李明華，孟秀梅，陸正清*，陳　軍

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇淮安223003）

酶法提取金針菇菇腳可溶性膳食纖維的工藝優(yōu)化

李明華，孟秀梅，陸正清*，陳軍

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇淮安223003）

以金針菇菇腳為原料，對(duì)纖維素酶法提取可溶性膳食纖維的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察了液料比、加酶量和酶解時(shí)間對(duì)可溶性膳食纖維提取率的影響，通過(guò)響應(yīng)面法確定最佳提取工藝。結(jié)果表明，在物料粒度80目、液料比19∶1（m L∶g）、加酶量42 U/g、酶解時(shí)間2 h的條件下，金針菇菇腳可溶性膳食纖維的提取率最高，為14.45%。說(shuō)明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶法提取可溶性膳食纖維的工藝是一種行之有效的方法。

金針菇菇腳；可溶性膳食纖維；纖維素酶；響應(yīng)面法

金針菇，學(xué)名毛柄金錢菌（Flammulina velutipes），是我國(guó)最早進(jìn)行人工栽培的食用菌之一，產(chǎn)量?jī)H次于香菇、黑木耳和平菇，位居第四位。金針菇富含蛋白質(zhì)、多糖、膳食纖維以及多種氨基酸、維生素和鐵、鋅、硒等微量元素，具有很高的藥用食療價(jià)值［1］。金針菇除了直接鮮食外，還以其為原料加工成金針菇面條、飲料、果凍、酸奶等食品［2-5］。

在金針菇生產(chǎn)及加工過(guò)程中，產(chǎn)生了大量的菇腳、菌柄等下腳料，這些下腳料含有豐富的蛋白質(zhì)、膳食纖維和多糖等物質(zhì)，但往往不經(jīng)過(guò)處理即直接丟棄，既污染了環(huán)境又造成了極大的資源浪費(fèi)。因此，充分利用金針菇加工副產(chǎn)物勢(shì)在必行。近年來(lái)，已有少量從金針菇下腳料提取生物活性物質(zhì)的報(bào)道，如應(yīng)用微波或超聲輔助法浸提多糖［6-8］、應(yīng)用堿提工藝提取蛋白質(zhì)［9-10］等。此外，黃家莉等［11-12］應(yīng)用堿提法提取了金針菇菇腳中不可溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）和可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）。膳食纖維具有優(yōu)良的生理保健功能［13-15］，在維持膳食平衡方面發(fā)揮著重要作用，被稱為人類“第七大營(yíng)養(yǎng)素”。應(yīng)用堿提法提取膳食纖維除了會(huì)產(chǎn)生大量的廢水外，制備的產(chǎn)品顏色較深，不適合食品、藥品工業(yè)的進(jìn)一步加工［16］。因此，本研究以金針菇菇腳為原料，應(yīng)用纖維素酶法提取SDF，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝參數(shù)，以期為金針菇下腳料的充分利用提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

金針菇菇腳：新鮮金針菇購(gòu)于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，清雜后將菇腳與子實(shí)體切分后備用；復(fù)合蛋白酶（1.5 AU/g）：丹麥諾維信（中國(guó)）投資有限公司；纖維素酶（15 000 U/g）：上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

WR-1恒溫水浴振蕩器：上海思爾達(dá)科學(xué)儀器有限公司；DGG-9246A電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京恒泰豐科試驗(yàn)設(shè)備有限公司；R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申勝生物技術(shù)有限公司；北京中興偉業(yè)儀器有限公司；AL104電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TDL-60B低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1SDF提取工藝流程

金針菇菇腳→清洗→干燥→粉碎→過(guò)篩→蛋白酶水解→滅酶→纖維素酶水解→抽濾取上清液→減壓濃縮→醇沉過(guò)夜→離心分離→醇洗→真空干燥→SDF成品

1.3.2操作要點(diǎn)

取新鮮的金針菇菇腳，清除雜質(zhì)，用自來(lái)水沖洗干凈，瀝干后置于鼓風(fēng)干燥箱80℃烘干，然后將其粉碎，過(guò)分樣篩。取5 g菇腳粉加入20倍質(zhì)量的純凈水，調(diào)pH至6.0后加0.1%復(fù)合蛋白酶，在恒溫振蕩器中40℃酶解，通過(guò)雙縮脲試劑檢測(cè)直至無(wú)紫紅色產(chǎn)生為止，以除去蛋白質(zhì)。除蛋白后，將懸濁液pH調(diào)至4.6，加熱至60℃保持20 min滅酶，冷卻。在冷卻至50℃的混合液中加入適量的纖維素酶，然后在50℃恒溫水浴振蕩器中酶解一定時(shí)間后抽濾，濾液減壓濃縮，再按1∶4（V/V）的比例加入無(wú)水乙醇，靜置過(guò)夜后，5 000 r/m in離心10 min，最后經(jīng)過(guò)5倍體積無(wú)水乙醇洗滌后，真空干燥即得SDF成品。

1.3.3SDF提取率計(jì)算方法

將制備的SDF充分干燥后，準(zhǔn)確稱其質(zhì)量，SDF提取率計(jì)算公式如下：

1.3.4SDF提取的單因素試驗(yàn)

按照商品纖維素酶的使用說(shuō)明，在最適反應(yīng)溫度和pH條件下，分別考察物料粒度（50目、60目、70目、80目、90目、100目）、液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（m L∶g））、加酶量（25 U/g、30 U/g、35 U/g、40 U/g、45 U/g、50 U/g）和酶解時(shí)間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h）對(duì)SDF提取率的影響。

1.3.5SDF提取的響應(yīng)面工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以液料比、加酶量和酶解時(shí)間為變量，以SDF提取率（Y）為響應(yīng)值，應(yīng)用Design Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，然后按照試驗(yàn)方案進(jìn)行試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝，確定最佳工藝參數(shù)。

1.3.6SDF持水力測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.5 g粉碎至60目的SDF粉末于50 m L離心管中，加入25m L純凈水，室溫下均勻攪拌60 min后，4 000 r/min離心10 min，除去上清液，稱量樣品濕質(zhì)量，計(jì)算SDF的持水力，持水力計(jì)算公式如下：

1.3.7SDF膨脹力測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.5 g粉碎至60目的SDF于15 m L刻度試管中，記錄干樣體積，加入10 m L純凈水，振蕩均勻后，室溫靜置24 h，記錄膨脹后的體積，計(jì)算SDF的膨脹力，膨脹力計(jì)算公式如下：

2　結(jié)果與分析

2.1單因素對(duì)SDF提取率的影響

2.1.1物料粒度對(duì)SDF提取率的影響

物料粒度對(duì)SDF提取率的影響如圖1所示。由圖1可知，隨著物料粒度的減小，SDF提取率逐漸提高，在物料粒度為80目時(shí)，提取率基本達(dá)到最大。這是因?yàn)槲锪项w粒越小，其表面積就越大，與酶的接觸越充分，被降解的纖維素越多，相應(yīng)可溶性SDF含量越高。但進(jìn)一步減小物料的粒度，SDF的提取率并沒(méi)有明顯的提高?？紤]到物料顆粒越細(xì)，對(duì)原料粉碎及酶解后抽濾難度越大，因此在后續(xù)研究中，均以過(guò)80目篩的物料為研究對(duì)象。

圖1　物料粒度對(duì)SDF提取率的影響Fig.1 Effect of the material size on the extraction rate of soluble dietary fiber

2.1.2液料比對(duì)SDF提取率的影響

圖2　液料比對(duì)SDF提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of soluble dietary fiber

液料比對(duì)SDF提取率的影響如圖2所示。由圖2可知，液料比對(duì)SDF提取率的影響比較顯著。液料比越高，反應(yīng)體系黏度越低，越有利于底物的水解及SDF的擴(kuò)散，反應(yīng)越充分，在液料比為20∶1（m L∶g）時(shí)，SDF提取率最高，達(dá)13.18%。但在反應(yīng)體系中，纖維素酶添加量一定，過(guò)高的液料比反而會(huì)降低酶的濃度，不利于底物與酶的接觸，從而降低底物的水解率，使SDF提取率呈下降趨勢(shì)。另外，液料比越大，后期的真空濃縮工作量越大，耗能越高，因此，為了保證試驗(yàn)效果、降低工作量和減少耗能，液料比選擇20∶1（m L∶g）為宜。

2.1.3加酶量對(duì)SDF提取率的影響

加酶量對(duì)SDF提取率的影響如圖3所示。由圖3可知，SDF提取率隨著纖維素酶添加量的增大逐漸提高，在加酶量為40 U/g時(shí)，SDF提取率達(dá)到最大13.23%；繼續(xù)增加纖維素酶添加量，SDF提取率不再提高，反而有所下降。這是因?yàn)槭惺鄣睦w維素酶多為復(fù)合酶，具有內(nèi)切、外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性，既可以降解纖維素轉(zhuǎn)變?yōu)镾DF，也可將之進(jìn)一步降解為不能被乙醇沉淀的纖維二塘和單糖［16］，同時(shí)該類小分子糖又會(huì)抑制纖維素酶內(nèi)切酶活性。因此，加酶量過(guò)大，反而導(dǎo)致SDF提取率逐漸下降。因此選擇加酶量40 U/g為宜。

圖3　加酶量對(duì)SDF提取率的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on the extraction rate of so luble dietary fiber

2.1.4酶解時(shí)間對(duì)SDF提取率的影響

圖4　酶解時(shí)間對(duì)SDF提取率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on the extraction rate of soluble dietary fiber

酶解時(shí)間對(duì)SDF提取率的影響如圖4所示。由圖4可知，酶解時(shí)間顯著影響SDF提取率，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，SDF提取率先升后降。在酶解前期，反應(yīng)體系中底物濃度高而可溶性多糖含量低，有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行，且反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，酶解越充分，SDF的提取率就越高，且在酶解3 h時(shí)達(dá)到最高，為13.45%。繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，酶在高溫下逐漸失活，且SDF更多的被酶解為小分子的糖，導(dǎo)致提取率逐漸降低。因此選擇酶解時(shí)間3 h為宜。

2.2響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性分析

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，在纖維素酶的最適反應(yīng)溫度和pH條件下，液料比、加酶量和酶解時(shí)間均對(duì)SDF提取率影響顯著，因此以以上3個(gè)因素作為變量，以SDF提取率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定SDF提取的最佳反應(yīng)條件。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1　響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

將表2的試驗(yàn)結(jié)果采用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到關(guān)于SDF提取率對(duì)液料比、加酶量和酶解時(shí)間的二次多元回歸方程：

Y=14.45-0.094A-0.069B-0.1C+0.012AB-0.003AC-0.2BC-0.16A2-0.17B2-0.087C2

表3　回歸模型方差分析Table 3 Va riance ana lysis of regression m odel

由SDF提取率的二次回歸模型方差分析（表3）可知，模型P=0.000 3＜0.01，達(dá)到了極顯著水平，模型P=0.000 3＜ 0.01，達(dá)到了極顯著水平，且失擬項(xiàng)P=0.906 8＞0.05，不顯著，說(shuō)明模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值擬合較好，可用回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)值對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。另外，該模型的決定系數(shù)R2=0.964 6，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.919 1，變異系數(shù)為0.41，說(shuō)明模型擬合度較好，試驗(yàn)誤差小，可用該模型預(yù)測(cè)SDF在不同工藝條件下的提取率。由方差分析結(jié)果還可以看出，各因素對(duì)SDF提取率的影響大小依次為：酶解時(shí)間＞液料比＞加酶量；方程中一次項(xiàng)A、C，二次型A2、B2和交互項(xiàng)BC對(duì)SDF提取率影響極顯著，B和C2影響顯著，這表明除了一次項(xiàng)外，二次項(xiàng)和交互項(xiàng)對(duì)SDF提取率也有影響。

2.2.2響應(yīng)面及等高線分析

響應(yīng)面及等高線圖能夠直觀地反映出各因素間交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響程度，曲面越陡，等高線越密集，影響越顯著［17］。液料比、加酶量和酶解時(shí)間交互作用對(duì)SDF提取率影響的響應(yīng)面和等高線見圖5。由圖5可知，加酶量和酶解時(shí)間的交互作用對(duì)SDF提取率的影響極顯著，而料液比與加酶量、料液比與酶解時(shí)間的交互作用影響不顯著，這與表3中的分析結(jié)果相一致。

圖5　液料比、加酶量和酶解時(shí)間交互作用對(duì)SDF提取率影響的響應(yīng)面及等高線Fig．5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between liquid-solid ratio，enzyme addition and enzymolysis time on so luble dietary fiber extraction rate

2.3提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)過(guò)軟件分析可知，當(dāng)液料比為19.06∶1（m L∶g），加酶量為41.78 U/g，酶解時(shí)間為2.02 h時(shí)，應(yīng)用纖維素酶提取金針菇菇腳SDF提取率最高，達(dá)到14.50%。為便于實(shí)際操作，分別選取液料比、加酶量和酶解時(shí)間為19∶1（m L∶g）、42 U/g和2 h，在此條件下進(jìn)行提取試驗(yàn)，以驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，3次平行試驗(yàn)中SDF提取率的平均值為14.45%，與理論預(yù)測(cè)值相差不大，且高于堿提法金針菇菇腳SDF的提取率［12］。由此可見，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取金針菇菇腳SDF的工藝條件是準(zhǔn)確和可行的。

2.4SDF性質(zhì)測(cè)定

膳食纖維分子中含有大量的親水基團(tuán)，具有較高的持水力和膨脹力，該性能為衡量膳食纖維品質(zhì)優(yōu)劣的兩個(gè)重要指標(biāo)，持水力和膨脹力越大，其生理活性和加工特性越好［18］。經(jīng)測(cè)定，本實(shí)驗(yàn)從金針菇菇腳制備的SDF持水力為3.52 g/g，膨脹力為5.64 m L/g，均高于胡春曉等［19］提取的香菇柄SDF的持水力和膨脹力，持水力高于但膨脹率低于吳素蕊等［12］提取的金針菇菇腳SDF。

3　結(jié)論

在纖維素酶法提取金針菇菇腳SDF的過(guò)程中，液料比、加酶量和酶解時(shí)間均對(duì)SDF提取率有顯著影響。在物料粒度為80目時(shí)，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到了金針菇菇腳SDF最佳提取工藝參數(shù)，即液料比19∶1（m L∶g），加酶量42 U/g，酶解時(shí)間2 h，在此工藝條件下，金針菇菇腳SDF提取率為14.45%，與理論值基本相符。與堿提法相比，纖維素酶法條件溫和、提取率高、產(chǎn)品品質(zhì)好，為綜合利用金針菇下腳料提供了理論依據(jù)。

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Optim ization of enzymatic extraction conditions for soluble dietary fiber from Flammulina velutipes feet

LI M inghua，MENG Xiumei，LU Zhengqing*，CHEN Jun
（School of Biological and Chem ical Engineering，Jiangsu Food&Pharmaceutical Science College，Huai′an 223003，China）

Using the Flammulina velutipes feet as raw material，the cellulase extraction conditions of soluble dietary fiber were optim ized.On the basis of single factor experiments，the effects of liquid-solid ratio，enzyme addition and enzymolysis time on extraction rate of soluble dietary fiber were investigated.And the optimum extraction conditions were optim ized by response surface methodology.The results showed that the optimum conditions were particle size 80 mesh，liquid-solid ratio 19∶1（m l∶g），enzyme 42 U/g and enzymolysis time 2 h.Under the conditions，the extraction rate of soluble dietary fiber in F.velutipes feet was up to 14.45%，which indicated that it was a very effective method to optim ize cellulase extraction conditions for soluble dietary fiber by response surface methodology.

Flammulina velutipes feet；soluble dietary fiber；cellulase；response surface methodology

TS201．1

0254-5071（2016）05-0119-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．025

2016-03-14

食用藥用真菌產(chǎn)業(yè)科技公共服務(wù)平臺(tái)（HAP201414）

李明華（1977-），男，講師，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物活性成分。

陸正清（1967-），男，教授，碩士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵食品。