郭　麗　孫　琳　郭　琰　李勤靜　吳喜蓉　劉　芳　李穎佳　王杏云　王　婷

徐保平1　馮雪莉1　申阿東1

?

·論著·

肺炎支原體RNA檢測在兒童肺炎支原體肺炎療效監(jiān)測中的應(yīng)用價值

郭麗1,2孫琳1郭琰1李勤靜1吳喜蓉1劉芳1李穎佳1王杏云1王婷1

徐保平1馮雪莉1申阿東1

目的探討應(yīng)用肺炎支原體RNA檢測(RNA實時熒光恒溫擴增技術(shù),MP-SAT)作為兒童肺炎支原體肺炎(MPP)治療效果監(jiān)測指標的可行性和應(yīng)用價值。方法 納入北京市平谷區(qū)婦幼保健院住院的社區(qū)獲得性肺炎患兒，其中符合MPP診斷標準者為MPP組，余為非MPP組。①以血清肺炎支原體(MP)抗體(MP-Ab)檢測為診斷MP感染的參照試驗，考察MP-SAT診斷MP感染的敏感度和特異度。②對MP-SAT和血清MP-Ab均陽性MPP病例行動態(tài)觀察，比較MP-SAT和血清MP-Ab在大環(huán)內(nèi)酯類藥物標準治療不同時間的陽性率， MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間和臨床痊愈時間。③比較不同MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間MPP病例發(fā)熱時間、入院24 h內(nèi)血常規(guī)(WBC、N、L)，超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)和血清乳酸脫氫酶(LDH)及胸部X線指標的差異。結(jié)果MPP組73例，非MPP組150 例。MP-SAT診斷MP感染的敏感度和特異度分別為83.6%(61/73)、97.3%(146/150)。MPP組MP-SAT和血清MP-Ab均陽性61例，隨治療時間的延長，MP-SAT陽性率顯著降低(P<0.05)，而血清MP-Ab的陽性率呈增高趨勢(P<0.05)。61例臨床痊愈時間平均為(3.0±0.9)周，MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間為(3.3±0.8)周，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間越長的病例表現(xiàn)為發(fā)熱持續(xù)時間越長，入院24 h內(nèi)中性粒細胞百分比、CRP、LDH水平越高，X線胸片大片實變比例越高，淋巴細胞百分比越低 (P<0. 05)。結(jié)論MP-SAT可作為評價MPP 轉(zhuǎn)歸以及判斷大環(huán)內(nèi)酯類藥物療效的指標。

肺炎支原體；社區(qū)獲得性肺炎；RNA檢測；診斷；臨床療效；兒童

肺炎支原體(MP) 引起的肺炎支原體肺炎(MPP)占住院兒童社區(qū)獲得性肺炎(CAP)的10%～40%[1,2]。既往認為MP感染病情一般較輕，對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素效果好，或呈自限性。但近年來發(fā)現(xiàn)MP 感染所致的大葉性肺炎逐漸增多，且病情較重，部分病例治療棘手[3,4]。目前，血清MP抗體(MP-Ab)檢測是臨床最常用的診斷MP感染方法，但MP感染后數(shù)月抗體仍能持續(xù)存在，無法準確反映藥物的療效和預后。

作為肺炎支原體RNA檢測技術(shù)之一，RNA實時熒光恒溫擴增技術(shù)(SAT)直接以病原體特異性RNA為擴增靶標，具無創(chuàng)性、操作簡單和快速等特點。SAT屬于活菌檢測技術(shù)，在死亡的病原體中幾乎檢測不到RNA。目前已成功應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌、沙門菌屬、 腸道輪狀病毒和泌尿生殖道沙眼衣原體等病原的檢測[5～8]，然而SAT應(yīng)用于兒童MPP檢測尚未見報道。

1　方法

1.1研究設(shè)計以MP-Ab檢測作為MPP診斷的參照試驗，考察MP-SAT的診斷準確性；采集兩者均陽性的病例于入院后24 h內(nèi)，治療后1、2、3、4和5周MP-SAT檢測數(shù)據(jù)，分析MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性。

1.2診斷標準CAP診斷依據(jù)《實用兒科學》第7版[9]和“兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南(2013年修訂版)”[10]，本文MPP的診斷標準滿足以下任意1項：①入院24 h內(nèi)MP-Ab≥1∶160；②大環(huán)內(nèi)酯類抗生素標準治療方案治療4周內(nèi)每周行MP-Ab檢測，雙份血清≥4倍升高。

1.3臨床痊愈標準發(fā)熱、咳嗽等臨床癥狀消失，胸部X 線好轉(zhuǎn)、滲出基本吸收，血常規(guī)及CRP檢查結(jié)果恢復正常。

1.4納入和排除標準①北京市平谷區(qū)婦幼保健院(我院)住院的符合CAP診斷患兒；②排除患有肺結(jié)核、免疫功能低下、院外已經(jīng)應(yīng)用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療和首次MP-SAT陽性但未行復測的患兒。

1.5MP-Ab滴度測定血清標本以顆粒凝集法檢測MP抗體。按照SERODIA-MycoⅡ試劑盒使用說明書(日本富士瑞必歐株式會社)操作。

1.6MP-SAT檢測方法醫(yī)用棉簽取咽部分泌物，將拭子頭置于1 mL生理鹽水浸泡貼管壁擠干，取500 μL加入到500 μL裂解液中備用。送至首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院兒研所檢測。

采用MP核酸檢測試劑盒(購自上海仁度生物科技有限公司)，待測樣本加400 μL裂解液，陰性、陽性對照與待測樣本同步進行，加入洗滌液洗滌2次，每管加入40 μL擴增反應(yīng)液，震蕩混勻，取30 μL磁珠懸液至微量反應(yīng)管中，60℃溫浴10 min，42℃溫浴5 min，每孔加入10 μL SAT酶，放入核酸擴增儀檢測。反應(yīng)程序：熒光通道設(shè)定為FAM，每個循環(huán)為42℃ 1 min，共40個循環(huán)；每分鐘采集熒光信號1次，共檢測40次；從40℃～80℃行溶解曲線分析。樣本曲線與閾值曲線交叉點的橫坐標讀數(shù)(監(jiān)測時間)為dt，dt≤35 min為陽性，dt>40 min為陰性；在35～40 min的樣本重新檢測，dt≤35 min為陽性，dt>35 min為陰性。

1.7MPP治療方案我院MPP常規(guī)治療為予阿奇霉素10 mg·kg-1·d-1，每日1次，首個療程靜脈滴注5 d，第2、3或4個療程根據(jù)病情靜脈滴注或口服3 d，間隔時間為3 d。

1.8觀察指標①基于入院24 h內(nèi)第1次MP-SAT檢測的診斷參數(shù)；②MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間和臨床痊愈時間；③MP-SAT 5周內(nèi)(每周1次)持續(xù)陽性病例的發(fā)熱時間，入院24 h內(nèi)血常規(guī)(WBC、N、L)，超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)，血清乳酸脫氫酶(LDH)及胸部X線指標。

1.9統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料采用百分比表示，陽性率比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法。非正態(tài)分布資料以中位數(shù)(P25～P75)表示，組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗。計算MP-SAT診斷MPP的敏感度、特異度、陰性預測值和陽性預測值及其95%CI。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。臨床痊愈時間和MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間采用GraphPad Prism 5軟件制作生存曲線。

2　結(jié)果

2.1一般情況2014 年12 月至2015 年9月我院收治CAP患兒264例，其中233例符合納入標準進入分析(圖1)，MPP 73例，年齡(4.9±2.7)歲 ，男33例；非MPP 150 例，年齡(4.3±2.0)歲， 男73例。 兩組年齡、性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1研究對象篩選流程

2.2MP-SAT診斷MPP的參數(shù)以MP-Ab為參照試驗，MP-SAT診斷MP感染的真陽性值、真陰性值、假陽性值、假陰性值分別為61、146、12和4例；敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及其95%CI分別為83.6%(73.1%～91.2%)、97.3%(93.3%～99.3%)、93.8%(84.9%～96.3%)和92.4%(87.1%～96.1%)。

2.3MP-SAT和MP-Ab在不同觀察時點MP檢出率MP-SAT和血清MP-Ab同時陽性61例。表1顯示，MP-SAT檢出率隨大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療時間的延長顯著降低(P<0.05)，4周時點陽性率僅6.6%；MP-Ab陽性率呈增高趨勢，至3周和4周，陽性率升至100%；2周時點MP-SAT和MP-Ab檢出率差異無統(tǒng)計學意義，余時點的差異均有統(tǒng)計學意義。

2.4MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間與臨床痊愈時間的相關(guān)性圖2顯示，61例MP-SAT和血清MP-Ab均陽性病例的臨床痊愈時間為(3.0±0.9)周，MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間為(3.3±0.8)周，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.78，P>0.05)。

表1MP-SAT陽性肺炎支原體肺炎病例不同時點MP-Ab和MP-SAT檢出率[n(%)]

治療時間MP-SAT(n=61)MP-Ab(n=61)χ2P<24h61(100)34(55.7)34.67<0.011周60(98.4)40(65.6)22.18<0.012周52(85.5)59(96.7)4.890.0543周24(39.3)61(100)53.11<0.014周4(6.6)61(100)106.99<0.015周0未測--χ2185.0780.62P0.010.01

圖2MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間與臨床痊愈時間比較

2.5MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間與MPP嚴重程度的相關(guān)性表2顯示，MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間越長的病例表現(xiàn)為發(fā)熱持續(xù)時間越長，入院24 h內(nèi)中性粒細胞百分比、CRP、LDH水平越高，X線胸片肺大片實變比例越高，淋巴細胞百分比越低，5個時點間差異有統(tǒng)計學意義(P<0. 05)。

表2MP-SAT不同轉(zhuǎn)陰時間肺炎支原體肺炎患兒的臨床癥狀、影像學及實驗室指標比較[n(%)，M(P25,P75)]

指標MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間1周(n=1)2周(n=8)3周(n=28)4周(n=20)5周(n=4)χ2P發(fā)熱天數(shù)/d12(0,3)3.5(3,4)6(5,6)6.5(5.3,7)42.81<0.01X線胸片大片肺實變0(0)0(0)2(7.1)5(25)4(100)16.96<0.01外周血WBC/×109·L-16.77.5(6.0,10.6)9.5(7.4,10.8)9.1(7.8,11.7)8.1(6.2,9.7)3.25>0.05淋巴細胞0.360.36(0.28,0.42)0.30(0.27,0.36)0.29(0.23,0.33)0.15(0.084,0.26)10.68<0.05中性粒細胞0.530.55(0.52,0.61)0.59(0.53,0.66)0.66(0.58,0.71)0.83(0.64,0.89)12.97<0.05CRP/mg·L-129.5(8.3,13.8)12(5.3,17.0)15.5(10,24.8)28.5(11.3,48.0)10.80<0.05乳酸脫氫酶/U·L-1156213(146,250)232(201,299)243(183,291)302(271,384)9.86<0.05

3　討論

MPP具臨床表現(xiàn)多樣，病程長和反復等特點，易發(fā)生肺外并發(fā)癥，故探索一種直接、快速、操作簡便方法，實時監(jiān)測兒童MPP治療效果，有較重要的臨床意義。MP-SAT作為建立在RNA恒溫擴增技術(shù)和實時熒光檢測技術(shù)基礎(chǔ)上的新一代核酸檢測技術(shù)，其優(yōu)點在于以MP RNA為靶標進行恒溫擴增檢測。由于RNA僅在活菌中存在，MP死亡后RNA快速降解，因此該方法的陽性可提示MP的近期感染，而不是既往感染。本研究以MP-Ab為診斷MP感染的參考標準，顯示MP-SAT的敏感度和特異度分別為83.6%和97.3%，提示其具有較好的診斷價值，且特異度非常高，陰性可排除MP感染。同時隨著治療病情好轉(zhuǎn)，體內(nèi)MP被殺滅后RNA快速降解，可用于MPP的預后判斷。本研究結(jié)果顯示， 3～4周規(guī)范大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療過程中，MP-SAT陽性率隨入院治療時間的延長顯著降低，治療3周時點其陽性率明顯下降(39.3%)，4周時點MP-SAT陽性率為6.6%；而傳統(tǒng)的血清MP-Ab檢測由于在MP感染的早期存在窗口期，隨治療療程延長其滴度反而持續(xù)升高，在入院后<24 h和1周內(nèi)的陽性率較低(約60%)，在2周及之后時點其陽性率顯著升高(>95%)。

兒科應(yīng)用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的療程2 ～3周, 但因考慮停藥過早易復發(fā), 總療程常達3～4周。目前，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素停藥主要依據(jù)臨床癥狀消失、肺部炎癥基本消失及炎性指標恢復正常[11]，仍缺乏客觀的停藥指征。本研究結(jié)果顯示，MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間與臨床痊愈時間更為接近，兩者差異無統(tǒng)計學意義，提示MP-SAT 動態(tài)變化可為臨床動態(tài)觀察大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療效果提供依據(jù)。MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間長可能與體內(nèi)MP不易清除和存在較強的免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)[12]，為此本研究還探討MPP患兒MP-SAT檢測結(jié)果與臨床癥狀、實驗室指標和X線胸片的相關(guān)性。結(jié)果顯示，發(fā)熱持續(xù)時間，入院24 h內(nèi)中性粒細胞百分比、CRP、X線胸片大片肺實變與MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間成正相關(guān)，均提示轉(zhuǎn)陰時間越長，患兒入院時的炎癥反應(yīng)越嚴重；此外，MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間越長，淋巴細胞百分比越低，可能與MP感染后免疫抑制有關(guān)[13]，淋巴細胞數(shù)量減低者可能對MP更為易感，發(fā)病后更易進展為肺炎[14,15]。同時LDH水平亦與MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間呈正相關(guān)，考慮可能病情嚴重導致的全身組織器官炎癥損害嚴重，重癥感染致使機體處于高碳酸血癥和缺氧狀態(tài)，缺氧時細胞膜通透性增加，使LDH從細胞內(nèi)釋放至血液中[16]。提示對這部分病例臨床延長大環(huán)內(nèi)酯類抗生素療程及應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)治療可能會減輕相關(guān)臨床癥狀和減少后遺癥的發(fā)生。

綜上，MP-SAT與MPP的疾病嚴重程度相關(guān)性較好，可作為評價MPP轉(zhuǎn)歸以及判斷大環(huán)內(nèi)酯類藥物療效的指標。

[1] Jain S，Williams DJ，Arnold SR，et al．Community-acquired pneumonia requiring hospitalization among U．S．children．N Engl J Med，2015，372(9):835-845

[2] Liu WK，Liu Q，Chen de H，et al．Epidemiology of acute respiratory infections in children in Guangzhou:a three-year study．PLoS One，2014，9(5):e96674

[3]趙順英，馬云，張桂芳，等．兒童重癥肺炎支原體肺炎11例臨床分析．中國實用兒科雜志，2003，18(7):414-416

[4]俞珍惜，劉秀云，江載芳．兒童重癥肺炎支原體肺炎急性期的相關(guān)因素分析．實用兒科臨床雜志，2011，26(4):246-248

[5]楊景卉，陳晉升．實時熒光核酸恒溫擴增技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價值．臨床肺科雜志，2015，2(20):199-200

[6]肖征，劉秀貞．恒溫擴增核酸法檢測沙門菌屬效果分析．中華醫(yī)院感染學雜志，2012，22(22):5167-5169

[7]徐德順，陳莉萍，朱曉娟，等．依賴核酸擴增技術(shù)在輪狀病毒檢測中的應(yīng)用．中國預防醫(yī)學雜志，2015，4(16):275-278

[8]陳婷婷，錢煦岱，包文婷，等．SAT技術(shù)檢測解脲脲原體和沙眼衣原體核酸在泌尿生殖道感染中的應(yīng)用．中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，4(28):271-272

[9]胡亞美，江載芳，諸福棠．實用兒科學．第7版．北京:人民衛(wèi)生出版社．2002．1204-1205

[10]中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組，爯中華兒科雜志爲編輯委員會．兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南(2013 修訂) (上) ．中華兒科雜志)，2013，51(10):745-752

[11]中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組，爯中華實用兒科臨床雜志爲編輯委員會．兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識(2015年版) ．中華實用兒科臨床雜志，2015，17(30):1304-1308

[12]康妍萌，丁明杰，韓玉玲，等．重癥肺炎支原體肺炎患兒肺泡灌洗液中Th1 /Th2 細胞免疫應(yīng)答狀況的研究．中國當代兒科雜志，2011，13(3):188-190

[13] Stelmach I，Podsiadlowicz-Borzecka M，Grzelewski T，et al．Humoral and cellular immunity in children with Mycoplasma pneumoniae infection:a 1-year prospective study．Clin Diagn Lab Immunol，2005，12(10):1246-1250

[14] Youn YS，Lee KY，Hwang JY，et al．Difference of clinical features in childhood Mycoplasma pneumoniae pneumonia．BMC Pediatr，2010，10:48

[15] Klement E，Talkington DF，Wasserzug O，et al．Identification of risk factors for infection in an outbreak of Mycoplasma pneumoniae respiratory tract disease．Clin Infect Dis，2006，43(10):1239-1245

[16]張宇，孫景輝，韓燕燕．血清乳酸脫氫酶變化在嬰幼兒重癥肺炎中的診斷價值．中國實驗診斷學，2011，15(1):144-145

(本文編輯：丁俊杰)

SHEN A-dong，E-mail:shenad16@hotmail.com; FENG Xue-li，E-mail:13901212405@sina.com

Objective To evaluate the clinical utility ofMycoplasmapneumoniaRNA detection (real-time isothermal transcription-mediated RNA amplification assay, MP-SAT) in the treatment ofMycoplasmapneumoniaepneumonia in children.MethodsChildren with community-acquired pneumonia in Beijing Pinggu District Maternal and Child Health Care Hospital, according to theMycoplasmapneumoniaediagnostic criteria，were divided into theMycoplasmapneumoniaepneumonia and non-Mycoplasmapneumoniaepneumonia groups. ①When the results of serological tests were considered as the standard，the sensitivity and specificity of MP-SAT were evaluated. ②MP - SAT and serum MP -Ab positive cases were observed dynamically，the detection rate of MP-SAT and MP-Ab in different treatment course and the times of MP-SAT turning to negative and clinical recovery were compared. ③The differences of fever duration after macrolide administration，blood routine inspection (WBC, N, L), hypersensitive c-reactive protein (hs-CRP), serum lactate dehydrogenase (LDH) and the imaging results admitted to hospital within 24 hours were compared.ResultsMycoplasmapneumoniaepneumonia group included 73 cases, non-Mycoplasmapneumoniaepneumonia group included 150 cases. The sensitivity, specificity of MP-SAT were 83.6%(61/73) and 97.3%(146/150),respectively. Children with both MP-SAT and MP-Ab positive results were followed to evaluate the treatment effect. After the treatment, the detection rate of SAT reduced significantly (P<0.05), while detection rate of serum MP-Ab increased significantly (P<0.05). The time of clinical recovery was (3.0±0.9) weeks, similar to that of MP-SAT turning to negative(3.3±0.8) weeks (P>0.05). Those with longer time of turning to negative had a longer fever duration after macrolide administration，increasing neutrophil，decreasing lymphocyte， higher level CRP and LDH, and large field of consolidation were more frequently observed on X-ray film (P<0.05).ConclusionMP-SAT can be used as an index for evaluation of the treatment outcome of MPP.

Mycoplasmapneumoniae；Community-acquired pneumonia；RNA detection;Diagnosis;Clinical effect;Children

10.3969/j.issn.1673-5501.2016.02.005

國家科技支撐計劃: 2013BAI09B11; 首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項:2014-1-2094,2016-1-2092

1 首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院，北京市兒科研究所，兒科學國家重點學科，教育部兒科重大疾病研究重點實驗室，兒童呼吸道感染性疾病研究北京市重點實驗室北京，100045；2 北京市平谷區(qū)婦幼保健院北京，101200

申阿東，E-mail:shenad16@hotmail.com; 馮雪莉，E-mail:13901212405@sina.com

Clinical value of Mycoplasma pneumoniae RNA detection in the monitoring of Mycoplasma pneumoniae pneumonia treatment in children

GUOLi1,2,SUNLin1,GUOYan1,LIQin-jing1,WUXi-rong1,LIUFang1,LIYing-jia1,WANGXing-yun1,WANGTing1,XUBao-ping1,FENGXue-li1,SHENA-dong1(1DepartmentofRespiratory,BeijingChildren′sHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingKeyLaboratoryofPediatricRespiratoryInfectionDiseases;KeyLaboratoryofMajorDiseasesinChildrenandNationalKeyDisciplineofPediatrics(CapitalMedicalUniversity),MinistryofEducation;NationalClinicalResearchCenterforRespiratoryDiseases;RespiratoryInfectionDiseasesLab,BeijingPediatricResearchInstitute,BeijingChildren′sHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing, 100045; 2MaternalandChildHealthCareCenterofPingguDistrict;Beijing101200,China)

2016-02-18

2016-03-23)