倪永清（1969-），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。