吉義平，陳　欣，沈瑞敏

（武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北武漢430205）

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取豆豉低聚糖工藝

吉義平，陳欣，沈瑞敏

（武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北武漢430205）

本研究以豆豉為原料，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)對超聲波-熱水浸提提取豆豉低聚糖的工藝進(jìn)行了研究。在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇超聲時(shí)間、液料比、浸提溫度、浸提時(shí)間進(jìn)行4因素3水平的中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，再利用響應(yīng)面分析試驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化。研究結(jié)果表明，最佳提取條件為：超聲時(shí)間28 m in，液料比24∶1（m L∶g），浸提溫度為80℃，浸提時(shí)間為1.74 h，此提取條件下豆豉低聚糖的得率實(shí)測值為3.86%，預(yù)測值為3.91%，實(shí)測值與預(yù)測值相差甚小，說明模型具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

豆豉；低聚糖；超聲波；響應(yīng)面試驗(yàn)

豆豉是以大豆為主要原料，經(jīng)過浸泡、蒸煮、攤涼、制曲、發(fā)酵等一系列工藝而制成的藥食兩用食物。目前對豆豉功能性的研究是一大熱點(diǎn)，大多集中在豆豉中異黃酮和豆豉溶栓酶、納豆激酶等有溶血栓作用的物質(zhì)研究方面［1-2］，但對豆豉低聚糖的研究鮮有報(bào)道。豆豉中功能性低聚糖，既包括原料中天然存在的低聚糖［3］，如棉籽糖、蔗糖、水蘇糖等，又有發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)生的低聚糖，其產(chǎn)生主要有兩大途徑：一是通過微生物產(chǎn)生的糖苷轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)糖基作用合成的；另一種是微生物產(chǎn)生的內(nèi)切半纖維素酶類，如甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和木葡聚糖酶等水解半纖維素類多糖產(chǎn)生［4-5］。探討豆豉低聚糖的提取與分離檢測技術(shù)對于指導(dǎo)其進(jìn)一步開發(fā)利用具有重要意義。

目前，關(guān)于低聚糖的提取方法報(bào)道較多，主要有傳統(tǒng)的水浸提法［6-7］、堿提酸沉［8］、醇提法［9］、膜分離技術(shù)［10］、酶水解法［11-12］、微波法［13-15］和超聲輔助技術(shù)［16-20］。其中，水浸提法雖然環(huán)保經(jīng)濟(jì)卻不易達(dá)到理想的提取率；堿液浸取時(shí)間太長，大多在1.5 h左右；有機(jī)溶劑提取法存在溶劑耗量大、成本高等缺點(diǎn)；膜技術(shù)設(shè)備投資大、工藝較復(fù)雜；酶水解法存在工藝繁瑣、酶成本高等缺點(diǎn)；而微波和超聲波輔助提取技術(shù)應(yīng)用到低聚糖的提取中，既提高了提取效率，又不破壞活性成分的結(jié)構(gòu)和性能，是較為理想的新型提取方式。故本試驗(yàn)利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取豆豉中的低聚糖，尋求其最佳工藝參數(shù)，旨在確定最適提取方法，以期為豆豉低聚糖的研究與應(yīng)用提供一定的參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

豆豉：市售；石油醚、濃硫酸、苯酚、葡萄糖等（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

XFB-200高速中藥粉碎機(jī)：中國吉首忠誠制藥機(jī)械廠；KQ2200DB超聲波清洗器：昆山超聲波有限公司；TDL-5-A離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；722B型可見光分光光度計(jì)：天津市普瑞斯儀器有限公司；SHZD抽濾機(jī)：鞏義市亭華有限責(zé)任公司；H-H-2水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FA1004B分析天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1豆豉低聚糖的提取工藝流程及操作要點(diǎn)

豆豉→烘干→粉碎過篩→石油醚回流脫脂→干燥→加蒸餾水→超聲波處理→熱水浸提提取→過濾→上清液濃縮→醇沉→離心→上清液濃縮、定容→冷凍干燥→豆豉低聚糖

操作要點(diǎn)：

粉碎：市售豆豉于60℃條件下烘干至質(zhì)量恒定，用高速組織粉碎機(jī)粉碎，過40目篩。

脫脂：取一定量豆豉粉，置于索氏提取器中，加入30～60℃的石油醚溶液，在50℃下浸提6 h，低溫干燥至質(zhì)量恒定，即得到脫脂后的粉末備用。

濃縮醇沉：將提取液在減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中50℃下濃縮至5 m L，加入30 m L體積分?jǐn)?shù)95%乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)85%進(jìn)行醇沉過夜。

1.3.2豆豉低聚糖的提取工藝研究

按照1.3.1的提取工藝流程，固定超聲功率400 W，分別考察超聲時(shí)間、浸提溫度、浸提時(shí)間和液料比4個(gè)單因素對豆豉低聚糖得率的影響，并在單因素的基礎(chǔ)上選取該4個(gè)因素的3個(gè)較優(yōu)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，確定超聲波輔助熱水浸提豆豉低聚糖的最優(yōu)工藝條件。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Facto rs and levels of response surface analysis

1.3.3豆豉低聚糖得率的測定

建立葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并采用苯酚-硫酸法測定豆豉低聚糖的含量，低聚糖得率計(jì)算如下：

式中：x表示相當(dāng)于葡萄糖的質(zhì)量濃度，mg/m L；V1表示顯色時(shí)的取樣體積，mL；V2表示定容樣品的體積，m L；V為提取液的定容體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

2　結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以葡萄糖質(zhì)量濃度（x，mg/m L）為橫坐標(biāo)，低聚糖溶液在波長490 nm處的吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=7.786 8x+0.072 7，R2=0.996 4。結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，二者線性關(guān)系良好。

2.2單因素試驗(yàn)

2.2.1超聲時(shí)間優(yōu)化單因素試驗(yàn)

固定超聲功率400 W，在浸提溫度為75℃，浸提時(shí)間為120 min，液料比15∶1（m L∶g）的條件下，超聲時(shí)間分別在10 min、20 min、30 m in、40 min、50 min五個(gè)水平下進(jìn)行提取后旋轉(zhuǎn)濃縮，醇沉過夜，以豆豉、低聚糖得率為評價(jià)指標(biāo)，考察超聲時(shí)間與低聚糖得率的關(guān)系如圖1所示。

圖1　不同超聲時(shí)間對豆豉低聚糖得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on extraction rate of oligosaccharides

研究資料表示，超聲波具有的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)，增大介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度和穿透力，可導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)的極性物質(zhì)，尤其是水分子吸收電磁能產(chǎn)生大量的熱量，使細(xì)胞內(nèi)溫度迅速上升，液態(tài)水汽化產(chǎn)生的壓力將細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沖破，形成微小的孔洞和裂紋?？锥春土鸭y的存在使胞外溶劑容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而更有利于低聚糖的提?。?2］。

從圖1中可以看出，在超聲波取時(shí)間10～30 min的范圍內(nèi)，隨著超聲時(shí)間的延長，豆豉低聚糖得率也隨之逐漸提高，但是超過30 min后繼續(xù)延長超聲時(shí)間，得率不再提高反而降低。表明超聲波處理時(shí)間太短，低聚糖溶出不充分；但處理時(shí)間過長，可能導(dǎo)致低聚糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，糖鏈發(fā)生斷裂，最終使豆豉、低聚糖得率下降。故最佳的超聲時(shí)間為30 min。

2.2.2浸提時(shí)間優(yōu)化單因素試驗(yàn)

在固定超聲時(shí)間為30 min，浸提溫度為75℃，液料比15∶1（m L∶g）的條件下，浸提時(shí)間分別為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h五個(gè)水平進(jìn)行測定，獲得不同浸提時(shí)間對豆豉低聚糖得率的影響如圖2所示。

從圖2中可以看出，1～2 h之間得率隨著浸提時(shí)間的延長而增加，在熱水浸提時(shí)間為2 h左右時(shí)，得率達(dá)最大值?？赡苁怯捎跁r(shí)間過長，提取過程中不斷產(chǎn)生熱能，造成某些不穩(wěn)定低聚糖的降解［19］。所以在低聚糖提取過程中，時(shí)間不宜過長，最佳浸提時(shí)間為2 h。

圖2　不同浸提時(shí)間對豆豉低聚糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of oligosaccharides

2.2.3液料比優(yōu)化單因素試驗(yàn)

固定超聲時(shí)間為30 min，熱水浸提時(shí)間為2 h，熱水浸提溫度為75℃，液料比分別在5∶1，10∶1，15∶1，20∶1，25∶1（m L∶g）五個(gè)水平進(jìn)行測定，不同料液比對豆豉低聚糖得率的影響如圖3所示。

圖3　不同液料比對豆豉低聚糖得率的影響Fig.3 Effect o f liquid-solid ratio on extrac tion rate of oligosaccharides

從圖3中可以看出，隨著液料比的增大，低聚糖的得率逐漸增大，當(dāng)液料比＞20∶1（m L∶g）后，多糖得率增長漸趨平緩。說明隨著溶解低聚糖的溶劑水體積的增大，更有利于低聚糖的溶出。但當(dāng)樣品中的低聚糖基本溶解出來之后，過多的溶劑不但不會(huì)增加低聚糖的得率，反而會(huì)增大提取成本，故最佳的液料比為20∶1（m L∶g）。

2.2.4浸提溫度優(yōu)化單因素試驗(yàn)

固定超聲時(shí)間為30 min，浸提時(shí)間為2 h，液料比20∶1（m L∶g）的條件下，浸提溫度分別為45℃、55℃、65℃、75℃、85℃、95℃、100℃七個(gè)水平進(jìn)行測定，獲得不同浸提溫度對豆豉低聚糖得率的影響如圖4所示。

從圖4可以看出，隨著浸提溫度的升高，水分子運(yùn)動(dòng)越劇烈，加速了低聚糖的浸出，使得率增大，利于低聚糖的提取。但當(dāng)浸提溫度＞85℃時(shí)，得率下降原因可能是隨著浸提溫度的進(jìn)一步升高，導(dǎo)致低聚糖的穩(wěn)定性下降。故最佳浸提溫度為85℃。

圖4　不同浸提溫度對豆豉低聚糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction tem pera ture on extrac tion rate of oligosaccharides

2.3響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1模型的擬合及方差分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以超聲時(shí)間、浸提時(shí)間、料液比、浸提溫度4個(gè)影響因素為變量，豆豉低聚糖得率為響應(yīng)值（Y），采用4因素3水平試驗(yàn)對豆豉低聚糖的提取進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experim ental design and results of response surface analysis

利用Design-Expert 8.0.4對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次回歸方程：Y=3.43-0.088A+0.068B-0.040C-0.019D+ 0.065AB-0.078AC-0.030AD-0.13BC-0.11BD-0.12CD+ 0.030A2-0.57B2-0.68C2-0.63D2。

表3　響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of the fitted regression equation

對上述回歸模型進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。從表3可以看出，模型的F=50.97，P＜0.000 1，表明該二次方程模型具有高度的顯著性；失擬項(xiàng)P=0.173 4＞0.1，表明模型的失擬項(xiàng)不顯著；方程相關(guān)系數(shù)R2=0.980 8，說明98.08%的數(shù)據(jù)可以用此模型解釋。另外，該模型的變異系數(shù)為3.61，＜10，說明該方程穩(wěn)定性較好。信噪比為21.510，＞4，說明該模型分辨力很高，能正確地反映試驗(yàn)結(jié)果。由以上分析可知，該方程對試驗(yàn)擬合較好，能夠用上述模型較好地預(yù)測各指標(biāo)實(shí)際值。

此外，由A、B、C、D 4個(gè)因素的F值判斷，4種因素對低聚糖得率的影響大小依次為A＞B＞C＞D，即超聲時(shí)間＞浸提時(shí)間＞料液比＞浸提溫度。其中超聲時(shí)間（A）對低聚糖得率的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），浸提時(shí)間（B）達(dá)顯著水平（P＜0.10）。浸提時(shí)間、液料比和浸提溫度的曲面效應(yīng)（B2、C2、D2）對結(jié)果有極顯著影響（P＜0.01）；BC、BD、CD項(xiàng)交互效應(yīng)顯著（P＜0.10），即浸提時(shí)間、浸提溫度和料液比之間的交互作用對豆豉低聚糖的得率有顯著影響，其交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖如圖5所示。

圖5　浸提時(shí)間、料液比和浸提溫度對豆豉低聚糖得率影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig．5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between extraction time，liquid-solid ratio and extraction tem pera ture on extrac tion rate of Douchi o ligosaccharides

2.3.2試驗(yàn)結(jié)果及驗(yàn)證試驗(yàn)

對回歸方程取一階偏導(dǎo)，得到三元一次方程組，求解得出超聲波提取的最佳工藝為：超聲時(shí)間28.14min，液料比24.35∶1（m L∶g），浸提溫度為80.34℃，浸提時(shí)間為1.74 h。在此條件下，豆豉低聚糖的得率預(yù)測為3.91%?？紤]到實(shí)際操作便利性，將此條件修正為：超聲時(shí)間28 min，液料比24∶1（m L∶g），浸提溫度為80℃，浸提時(shí)間為1.74 h。在上述修正條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得豆鼓、低聚糖得率為3.86%，這與模型預(yù)測值接近，說明此模型作為超聲波提取的數(shù)學(xué)模型是可行的。

3　結(jié)論

本研究采取Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)并結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化了豆豉低聚糖的超聲輔助提取工藝，建立了超聲時(shí)間、浸提時(shí)間、浸提溫度和液料比4個(gè)因素的超聲輔助提取豆豉低聚糖的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型。最終確定的最佳工藝參數(shù)為：超聲時(shí)間28 min，液料比24∶1（m L∶g），浸提溫度80℃，浸提時(shí)間1.74 h，此條件下豆豉低聚糖得率達(dá)3.86%。

本實(shí)驗(yàn)利用超聲波獨(dú)特的機(jī)械振動(dòng)作用和空化作用來破壞豆豉的細(xì)胞壁，使水能快速滲透到豆豉細(xì)胞中，促使低聚糖溶解并擴(kuò)散到溶液中，從而提高了低聚糖的得率。該提取液中的水溶性多糖經(jīng)體積分?jǐn)?shù)85%乙醇醇沉后得到有效的分離，而還原糖的含量極少（0.04%），可以忽略不計(jì)，故本試驗(yàn)以總糖得率作為低聚糖得率是準(zhǔn)確可行的。目前，關(guān)于豆豉低聚糖具體組分的研究報(bào)道甚少，尚不明確，豆豉低聚糖的分離純化條件、成分測定及其應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。

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Optim ization of ultrasonic-assisted extraction of Douchi oligosaccharides by response surface methodology

JI Yiping，CHEN Xin，SHEN Ruim in
（College of Food and Biology Science and Technology，Wuhan Institute of Design and Sciences，Wuhan 430205，China）

Using Douchi as raw material，the oligosaccharides extraction technology of ultrasonic-hot water were studied w ith response surface methodology.On the basis of single factor experiment results，four factors and three levels central composite design was conducted w ith ultrasonic time，liquid to material ratio，extraction time and temperature as experimental factors，and then response surface methodology was used to optimize the extraction condition.Results showed that the optimum extraction technology was as follows：ultrasonic time 28 m in，extraction temperature 80℃，time 1.74 h，liquid to material ratio 24∶1（m l∶g）.The yield of oligosaccharides under these conditions could reach up to 3.86%，while the predicted value was 3.91%.The difference of the measured value and predicted values were very small，which indicated that the model had certain application value.

Douchi；oligosaccharides；ultrasonic wave；response surface methodology

TS201．1

0254-5071（2016）05-0129-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．027

2016-01-12

武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院校科研項(xiàng)目（201302）

吉義平（1984-），女，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称饭δ苄猿煞值奶崛〖兓?、檢測及其應(yīng)用。