王文婷,　趙　偉,　章魁普,　黎　亮,　郭美錦

(1.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237;2.山東福洋生物科技有限公司,山東 德州 253100)

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不同來源葡萄糖氧化酶的分離純化及其生物催化特性

王文婷1,趙偉2,章魁普1,黎亮1,郭美錦1

(1.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237;2.山東福洋生物科技有限公司,山東 德州 253100)

采用離子交換層析法對4種不同來源的葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD,EC 1.1.3.4)進(jìn)行分離純化,純化后酶的相對分子質(zhì)量約為130 kDu,為雙亞基酶。純化后的4種酶的酶學(xué)性質(zhì)相對穩(wěn)定,對pH有較寬的響應(yīng)范圍。溫度為20～50 ℃時(shí),隨著溫度的升高酶活降低且穩(wěn)定性較好;溫度為55 ℃時(shí)穩(wěn)定性較差;而在60 ℃時(shí)則失活。金屬離子如Fe2+、Co2+、Mg2+和Cu2+對4種酶都有較強(qiáng)的抑制作用,Fe2+的抑制尤其明顯,而螯合劑EDTA可以激活酶的活性。在30 ℃、pH為7.0的條件下,以不同濃度(20～100 mmol/L)的葡萄糖為底物分別測定4種酶的米氏常數(shù)(Km)和催化常數(shù)(Kcat)。通過光譜和色譜對4種葡萄糖氧化酶進(jìn)行檢測,雖然氨基酸組成有明顯不同,但二維結(jié)構(gòu)基本一致,而GOD前體goxC和修飾蛋白如過氧化氫酶、過氧化氫酶前體和Pc16g04630等可能是提高GOD催化效率和工業(yè)應(yīng)用的分子基礎(chǔ)。

葡萄糖氧化酶; 純化; 生物催化特性; 氨基酸序列分析

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD,EC 1.1.3.4)是一種需氧脫氫酶,能夠在有氧條件下高度專一性地將β-D-葡萄糖氧化成δ-D-葡萄糖酸內(nèi)酯和過氧化氫,然后δ-D-葡萄糖酸內(nèi)酯以一種非酶促反應(yīng)自發(fā)水解成β-D-葡萄糖酸,而過氧化氫酶將過氧化氫分解生產(chǎn)水和氧[1]。GOD廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)。目前應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中的主要是青霉素和黑曲霉兩種[2-3],其中黑曲霉的應(yīng)用更為廣泛。由于GOD天然無毒、無副作用,因而在食品工業(yè)、醫(yī)療診斷、生物傳感器方面有著廣泛的應(yīng)用[4-6]。

葡萄糖酸的生產(chǎn)可以追溯到1870年Hlasiwetz和Habermann發(fā)現(xiàn)了葡萄糖酸[7]。葡萄糖酸是由葡萄糖通過一個(gè)簡單的葡萄糖氧化酶催化脫氫反應(yīng)產(chǎn)生。生產(chǎn)葡萄糖酸的方法有許多種,如化學(xué)、電化學(xué)、生物化學(xué)和生物電化學(xué)[8-9]。目前,發(fā)酵是一個(gè)高效且廣泛使用的生產(chǎn)葡萄糖酸的技術(shù),用酶法生產(chǎn)葡萄糖酸已經(jīng)成為一種趨勢。葡萄糖酸鈉的工業(yè)生產(chǎn)多采用發(fā)酵法。將黑曲霉作為出發(fā)菌株,通過逐步擴(kuò)大培養(yǎng),用發(fā)酵代謝的葡萄糖氧化酶催化葡萄糖生成葡萄糖酸。然而發(fā)酵過程易受細(xì)菌、工藝變化等因素的影響。而酶法生產(chǎn)可直接利用GOD催化葡萄糖生成葡萄糖酸鈉。但是葡萄糖氧化酶在pH 4～6以及40 ℃的條件下僅可以穩(wěn)定2 h。這使得酶法生產(chǎn)葡萄糖酸工業(yè)化變得十分困難。本文對4種不同來源的葡萄糖氧化酶進(jìn)行分離純化并在純化后比較其酶學(xué)性質(zhì),為其工業(yè)化應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶NV1和高溫葡萄糖氧化酶NV2均購自諾維信公司; 葡萄糖氧化酶sGOD購自山東隆大生物技術(shù)公司,該酶為用DNA shuffling分子進(jìn)化法改造而來;液體發(fā)酵葡萄糖氧化酶rGOD系自行設(shè)計(jì)合成。4種葡萄糖氧化酶均來自黑曲霉(Aspergillusniger)。

1.1.2試劑DEAE-FF填料、BCA試劑盒、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、SDS、EDTA均為生工生物工程有限公司產(chǎn)品; 鄰聯(lián)茴香胺、辣根過氧化物酶均為上海源聚生物科技有限公司產(chǎn)品; 葡萄糖酸鈉為梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品; 其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3儀器Mini-PROTEIN垂直電泳槽(Bio-Rad科技有限公司);生物電泳圖像分析系統(tǒng)(上海復(fù)日科技有限公司);紫外可見分光光度計(jì)(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);電熱恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);J-810圓二色譜儀(日本分光(JASCO)公司);ZHWY-3212回旋振蕩搖瓶機(jī)(上海智誠分析儀器制造有限公司)。

1.2方法

1.2.1酶分離純化方法將離子交換劑DEAE Sepharose FF的上清液倒去,與緩沖液按體積比為3∶1混勻后裝柱,在裝柱的過程中應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。用10個(gè)柱體積的0.05 mol/L pH 7.1的Tris-HCl緩沖溶液平衡離子交換層析柱,流速為1 mL/min。將過濾后的粗酶液以0.2 mL/min的速度泵入柱子中。用0～0.3 mol/L NaCl(用0.05 mol/L pH 7.1的Tris-HCl緩沖溶液配制)進(jìn)行梯度洗脫,流速為0.7 mL/min。每管收集8 mL,層析完成后收集GOD活性管,用透析袋脫鹽后冷凍備用。離子交換柱用1 mol/L的NaCl緩沖溶液重生后,用φ=20%的乙醇溶液4 ℃冷藏保存。

1.2.2酶活力的測定葡萄糖氧化酶酶活的定義:在pH=5.6,溫度為30 ℃的條件下,每分鐘催化1 μmol葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸和過氧化氫所需的葡萄糖氧化酶的量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。

參照文獻(xiàn)[10],在試管中分別加入2.4 mL、0.21 mol/L的鄰聯(lián)茴香胺,0.5 mL、1 g/L的葡萄糖溶液和0.1 mL、0.1 g/L的辣根過氧化酶,搖勻后,在35 ℃下水浴5 min。檢測時(shí)加入0.1 mL樣品,于波長500 nm處每30 s記錄吸光度(A500 nm)。以A500 nm對時(shí)間作圖,找出最大斜率ΔA(min)。根據(jù)下式計(jì)算葡萄糖氧化酶的酶活。

式中:V1為反應(yīng)液總體積,mL;V2為所加樣品液體積,mL;7.5為氧化型鄰聯(lián)茴香胺的消光系數(shù)。

1.2.3酶蛋白濃度的測定用Bradford等[11]方法測定蛋白質(zhì)含量,以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.4酶學(xué)性質(zhì)研究

(1) 最適pH。30 ℃下,分別測定純化前后不同GOD在不同pH (3～10)緩沖液下的酶活。

(2) 最適溫度。在pH=7.0的緩沖液中,分別測定純化前后不同GOD在不同溫度(4～60 ℃)下分別保溫4,8,12,24 h的酶活。

(3) 金屬離子活性劑對酶活的影響。在30 ℃,pH=7.0的條件下,將純化前后不同的GOD分別與20 mmol/L的Mg2+,Fe2+,Cu2+,Co2+,Mn2+,Ca2+,Zn2+以及SDS,EDTA溶液混合,探討各種金屬離子及活性劑對酶活的影響。

(4) GOD的Km,Kcat測定。在30 ℃,pH=7.0的條件下,以不同濃度(20～100 mmol/L)的葡萄糖為底物,測定其酶活,并按雙倒數(shù)法(Lineweaver-Burk法[12])作圖,求出其米氏常數(shù)(Km)及最大反應(yīng)速率(Vmax),并根據(jù)酶濃度計(jì)算其催化常數(shù)(Kcat)。

(5) 不同GOD的原二色譜檢測。將GOD分別稀釋至低于1.0 g/L,用圓二色譜檢測并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

(6) 不同GOD的Moldi-TOF-TOF檢測。將純化后的GOD分別進(jìn)行蛋白電泳,將所需的條帶切下送至生工生物工程有限公司進(jìn)行Moldi-TOF-TOF檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1葡萄糖氧化酶的分離純化

4個(gè)不同來源的GOD純化前蛋白電泳圖如圖1所示,可以看出GOD均有一些雜帶。Marker的條帶大小從上至下分別為200.0,116.0,97.2,66.4,44.3,29.0,20.1,14.3、6.5 kDu。

圖1　層析前4種GOD的蛋白電泳圖Fig.1　SDS-PAGE image of 4 kinds of glucose oxidases

GOD經(jīng)DEAE-FF離子交換層析的洗脫曲線如圖2所示。酶液經(jīng)SDS-PAGE分析,用考馬斯亮藍(lán)R-250染色,呈現(xiàn)單一條帶,說明該酶已經(jīng)達(dá)到電泳純,如圖3所示。

圖2　GOD層析的洗脫曲線Fig.2　Elution profile of glucose oxidases

圖3　層析后4種GOD的蛋白電泳圖Fig.3　SDS-PAGE image of 4 kinds of purified glucose oxidases

Marker的條帶大小從上至下分別為200.0,116.0,97.2,66.4,44.3,29.0,20.1,14.3和6.5 kDu。純化得到的GOD,亞基大小大約為65.8 kDu(sGOD約為63.2 kDu),全酶分子量經(jīng)測定約為131 kDu(sGOD約為126 kDu),為2個(gè)相同的二聚體組成。純化后,NV1、sGOD、rGOD、NV2的比酶活分別提高了4.5、5.6、5.2、1.2倍。

2.2酶學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1最適pH分別配制pH為3～10的緩沖液。在30 ℃下,分別測定純化前后不同GOD在不同pH緩沖液下的酶活,得到圖4。由圖可見,純化前的酶活有著各自的最適pH(集中在6～8),可能與其造粒時(shí)所加保護(hù)劑輔料有關(guān),而純化后的酶活對pH并不敏感,基本保持一致。

Solid is before purification;Hollow is after purification 圖4　pH對純化前后酶活的影響Fig.4　Effect of pH value on the enzymatic activity of GODs before and after purification

2.2.2最適溫度將不同的GOD溶解于pH=7的緩沖液中,并分別放置在4、20、30、35、40、55、60 ℃中保溫。在不同溫度下保溫4、8、12、24 h后測定GOD酶活。由圖5可以看出,純化后的葡萄糖氧化酶隨著溫度的升高而活性降低,而且隨著時(shí)間的延長,酶活幾乎沒有損失。在55 ℃時(shí),酶活隨著時(shí)間而逐漸降低。60 ℃下,4種葡萄糖氧化酶均沒有活性。

2.2.3金屬離子及活性劑對酶活的影響將純化前后不同的GOD溶解于20 mmol/L的Mg2+、Fe2+、Cu2+、Co2+、Mn2+、Ca2+、Zn2+以及SDS、EDTA溶液中,觀察各種金屬離子及活性劑對酶活的影響。從圖6中可以看出,Fe2+對4種GOD,無論是純化前和純化后都為抑制作用。Co2+,Mg2+,Cu2+對GOD也有一定的抑制作用,而EDTA可以激活純化后GOD的活性,可能是2價(jià)金屬離子對GOD空間結(jié)構(gòu)有影響,從而抑制酶活。經(jīng)過EDTA對金屬離子的絡(luò)合,從而促進(jìn)酶活的增加。

2.2.4葡萄糖及葡萄糖酸鈉濃度對不同來源GOD催化的影響將GOD溶解于不同質(zhì)量濃度的葡萄糖和葡萄糖酸鈉溶液中,測定酶活。從圖7和圖8中可以看出,隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的提高,GOD的酶活隨之提高,而酶活在葡萄糖酸鈉質(zhì)量濃度的變化中呈現(xiàn)波動(dòng)狀(圖8示出的水平線為各種酶酶活的平均值)。

2.2.5酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)在30 ℃,pH=7.0的條件下,以不同濃度(20～100 mmol/L)的葡萄糖為底物,測定其酶活,并按雙倒數(shù)法作圖,如圖9所示。測得GOD的Km值如下:NV1為43.93 mmol/L,sGOD為34.74 mmol/L,rGOD為43.95 mmol/L,耐高溫NV2為79.13 mmol/L。說明NV2酶雖然可以耐高溫,但對葡萄糖底物的親和力卻下降了約一半,因而更適合底物濃度高時(shí)的催化。此特點(diǎn)有可能會(huì)使底物難以完全進(jìn)行催化反應(yīng)。

圖5　溫度對GOD純化后酶活的影響Fig.5　Effect of temperature on enzymatic activity of purified glucose oxidases

圖6　金屬離子及活性劑對純化前后酶活的影響Fig.6　Effects of metal ions and active agents on the enzymatic activity before and after purification

由圖9可以計(jì)算得出,催化100 mmol/L的葡萄糖時(shí),NV1、sGOD、rGOD的Kcat值分別為45.85、20.29、37.32 s-1,耐高溫葡萄糖氧化酶NV2的Kcat值為12.95 s-1。比較4種GOD的Kcat/Km值,其大小依次為:NV1>rGOD>sGOD>NV2,其中催化效率最高的NV1的Kcat/Km值達(dá)到了 1 043.706 L/(s·mol)。

圖7　葡萄糖質(zhì)量濃度對酶活的影響Fig.7　Effect of the concentration of glucose on the enzymatic activity of purified glucose oxidases

圖8　葡萄糖酸鈉質(zhì)量濃度對酶活的影響Fig.8　Effect of the concentration of gluconate on the enzymatic activity of purified glucose oxidases

圖9　不同GOD的Km值Fig.9　Km values of different kinds of glucose oxidases

2.2.6不同來源GOD的紫外吸收特性與二級(jí)結(jié)構(gòu)分析4種GOD的紫外吸收峰非常接近,如圖10所示,說明測試酶主要組成與結(jié)構(gòu)基本相似,但有部分差異,尤其是NV1最大吸收峰在255 nm左右。進(jìn)一步對其進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的圓二色分析,表明其在二級(jí)結(jié)構(gòu)上基本一致,見表1、圖11。

2.2.7不同來源GOD的氨基酸序列分析比較將純化后的葡萄糖氧化酶的電泳條帶進(jìn)行Maldi-TOF-TOF檢測,氨基酸序列結(jié)果為:NV1,rGOD和NV2的GOD序列完全一致,只是NV1中加入了GOD前體goxC、Pc16g04630和肌動(dòng)蛋白;NV2中加入了GOD前體goxC、過氧化氫酶、過氧化氫酶前體、Pc16g04630和3個(gè)假定蛋白。sGOD的序列與NV1的序列比較,起始端少了24個(gè)殘基,有19個(gè)殘基突變。突變的殘基如表2所示。

圖10　不同GOD的紫外吸收峰Fig.10　UV absorption peak of different kinds of glucose oxidases 表1　不同GOD的圓二色譜檢測結(jié)果 Table 1　Circular dichroism result of different kinds of glucose oxidases

w/%αhelixReverseparallelfoldingParallelfoldingβturnRandomcoil4.6041.005.3018.4034.50

圖11　GOD的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.11　Secondary structure of glucose oxidase 表2　突變殘基 Table 2　Mutated amino acid residues

Sites36386567157189226281354384427428468523526532594597599CKDSNSNVFGASNHHSTHSIEMutationEADTSILASTKDRRVNAVA

CK:Control check

3　討　論

本實(shí)驗(yàn)用離子交換層析法分離純化了4種來源不同的GOD,并對電泳處理后的純GOD進(jìn)行性質(zhì)研究。GOD是一種不穩(wěn)定的酶,在不適宜的溫度中,極端的pH環(huán)境下甚至水溶液中都會(huì)引起變性,半衰期為30 min[1]。固定化[13-14]和基因工程[15]等技術(shù)可用于提高GOD的穩(wěn)定性。由于酶的活性與活性位點(diǎn)上氨基酸的電離狀態(tài)有關(guān),因而pH在保持酶的適當(dāng)構(gòu)象上有著重要的作用。酶的反應(yīng)速率與溫度呈指數(shù)關(guān)系。溫度每上升10 ℃,酶的反應(yīng)速率將加倍。在40～70 ℃范圍內(nèi),大多數(shù)酶會(huì)因變性而失去活性。米氏認(rèn)為酶的初始催化速率或催化速度與底物濃度呈雙曲變化。初始速率隨底物濃度的增加而增加,最終達(dá)到最大速度(Vmax)。在底物濃度較低時(shí),初始速率與底物濃度成正比,稱為一級(jí)動(dòng)力學(xué)。在底物濃度較高時(shí),初始速率與底物濃度無關(guān),稱為飽和或零級(jí)動(dòng)力學(xué)。不同來源的葡萄糖氧化酶有著不同的米氏常數(shù)以及最大速度。由T.flavus獲得的GOD的Km值為10.9 mmol/L[16],由A.niger獲得的GOD的Km值為33 mmol/L[17]。張茜純化的尼崎青霉菌GOD的Km值為122.6 mmol/L[18]。Kcat/Km是酶與底物復(fù)合物轉(zhuǎn)化為酶與產(chǎn)物復(fù)合物的速率常數(shù)。它可以不受非生產(chǎn)性結(jié)合與中間產(chǎn)物積累的影響,表示酶對底物的專一性。Kcat/Km值越高,則催化效率越高,說明該酶對同一底物葡萄糖的催化能力越大,應(yīng)用的可能性越大。根據(jù)計(jì)算得到Kcat/Km的大小順序?yàn)镹V1>rGOD>sGOD>NV2,這與4種酶在實(shí)際應(yīng)用中所表現(xiàn)出的催化能力完全一致,而導(dǎo)致同一類酶的Kcat/Km值大小差異明顯的原因可能是由結(jié)構(gòu)引起的。

從本研究期望找到可以影響葡萄糖氧化酶活性的結(jié)構(gòu)因素。據(jù)報(bào)道,原始的GOD的最適pH為6～8,而在純化后GOD對pH并不敏感?？赡苁怯捎谠诩兓?GOD有輔料導(dǎo)致酶對pH有一定的保護(hù)作用。文獻(xiàn)[19]報(bào)道,加入麥芽糊精可以大幅度提高酶的熱穩(wěn)定性,加入海藻糖能夠很好地保持GOD的空間結(jié)構(gòu),這對工業(yè)化生產(chǎn)葡萄糖酸是非常有利的。在工業(yè)應(yīng)用上,耐高溫的GOD則具有更好的應(yīng)用前景,目前催化葡萄糖生成葡萄糖酸產(chǎn)量最高時(shí)所需的溫度為35 ℃。在本研究中GOD在40 ℃時(shí)的酶活與其在20 ℃的條件下相比,損失了約30%～50%,但是酶的活性卻可以保持長期穩(wěn)定,這為酶法工業(yè)化生產(chǎn)葡萄糖酸提供了可能性。

酶活性的改變通常與活性中心的結(jié)構(gòu)有關(guān)。本文通過圓二色譜法和Maldi-TOF-TOF檢測了GOD的結(jié)構(gòu),通過氨基酸序列的比較發(fā)現(xiàn)sGOD與其他3種GOD有部分氨基酸的缺失和突變。但是,從紫外光譜檢測和圓二色譜檢測的結(jié)果來看,這些酶的整體結(jié)構(gòu)基本上毫無差異。在先前的研究中,一般在酶蛋白的N端和C端存在一些對于發(fā)揮特定酶活性非必需的氨基酸序列,而這些序列有可能對酶蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性或者其他功能有部分影響。同時(shí)NV1和NV2都加入了GOD前體GoxC以及修飾性蛋白,這或許可以解釋這2種酶在應(yīng)用時(shí)有較好效果的原因。影響GOD酶活的結(jié)構(gòu)因素可能是氨基酸的突變或者缺失,也可能是酶上的修飾蛋白引起的。遺憾的是,目前還沒有找到具體的影響因素。因此,可在本研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究影響葡萄糖氧化酶酶活的因素,為酶法工業(yè)化生產(chǎn)葡萄糖酸提供指導(dǎo)。

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Purification and Biocatalytic Properties of GlucoseOxidases from Different Sources

WANG Wen-ting1,ZHAO Wei2,ZHANG Kui-pu1,LI Liang1,GUO Mei-jin1

(1.State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China;2.Shandong Fuyang Biology Company,Dezhou 253100,Shandong,China)

Glucose oxidases (GODs) from four different sources were purified using ion exchange chromatography.The molecular weight of double subunits of GOD is about 130 kDu.Four GODs have relatively stable enzymatic properties and wide pH range after purification.Within the temperature range of 20—50 ℃,their enzymatic activity is relatively stable but declines with the increasing of temperature.However,enzymatic activity is less stable at 55 ℃ and no activity can be detected at 60 ℃ among GODs tested here.Metal ions including Fe2+,Co2+,Mg2+and Cu2+have strong inhibitory effects on these four kinds of enzymes in which Fe2+is the strongest one.However,EDTA is able to activate GOD’s activity.Under the condition of temperature 30 ℃ and pH 7.0,these four kinds of GODs are tested forKmandKcatvalues with the different concentrations (20—100 mmol/L) of glucose as sole substrate.Based on the results of UV spectra and the circular dichroism of four kinds of glucose oxidases,it shows that their secondary structures are very similar with different amino acid residues.However,GoxC,one of precursors of GOD,and some modified proteins such as precursor of catalase and putative Pc16g04630 protein can play vital roles in catalysis efficiency and their application in industry.

glucose oxidase; purification; biocatalytic properties; amino acid residue analysis

1006-3080(2016)04-0484-08

10.14135/j.cnki.1006-3080.2016.04.008

2015-12-07

國家高技術(shù)研究發(fā)展(863)計(jì)劃(2014AA021705)

王文婷(1990-),女,山西太原人,碩士生,主要從事酶學(xué)性質(zhì)研究。E-mail:wwt0028@126.com

通信聯(lián)系人：郭美錦,E-mail:guo_mj@ecust.edu.cn

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