陳　云，封京京（馬鞍山市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，安徽 馬鞍山 243000）

雙波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定油菜蜂花粉中總黃酮含量的研究

陳云，封京京
（馬鞍山市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，安徽 馬鞍山 243000）

選用雙波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定油菜蜂花粉中總黃酮含量，并得到滿意結(jié)果。同時(shí)，研究了甲醇的水溶液作提取劑超聲提取蜂花粉黃酮類化合物，分別對(duì)甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比及超聲提取時(shí)間等條件進(jìn)行了優(yōu)化。在甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比1∶40（g∶mL）、提取時(shí)間1.5 h條件下，總黃酮提取率為2.64%。方法重現(xiàn)性試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.53%；加標(biāo)回收率平均值為97.13%，RSD為0.25%。該方法重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高，適合油菜蜂花粉中總黃酮含量測(cè)定。

油菜蜂花粉；總黃酮；超聲波；雙波長(zhǎng)分光光度法

油菜為我國(guó)大面積種植的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物，十字花科，蕓苔屬植物［1］。蜂花粉是蜂蜜采集的雄蕊花藥的粉狀物質(zhì)，是植物生命之源。其包含花蜜和蜂蜜的唾液，富含黃酮類物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分［2］。黃酮類化合物具有眾多的生理功能和藥用價(jià)值，其主要作用有抗衰老、增強(qiáng)心血管功能、治療慢性前列腺、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)、抗炎、護(hù)肝、抗過敏、抗病毒、抑菌、抗?jié)儭⒔笛?、抗輻射和抗腫瘤等［3-8］。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)油菜蜂花粉中總黃酮乙醇提取的研究報(bào)道較多，多采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法［9-10］、比色法［11-13］，對(duì)于甲醇超聲提取的研究報(bào)道較少。本研究根據(jù)NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色反應(yīng)，為避免底液出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象而采用雙波長(zhǎng)分光光度法對(duì)油菜蜂花粉中總黃酮測(cè)定工藝條件進(jìn)行研究。試驗(yàn)固定絡(luò)合反應(yīng)時(shí)間，對(duì)甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間3因素分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，以雙波長(zhǎng)條件下吸光度差值計(jì)算總黃酮提取率，確定最佳提取工藝，為油菜花粉資源的綜合利用提供了科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

油菜蜂花粉：青海金門源油菜花蜜采集基地。蘆丁對(duì)照品（純度≥98%）：中國(guó)食品藥品檢定研究所；甲醇（分析純）、亞硝酸鈉（分析純）、硝酸鋁（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、石油醚（沸程30～60 ℃）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

TU-1901紫外可見分光光度計(jì)：北京譜析通用儀器公司；AL204型萬分之一電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；CQ-300B-S型超聲波機(jī)：上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠；HC-2000Y2粉碎機(jī)：永康市天棋盛世工貿(mào)有限公司；Soxtec 2055索氏抽提儀：美國(guó)Foss公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1原料預(yù)處理

稱取一定量的油菜蜂花粉，放入索氏抽提儀，加入石油醚抽提8 h，除去油脂和色素雜質(zhì)，抽提后自然干燥備用。稱取1.000 0 g試樣于150 mL錐形瓶中，料液比1∶20（g∶mL），加入體積分?jǐn)?shù)為60%甲醇溶液，超聲波（超聲功率300 W、頻率28 kHz）振蕩1 h，過濾，用體積分?jǐn)?shù)為60%甲醇溶液定容至50 mL。

1.3.2蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取蘆丁對(duì)照品50 mg，置于50 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為60%甲醇定容至刻度，制成貯備液。取貯備液10 mL于50 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為60%甲醇定容，得到質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3總黃酮檢測(cè)分析方法

總黃酮含量采用分光光度法［14］進(jìn)行分析。分別吸取一定量蘆丁標(biāo)液于25 mL容量瓶中，加水至6.0 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaNO2溶液和10%Al（NO3）3溶液各1 mL，搖勻，放置6 min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.3%NaOH溶液10 mL，加水至刻度。絡(luò)合反應(yīng)15min，試劑空白為參比溶液，測(cè)定吸光度值。

比色法用于組成單一的蘆丁對(duì)照物時(shí)，結(jié)果準(zhǔn)確，但是油菜蜂花粉的組成復(fù)雜，測(cè)定時(shí)易受到花色素、鞣酸及其他酚類成分的多種物質(zhì)干擾，在堿性條件下，許多多元酚會(huì)與Al3+發(fā)生同樣的顯色反應(yīng)，而且底液常常出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，測(cè)定結(jié)果明顯偏高，且重復(fù)性不好。因此，本方法選擇510 nm作為油菜蜂花粉總黃酮含量的測(cè)定波長(zhǎng)，584 nm為參比波長(zhǎng)［15］。

根據(jù)顯色反應(yīng)方法，在波長(zhǎng)510 nm和584 nm條件下測(cè)定吸光度值，得到吸光度差值△A=A510nm-A584nm。用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得出樣品液總黃酮質(zhì)量濃度，總黃酮提取率（以蘆丁計(jì)，%）計(jì)算公式如下：

式中：C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液總體積，mL；K為提取液稀釋倍數(shù)；m為蜂花粉樣品質(zhì)量，g。

1.3.4總黃酮提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

樣品液取1 mL于25 mL容量瓶，選取甲醇體積分?jǐn)?shù)（40%、60%、80%、100%）、料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g∶mL））、超聲時(shí)間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）為考察因素，研究某一單一因素變化對(duì)總黃酮提取率的影響，其他條件固定在甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比1∶20（g∶mL），超聲時(shí)間1 h（功率300 W、頻率28 kHz、室溫），絡(luò)合反應(yīng)時(shí)間15 min。

1.3.5總黃酮提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)總黃酮的提取工藝條件進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)，以雙波長(zhǎng)條件下吸光度差值為考察指標(biāo)，確定最佳提取工藝，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1　提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for extraction technology optimization

1.3.6方法重現(xiàn)性和加標(biāo)回收率試驗(yàn)

方法重現(xiàn)性試驗(yàn)：在最佳工藝條件下，樣品液取1 mL按照1.3.3方法測(cè)定吸光度差值，由蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中總黃酮提取率，平行試驗(yàn)5次，并計(jì)算出對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）；加標(biāo)回收率試驗(yàn)：分別稱取5份1.000 0 g油菜蜂花粉試樣，各加入8.0 mg蘆丁對(duì)照品，計(jì)算回收率及RSD。

2　結(jié)果與分析

2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取質(zhì)量濃度為0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，按照1.3.3顯色方法，測(cè)得波長(zhǎng)510nm、584nm條件下的吸光度值，得到吸光度差值△A= A510nm-A584nm，以蘆丁質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度差值△A（y）為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1　 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

由圖1可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為：y=7.442 9x-0.002 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4，表明蘆丁質(zhì)量濃度在0.008～0.040 mg/mL范圍內(nèi)，二者有良好的線性關(guān)系。

2.2甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取的影響

圖2　甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響Fig.2 Effect of methanol concentration on extraction efficiency

由圖2可知，體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇超聲提取液在加入顯色體系時(shí)不產(chǎn)生渾濁現(xiàn)象，提取效果最好。究其原因可能是體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇的極性比體積分?jǐn)?shù)80%和100%的強(qiáng)，能夠溶解一些極性相對(duì)較大的黃酮類物質(zhì)并且在顯色體系加入時(shí)不產(chǎn)生渾濁，而體積分?jǐn)?shù)40%的甲醇溶解黃酮類物質(zhì)較少，提取效果較差。因此選擇甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

2.3料液比對(duì)總黃酮提取的影響

圖3　料液比對(duì)提取效果的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction efficiency

由圖3可知，當(dāng)料液比由1∶20（g∶mL）增加到1∶40（g∶mL）的過程中，總黃酮提取效果增強(qiáng)，在料液比＞1∶40（g∶mL）之后，隨著料液比的增加提取效果變化平緩，這表明當(dāng)料液比為1∶40（g∶mL）時(shí)，總黃酮已被提取完全?？紤]到降低成本，節(jié)約溶劑，因此選擇料液比為1∶40（g∶mL）。

2.4超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取的影響

圖4　超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction efficiency

由圖4可知，超聲時(shí)間＜1.5 h時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮的提取效果增強(qiáng)，而超聲時(shí)間＞1.5 h之后，提取效果反而下降。其可能是超聲時(shí)間的延長(zhǎng)使得黃酮類化合物發(fā)生降解或者是超聲時(shí)間太長(zhǎng)使提取物中雜質(zhì)含量增加，黃酮類化合物提取效果反而降低。因此，選擇超聲時(shí)間為1.5 h。

2.5正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)總黃酮的提取工藝條件進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)，以雙波長(zhǎng)條件下吸光度差值△A為考察指標(biāo)，確定最佳提取工藝，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析見表3。

表2　提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for extraction technology optimization

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

從表2可知，各因素對(duì)油菜蜂花粉的影響大小分別為B＞A＞C，即料液比＞甲醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲時(shí)間。超聲法提取油菜蜂花粉中總黃酮的最佳提取條件為A1B2C2，即體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇溶液，料液比1∶40（g∶mL），超聲時(shí)間1.5 h。在此最佳條件下，油菜蜂花粉中總黃酮的提取率為2.643%。

由表3可知，甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比及提取時(shí)間對(duì)結(jié)果影響均顯著（P＜0.05）。

2.6重現(xiàn)性及加標(biāo)回收率試驗(yàn)

按照1.3.6方法進(jìn)行重現(xiàn)性和加標(biāo)回收率試驗(yàn)，結(jié)果分別見表4及表5。

由表4和表5可知，最佳工藝條件下，油菜蜂花粉的總黃酮提取率為2.643%重現(xiàn)性試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.532%，加標(biāo)回收率平均值為97.13%，RSD為0.25%。結(jié)果表明，該檢測(cè)方法重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高。

表5　加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of recovery rate tests

3　結(jié)論

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)確定了油菜蜂花粉中總黃酮的最佳提取工藝為體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇溶液，1∶40（g∶mL）的料液比，超聲提取時(shí)間1.5 h，絡(luò)合反應(yīng)15 min。在此條件下，油菜蜂花粉中總黃酮提取率2.643%。重現(xiàn)性試驗(yàn)重現(xiàn)性試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.532%，加標(biāo)回收率平均值為97.13%，RSD為0.25%。該方法重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，適合測(cè)定油菜蜂花粉中總黃酮含量。

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Determination of total flavonoids in rape bee-pollen by double-wavelength spevtrophotometry

CHEN Yun，F(xiàn)ENG Jingjing
（Maanshan Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Maanshan 243000，China）

The content of total flavonoids in rape bee-pollen was determined by double-wavelength spectrophotometry，and the determination results were satisfactory.Using the methanol aqueous solution as extracting agent，flavonoids compounds in bee-pollen was researched by ultrasonic wave extraction.The methanol concentration，solid-liquid ratio and ultrasonic extraction time were optimized.Under the conditions of methanol concentration 60%，material-liquid ratio 1∶40（g∶ml）and extraction time 1.5 h，the extraction ratio of total flavonoids was 2.64%.Relative standard deviation（RSD）of reproducibility tests was 0.53%.The average recovery rate was 97.13%，and RSD was 0.25%.The method had good reproducibility and high accuracy，which was suitable for determination of total flavonoids in rape bee-pollen.

rape bee-pollen；total flavonoids；ultrasound wave；double-wavelength spectrophotometry

S896.4

0254-5071（2016）02-0131-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.030

2015-12-01

陳云（1988-），女，助理工程師，本科，研究方向?yàn)槭称坊z驗(yàn)。