馬春玲，張彥飛，楊　雪，巨曉芝，刁愛坡，馬紅武*

（1.天津科技大學生物工程學院，天津300457；2.中國科學院系統微生物工程重點實驗室，中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所，天津300308）

通過體外代謝途徑構建確定乳酸合成關鍵酶

馬春玲1，2，張彥飛2，楊雪2，巨曉芝1，2，刁愛坡1，馬紅武2*

（1.天津科技大學生物工程學院，天津300457；2.中國科學院系統微生物工程重點實驗室，中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所，天津300308）

基于代謝控制分析理論提出了一種通過體外代謝途徑構建和分析確定關鍵酶的方法并應用其確定乳酸高產菌株中的關鍵酶。首先獲得高產菌株的粗酶液并測定葡萄糖到乳酸合成途徑中各種蛋白的絕對濃度，進而通過向粗酶液中分別添加同等比例的各純酶對途徑進行擾動，并由擾動前后的途徑通量變化計算出各酶的通量控制系數以確定關鍵酶。結果表明，該菌株乳酸合成途徑中丙酮酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶對途徑通量影響最大，由此預測在該菌株基礎上進一步過表達這兩個酶對提高乳酸生成速率可能最為有效。

體外代謝途徑構建；乳酸合成途徑；代謝控制分析；關鍵酶；通量控制系數

乳酸是自然界中最小的手性分子，廣泛存在于生物體中，是世界上被公認的三大有機酸之一，廣泛應用于醫(yī)藥、印刷、印染、制革、烤煙等領域［1］。目前，世界上90%的乳酸由發(fā)酵法生產獲得，少量由化學合成法生產［2-3］。近年來，因為大腸桿菌生長速度快、營養(yǎng)需求簡單等優(yōu)點，應用大腸桿菌基因改造菌株生產D-乳酸也得到了人們越來越多的關注［4-5］。構建高產D-乳酸菌株的常用方法有引入高活性外源酶、過表達關鍵酶及對酶基因的序列進行改造以解除抑制等，這些方法往往需要以確定關鍵酶為前提。為提高乳酸生成量，人們首先會考慮增加D-乳酸脫氫酶（D-lactate dehydrogenase，D-LDH）基因的表達量，但BUNCH P K等［6］的研究結果表明，在大腸桿菌中過量表達D-LDH反而會使菌體生長變慢，影響D-乳酸的生成。

該文利用體外代謝途徑構建和代謝控制分析的方法對葡萄糖到乳酸合成途徑中各酶對合成通量的影響進行了分析，計算通量控制系數，確定途徑關鍵酶，為胞內改造提供指導方向。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

Prime STAR mix、限制性內切酶、T4 DNA連接酶、蛋白標準品（Marker）：New England Biolabs；葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、果糖1，6-二磷酸、甘油醛-3-磷酸、二羥丙酮磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、乳酸脫氫酶、乳酸：美國Sigma公司；丙酮酸、腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinu cleotide，NAD+）、煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（nicotinamide adeninedinucleotidephosphate，NADP+）、磷酸鹽：北京索萊寶科技有限公司。

1.2儀器與設備

V-1600可見分光光度計：上海美普達儀器有限公司；DRP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司；Tecan infinite M 200 PRO多功能微孔板檢測儀：瑞士Tecan公司；1260 Infinity LC高效液相色譜（highperformance liquid chromatography，HPLC）分析儀：美國Agilent公司。

1.3方法

本區(qū)硅質巖主量元素分析結果列于表2。SiO2的含量較高，平均為89.82%，SiO2的含量高低與鏡下觀察的硅質物質比例基本吻合；Al2O3、TiO2及Fe2O3平均含量分別為4.16%、0.17%和1.86%，MgO和CaO含量較低，MnO的含量小于0.01%，研究Fe/Mn的比值可以確定礦床的成因類型。本區(qū)硅質巖微量元素分析結果見表3。由表2可以看出，Sc的含量平均為4.13×10-6。U和Th的含量平均含量分別為3.16×10-6和4.34×10-6，U/Th比值的平均值為0.84。下石炭統V的含量高于上泥盆統，且在接近地質界線處為最高165×10-6。

1.3.1乳酸高產菌株粗酶液的制備

將實驗室篩選得到的一株D-乳酸高產菌株培養(yǎng)至對數期（12～14 h），取發(fā)酵液離心獲得菌體，再經過重懸、破碎、離心取上清及透析后得到不含小分子干擾物的粗酶液，用于后續(xù)研究。

1.3.2質粒構建及蛋白純化

根據GenBank基因序列及pET-28a的多克隆位點（multiple cloning site，MCS），應用Primer premier 5.0軟件設計引物F1/R1，以E.coli MG1655基因組為模板，擴增目的片段。以pET-28a（+）為載體，以E.coli BL21（DE3）為宿主，經異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導12～16h后，離心獲得菌體。把菌體重懸后，經破碎取上清，得到細胞液。利用咪唑對細胞液進行梯度洗脫，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）驗證［16-17］后，收集目標蛋白，透析濃縮，經Bradford法定量后，分裝、置于-80℃保存。

1.3.3乳酸合成途徑蛋白催化速率的測定

基于NAD（P）H在波長340 nm處有吸收光，通過酶偶聯的方法可測定NAD（P）H的生成或消耗，可進一步計算出反應中途徑蛋白的催化速率。利用偶聯酶間接測定催化速率時，要考慮反饋抑制［18］、底物及偶聯酶過量等問題。由于底物甘油酸-1，3-二磷酸、甘油酸-3-磷酸、甘油酸-2-磷酸無法體外獲得，故甘油酸磷酸激酶（phosphoglycerate kinase，Pgk）、甘油酸磷酸變位酶（2，3-bisphosphoglycerate-dependent phosphoglycerate mutase，GpmA）、烯醇化酶（enolase，Eno）的催化速率尚無法測定，因此未針對這三個酶進行研究。乳酸合成途徑中各蛋白催化速率的測定原理及反應方程見表1。

表1　乳酸合成途徑中各蛋白催化速率的測定原理及反應方程Table 1 Measuremen t princip les and reaction equations of catalysis rates of the enzym es in the lac tate synthesis pathway

1.3.4代謝物濃度測定

（1）NADH濃度的檢測

利用光柵型多功能微孔檢測儀Tecan infinite M 200 PRO進行在線測定，紫外檢測波長為340 nm，檢測池溫度為37℃，樣品量200 μL。

（2）乳酸濃度的檢測

利用高效液相色譜（HPLC）進行測定，色譜柱為BIORAD Aminex HPX-87H有機酸柱（7.8 mm×300 mm），柱溫45℃，流動相為終濃度5 mmol/L的H2SO4，流速0.6 m L/min，串聯連接RID、VWD檢測器，紫外檢測波長為190 nm，檢測池溫度為35℃。每個樣品進樣量為10 μL，分析時間為26 m in。

1.3.5計算公式

通量控制系數（FCCs）可以由下面的公式計算，FCC越大，代表酶濃度改變對途徑的通量影響越大。

式中：Jr和表酶濃度改變后的酶量和途徑通量值；ΔJ是指酶量改變后通量的變化；ΔEi是指酶濃度的變化量。

2　結果與分析

2.1乳酸合成途徑中各蛋白的表達純化

目的蛋白100℃變性10 min后，SDS-PAGE結果如圖1所示。

圖1　目的蛋白SDS-PAGE圖譜分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of target protein

由圖1可知，目的蛋白基本沒有雜帶，可用于后續(xù)實驗。

2.2粗酶液中乳酸合成途徑各蛋白絕對濃度的測定

蛋白組學測定方法雖然可以同時測得多個蛋白的濃度變化，但結果一般是該蛋白在不同條件下的相對濃度變化而非絕對濃度，而代謝控制分析需要酶的絕對濃度。針對這一問題提出了一種通過純酶滴定確定粗酶液中各酶絕對濃度的方法。首先對要定量的酶添加過量底物使其反應速率僅受酶濃度影響，然后在粗酶液中添加不同濃度的純酶，通過純酶添加濃度和反應速率的擬合曲線得到原粗酶液中相應酶的絕對濃度。以Glk為例，在200 μL粗酶反應體系中加入過量葡萄糖、ATP、磷酸烯醇式丙酮酸及偶聯酶，為了使反應速率控制在合適的范圍內，得到更多NADH濃度處于線性變化階段的數據，需將粗酶稀釋60倍后待用。測定只有粗酶液及添加不同濃度Glk純酶后的反應速率，結果如圖2所示。

圖2　反應體系中Glk質量濃度變化對反應速率的影響曲線Fig.2 Changing curve of reaction rates w ith the Glk concentrations on reaction ra te

由圖2可知，純酶質量濃度與反應速率擬合可得到一線性關系，當純酶質量濃度為0時的速率（Y軸截距）即粗酶液中Glk催化反應的速率，其在X軸上的截距即對應Glk在稀釋后粗酶液中的絕對質量濃度，為0.63 mg/L。由稀釋率可推算出原粗酶液中含有的Glk蛋白質量濃度為37.8 mg/L。

根據確定粗酶液中Glk蛋白定量的方法最終確定乳酸合成途徑中各種蛋白的含量見圖3。

圖3　粗酶液中乳酸合成途徑各蛋白濃度的絕對定量Fig.3 Enzymes absolute concentrations of the lactate synthesis pathway in the crude enzyme

由圖3可以看出，在此高產菌株的粗酶液中GapA蛋白濃度遠高于其他蛋白，可能是由于GapA催化反應中有NADH產生，而乳酸的生成消耗NADH，GapA蛋白含量較多能夠提供更多的合成還原力使該菌株能夠更有效地合成乳酸。

2.3乳酸合成途徑中各蛋白的通量控制系數計算

基于菌種基因工程改造過程中酶量常發(fā)生較大變化，選擇將每個酶的濃度都增加到其在稀釋粗酶液濃度中的兩倍。代謝控制分析時要測量整個途徑達到擬穩(wěn)態(tài)時的通量，在葡萄糖到乳酸的合成途徑中的中間代謝物都可通過前面的反應生成，因此在多酶反應體系中只需添加初始底物葡萄糖、ATP、ADP、NAD+和磷酸。參考BRENDA數據庫中的親和常數Km值及文獻中胞內代謝物濃度水平［19］，結合實驗摸索，確定當上述代謝物終濃度分別為5 mmol/L、5 mmol/L、2 mmol/L、2 mmol/L、2 mmol/L時已足夠保證底物為過量。同樣，在上述稀釋60倍后的粗酶液基礎上，分別添加不同純酶，純酶添加量均為粗酶稀釋液中對應該蛋白絕對濃度2倍。因合成途徑的最終產物是乳酸，以乳酸合成速率代表整個途徑的通量，乳酸的生成速率見圖4。

圖4　各純酶添加后乳酸的生成速率Fig.4 Lactate production rate after enzym e addition

由圖4可知，在粗酶液催化反應基礎上添加純酶PykA及純酶GapA時有較大的乳酸生成速率。

經計算，途徑中各種蛋白的通量控制系數（FCCs）見圖5。

圖5　乳酸合成途徑中各蛋白的通量控制系數Fig.5 Flux control coefficients of the enzymes in the lactate synthesis pathway

由圖5可知，PykA的FCC最大，其次是GapA，在蛋白濃度絕對定量的結果中，粗酶液中PykA濃度最低，其為催化生成乳酸的前體物質丙酮酸的步驟，使得添加PykA后對代謝途徑通量影響最大。GapA催化反應生成NADH，而乳酸生成需要消耗NADH，所以GapA含量增加也對代謝途徑通量影響較大。

3　結論

本研究利用體外代謝途徑分析的方法確定了一株乳酸合成大腸桿菌中從葡萄糖到乳酸各步酶的絕對濃度，為確定該菌株的關鍵酶奠定了基礎，進而通過向粗酶液中添加純酶的方法對體外多酶反應體系進行擾動，基于代謝控制分析原理求得各個酶的通量控制系數從而確定對通量具有較大影響的關鍵酶。結果表明，該菌株中PykA和GapA為乳酸合成通量控制的關鍵酶，在后續(xù)代謝工程改造中可以作為過表達靶點以進一步提高乳酸合成速率。

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Determ ination of key enzymes for lactate synthesis through in vitro metabolic pathway construction

MA Chunling1，2，ZHANG Yanfei2，YANG Xue2，JU Xiaozhi1，2，DIAO A ipo1，MA Hongwu2*
（1.College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Key Laboratory of Systems M icrobial Biotechnology，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China）

A method was presented for key enzyme determination through in vitro metabolic pathway analysis based on the metabolic control analysis theory and it was used to determ ine the key enzymes in lactate-producing strain.Firstly，crude enzyme extracts were obtained from the strain and the absolute protein concentrations for all enzymes in the pathway from glucose to pyruvate were measured.Then individual pure enzymes were added to the crude extract and the pathway flux changes were measured to calculate the flux control coefficients（FCCs）of the enzymes to determine the key enzymes.It was found that pyruvate kinase（PykA）and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GapA）had the largest effect on FCCs，and thus should be the gene overexpression targets for further improvement of lactate production.

in vitro metabolic pathway construction；lactate synthesis pathway；metabolic control analysis；key enzyme；flux control coefficient

Q815

0254-5071（2016）05-0144-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．030

2016-02-15

國家重點基礎研究計劃‘973計劃’（Nos.2012CB725203）；國家高技術研究發(fā)展計劃‘863計劃’（No.2012AA 022103）；天津市科技支撐計劃重點項目（No.14ZCZDSY 00060）

馬春玲（1990-），女，碩士研究生，研究方向為合成生物學。

馬紅武（1970-），男，研究員，博士，研究方向為系統微生物學。