趙士明，彭文博，張建嵩，熊福軍（江蘇久吾高科技股份有限公司，江蘇 南京 210061）

陶瓷膜過濾萬古霉素的研究

趙士明，彭文博，張建嵩，熊福軍
（江蘇久吾高科技股份有限公司，江蘇 南京 210061）

以預(yù)處理后萬古霉素發(fā)酵液為料液，連續(xù)洗濾（CFD）過濾的效果更佳，表現(xiàn)在較高通量和收率?？疾炝颂沾赡み^濾萬古霉素發(fā)酵液的分離效果，結(jié)果表明，通量與黏度成負相關(guān)性，50 nm陶瓷膜較優(yōu)，且設(shè)定操作壓力290 kPa，膜面流速5 m/s，溫度20～30℃，濃縮1.66倍，連續(xù)洗濾2.5 BV，CFD過濾的平均通量可達78.9 kg/（h·m2），收率可達99.1%，與數(shù)學模型的理論值相近。采用質(zhì)量分數(shù)為2%～3%NaOH與0.5%～1.0%NaClO混合清洗的方法，清洗后陶瓷膜的水通量重復(fù)恢復(fù)率可達98%以上，再生性較好。

陶瓷膜；萬古霉素；過濾；通量；收率

隨著耐藥金黃色葡萄球菌的大量產(chǎn)生，萬古霉素作為一種糖肽類窄譜抗生素，臨床應(yīng)用上越來越受到人們的重視。最早的萬古霉素由美國禮萊公司開發(fā)，1958年獲美國食品和藥物管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）批準上市［1］。我國研究萬古霉素生產(chǎn)工藝的相關(guān)企業(yè)較多，既獲得了臨床上的藥效，又產(chǎn)生了顯著的經(jīng)濟效益［2］。發(fā)酵法生產(chǎn)萬古霉素的發(fā)酵液成分復(fù)雜［3］，除目標產(chǎn)物外，還含有金屬離子、菌絲體和菌體分泌的多種蛋白質(zhì)以及細胞所釋放的大量胞內(nèi)物質(zhì)。

針對發(fā)酵法生產(chǎn)的萬古霉素，目前國內(nèi)外普遍采用傳統(tǒng)的過濾工藝來提純?nèi)f古霉素，其存在過濾收率低、過濾精度不夠、操作工藝繁瑣等問題。同時，膜分離技術(shù)［4］是一種無相變、操作簡單的新型分離技術(shù)，適合于熱敏感物質(zhì)的分離純化。其中不銹鋼膜、平板薄層膜、中空纖維膜等超濾膜在萬古霉素中的研究也較多，但由于其壽命短、耗材大等缺點在工程中的應(yīng)用較少。陶瓷膜分離技術(shù)作為新型的化工分離單元，以精度高、易控制、化學穩(wěn)定性好、機械強度高等優(yōu)勢展現(xiàn)出其優(yōu)越的應(yīng)用性能［5］。本研究主要通過建立陶瓷膜過濾萬古霉素數(shù)學模型，確定最佳的洗濾操作方法，旨在揭示影響萬古霉素收率的控制因素和預(yù)測收率等，從而簡化操作工藝流程、提高濾液質(zhì)量和目的產(chǎn)物的收率。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

萬古霉素標準品：美國Sigma公司；無水乙醇（分析純）、乙腈（色譜純）、磷酸二氫鉀（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

陶瓷膜設(shè)備（膜元件：陶瓷膜材質(zhì)為氧化鋁、氧化鋯或氧化鈦，通道數(shù)為19，通道直徑為4 mm，孔徑為50 nm、200 nm，膜管長度1 016 mm）：由江蘇久吾高科技股份有限公司自制。膜組件：單支膜組件，面積0.2～0.3 m2。泵參數(shù)：流量Q為5.8 m3/h，揚程H為47.3 m，功率P為1.5 kW；Agilent 1260高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3方法

1.3.1發(fā)酵液性質(zhì)和前處理

萬古霉素發(fā)酵液呈棕黃色，有發(fā)酵液特有的氣味，黏性較大，流動性差，其內(nèi)含菌絲體、蛋白、萬古霉素等，萬古霉素質(zhì)量濃度為4～7 g/L。萬古霉素發(fā)酵液pH 7.5～8.0，陶瓷膜過濾前需用10%NaOH調(diào)節(jié)pH至9～10，過濾期間需在線控制其pH值。

1.3.2陶瓷膜過濾

本實驗采用錯流過濾方式。將預(yù)處理后的萬古霉素發(fā)酵液連續(xù)置于膜設(shè)備中，控制溫度在20～30℃，調(diào)節(jié)操作壓力為290 kPa，膜面流速為5 m/s，發(fā)酵液濃縮一定倍數(shù)后加純水洗濾，考察陶瓷膜對萬古霉素發(fā)酵液的分離純化效果，記錄通量、溫度和時間，期間取原液、清液和濃縮液。

1.3.3分析方法

（1）萬古霉素效價的測定

采用高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography，HPLC）法，色譜條件如參考文獻［6］所示。

效價測定：精確量取質(zhì)量濃度4～7g/L萬古霉素發(fā)酵液10 mL，置于100 mL試管中，用無水乙醇定容至100 mL，在30℃條件下浸泡4h，過濾，外標法［7］測定濾液效價（μg/mL），萬古霉素的效價和收率的計算公式如下：

萬古霉素的效價=濾液效價×10

式中：10為換算系數(shù)。

（2）陶瓷膜通量測定［8］

水通量測定：設(shè)備穩(wěn)定運行10 min后，待直至水通量基本穩(wěn)定，在0.1 MPa、常溫條件下測量水通量，直接讀取浮子流量計刻度或通過以下公式計算：

式中：J為0.1 MPa下膜的水通量，L/（h·m2）；V為t時間內(nèi)滲透水的體積，L；S為膜面積，m2；t為測量的時間，h。

料液通量測定：測定陶瓷膜過濾過程中某一時間段的通量情況，即計算出單位時間、單位膜面積滲透液的通量值，計算方法如①所示，單位L/（h·m2）。

膜過濾通量測定：記錄陶瓷膜過濾的耗時（即從進料開始至停止出料所用時間），測定系統(tǒng)滲透液的總質(zhì)量，并計算出單位時間、單位膜面積濾液的通量值，計算方法如①所示，單位kg/（h·m2）。

1.3.4膜過濾過程［9-12］

事實上，Xylem在水質(zhì)監(jiān)測領(lǐng)域的業(yè)務(wù)已經(jīng)起步。分析和監(jiān)控是ITT兩年前收購的企業(yè)，2011年又收購了世界知名的監(jiān)測分析儀器企業(yè)YSI，隨著這兩家公司的收購，ITT在水工業(yè)領(lǐng)域的產(chǎn)品更全了，而且在中國已逐步建立起銷售渠道。目前Xylem正在尋找一些合作伙伴作為分銷網(wǎng)絡(luò)或者代理，并逐步擴大自己的銷售隊伍，我們對Xylem的前途充滿信心。

當料液從初始料液體積V0被濃縮至保留液體積Vd時，保持保留液體積（Vd）恒定，流加洗水體積（Vw）與濾液的透出速度相同，稱此過程為連續(xù)洗濾過程（continuous feed diafiltertration，CFD）。如果洗水是間歇添加的，并且每次添加洗水體積Vw洗水后保留液均保持在相同體積，則稱此過程為間歇洗濾（intermittent feed diafiltertration，IFD）。

定義濃縮階段結(jié)束時初始料液體積V0與保留液體積Vd的比值a為濃縮倍數(shù)；洗濾階段，洗水體積Vw（洗水總體積）與初始料液體積V0的比值b為洗水倍數(shù)，即：a=V0/Vd；b=Vw/V0。過濾結(jié)束后，得到體積增長率K的計算公式如下：

式中：V為濾液的總體積，L；包括濃縮時濾液體積（V0-Vd）和洗水總體積Vw，L。

以體積增長率K為基礎(chǔ)，在保證通量的前提下，獲得有關(guān)于濃縮倍數(shù)、洗水倍數(shù)與收率的關(guān)系而便于實際應(yīng)用的數(shù)學模型。

在連續(xù)洗濾（CFD）過程中，洗濾階段保留液的體積恒定為Vd，并且洗液的流加速度與濾液的透出速度相同。記濾液的體積為Vw。針對膜的選擇透過性，定義膜對萬古霉素的透過率為P。過濾結(jié)束后，得到體積增長率K及洗水倍數(shù)計算公式如下：

式中：K為體積增長率，%；a為濃縮倍數(shù)；b為洗水倍數(shù)；ξ為收率，%；p為透過率，%。

在間歇洗濾（IFD）過程中，每次添加完洗水后，保留液的體積恒定為Vd，間歇添加洗水。添加洗水的量與該階段濾出的濾液體積相同，每次添加的體積為Vw，共n次。過濾結(jié)束后，得到體積增長率K及洗水倍數(shù)計算公式如下：

式中：K為體積增長率；a為濃縮倍數(shù)；b為洗水倍數(shù)；ξ為收率，%；p為透過率，%；n為洗水次數(shù)。

2　結(jié)果與分析

設(shè)定濃縮倍數(shù)a=2，透過率P=1（假設(shè)陶瓷膜對萬古霉素不截留），收率ξ=98%，洗水次數(shù)n=b/5，由公式③可知，洗水倍數(shù)b=4.5。

將預(yù)處理后萬古霉素發(fā)酵液連續(xù)置于超濾設(shè)備中進行試驗，當料液濃縮至2倍時開始間歇洗濾，以每次5 L的洗水量控制洗水的進出速度。本次實驗主要考察了IFD過濾過程對膜過濾通量和收率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1　IFD過濾過程對膜過濾通量的影響Fig.1 Effect of IFD filtration on membrane filtration flux

由圖1可知，在濃縮階段，由于膜污染較快，通量下降較快，直至35 min后下降幅度較小些，75 min時通量僅為40 L/（h·m2）。濃縮2倍后，開始間歇洗水，每次5 L，期間通量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，通量穩(wěn)定在50～80L/（h·m2）。陶瓷膜滲透清液為紅褐色澄清透明液體，設(shè)定操作壓力為290kPa，膜面流速5m/s，濃縮2倍，洗水4BV，共耗時640min，膜過濾通量為54.7 kg/（h·m2），收率為97.3%。

2.2連續(xù)洗濾（CFD）過濾過程對膜過濾通量和收率的影響

設(shè)定濃縮倍數(shù)a=1.71，透過率P=1（假設(shè)陶瓷膜對萬古霉素不截留），收率ξ=98%，由公式⑤可知，洗水倍數(shù)b=2。

將預(yù)處理后的萬古霉素發(fā)酵液連續(xù)置于超濾設(shè)備中進行試驗，當料液濃縮至1.71倍時開始連續(xù)洗濾，以每次1L的洗水量控制洗水的進出速度。本次實驗主要考察了CFD過濾過程對膜過濾通量和收率的影響，實驗結(jié)果如圖2所示。

圖2　CFD過濾過程對膜過濾通量的影響Fig.2 Effect of CFD filtration on membrane filtration flux

由圖2可知，在濃縮階段，前10 min通量下降較快，之后濾餅層形成，通量趨于穩(wěn)定，呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢［13］。濃縮1.71倍后，開始連續(xù)洗濾，每次1 L，期間通量基本保持穩(wěn)定，可視為連續(xù)洗濾。隨著洗濾的進行，體系中濃度下降，整個洗濾過程的通量曲線呈現(xiàn)平滑上升的趨勢，最終瞬時通量可達100 L/（h·m2）。陶瓷膜滲透清液為紅褐色澄清透明液體，設(shè)定操作壓力為290kPa，膜面流速5 m/s，濃縮1.7倍，洗水2.5 BV，共耗時410 min，膜過濾通量為72.7 kg/（h·m2），收率為98.8%。

2.3不同孔徑陶瓷膜對膜通量和收率的影響

設(shè)定濃縮倍數(shù)a=1.66，透過率P=1（假設(shè)陶瓷膜對萬古霉素不截留），收率ξ=98%，由公式⑤可知，洗水倍數(shù)b=2.1。

將預(yù)處理后萬古霉素發(fā)酵液連續(xù)置于超濾設(shè)備中進行試驗，當料液濃縮至1.66倍時開始連續(xù)洗濾，以每次1 L的洗水量控制洗水的進出速度。運用CFD過濾，考察不同孔徑陶瓷膜對膜通量和收率的影響，實驗結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，50 nm、200 nm陶瓷膜的通量變化趨勢一致，即通量先下降，洗水時再上升的趨勢。但相同濃縮倍數(shù)，后者的通量下降較快些。同時，連續(xù)洗濾時，50 nm膜通量上升的較快，相應(yīng)地整個CFD過程的耗時也就相對短些。50 nm、200 nm陶瓷膜滲透清液均為紅褐色澄清透明液體，差別不大。設(shè)定操作壓力290 kPa，膜面流速5 m/s，濃縮1.66倍，洗水2.5BV，50nm陶瓷膜的收率為99.1%，200nm為98.6%，前者膜過濾通量比后者高26.2%，耗時節(jié)約100 min。因此，50 nm陶瓷膜優(yōu)于200 nm［14］。

圖3　50 nm（A）及200 nm（B）陶瓷膜過濾通量隨時間的變化Fig.3 The changes of flux with time by 50 nm（A）and 200 nm（B）ceramic membrane filtration

2.4濃縮倍數(shù)與收率的關(guān)系

表1　濃縮倍數(shù)、洗水倍數(shù)與收率的關(guān)系Table1 The relationship of concentration cycle，washing water multiple and yield

在保證萬古霉素過濾收率相同的條件下，料液體積越小，所需的清洗加水量就越小，且體積越小，操作時間就越短，但隨著濃縮的進行，總固形物將增大，料液通量會逐漸下降，操作時間將大大延長［15］。因此，需要找到最佳濃縮點，來保證操作時間最短。將預(yù)處理后萬古霉素發(fā)酵液連續(xù)置于超濾設(shè)備中進行實驗，超濾過程中體系溫度控制在20～30℃，操作壓力為290 kPa，膜面流速5 m/s。濃縮至一定倍數(shù)后開始CFD過程，以每次1 L的洗水量控制洗水的進出速度。實驗結(jié)果如表1所示。

由表1可知，編號2實驗萬古霉素收率超過100%，主要因為在剪切力的作用下，菌絲體被破碎，孢內(nèi)有效成分被充分釋放。與終端過濾方式相比，錯流過濾反而更能提高收率。對編號1、2分析可知，在相同的濃縮倍數(shù)前提下，膜過濾通量與黏度成負相關(guān)性；對編號1、3分析可知，萬古霉素發(fā)酵液濃縮倍數(shù)越高，一方面，總固形物隨之增大，膜過濾通量隨之減小，耗時也就越長；另一方面，相同洗水倍數(shù)，收率越高。對編號4、5分析可知，相同洗水倍數(shù)，濃縮倍數(shù)越高，收率越大，耗時越短。因此，濃縮倍數(shù)、洗水倍數(shù)與收率的關(guān)系尤為重要；保證收率為98%，料液濃縮至1.5～1.7倍，每次以1 L的洗水量控制連續(xù)洗濾速度，洗水量為2.5 BV。

2.5膜清洗方法

萬古霉素發(fā)酵液中含有較多的菌絲體、蛋白質(zhì)以及細胞內(nèi)分泌的胞內(nèi)物質(zhì)，在進行膜過濾時，會在膜表面形成凝膠層，甚至進入膜孔內(nèi)部，堵塞膜孔，影響膜的過濾性能，主要體現(xiàn)在膜通量的衰減。因此，必須周期性的對膜進行清洗再生以恢復(fù)膜元件的過濾性能。針對萬古霉素發(fā)酵液體系，首先可用水沖刷，去除氣泡和膜表面的可逆污染；再結(jié)合化學試劑和高流速低壓循環(huán)對污染物進行分解、置換作用，盡可能地在膜面產(chǎn)生較大的剪切力以去除不可逆污染［4，16］。經(jīng)多次試驗證實，化學清洗主要是用質(zhì)量分數(shù)為2%～3%（以循環(huán)水質(zhì)量計，下同）NaOH分解污染物，結(jié)合0.5%～1.0%NaClO氧化難分解的污染物，再通過清水沖洗干凈，如此水通量重復(fù)恢復(fù)率可達98%以上。

3　結(jié)論

本研究以預(yù)處理后萬古霉素發(fā)酵液為料液，連續(xù)洗濾（CFD）過濾過程的效果更佳，表現(xiàn)在較高通量和收率。

考察了陶瓷膜過濾萬古霉素發(fā)酵液的結(jié)果表明，膜過濾通量與黏度成負相關(guān)性，50 nm陶瓷膜較優(yōu)，操作壓力290 kPa，膜面流速5 m/s，溫度20～30℃，濃縮1.66倍，連續(xù)洗濾2.5 BV，CFD的膜過濾通量達78.9 kg/（h·m2），效價收率可達99.1%，與理論值相近。

采用質(zhì)量分數(shù)為2%～3%NaOH與0.5%～1.0%NaClO混合清洗的方法，清洗后陶瓷膜的水通量重復(fù)恢復(fù)率可達98%以上，再生性較好。

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Filtration of vancomycin by ceramic membrane

ZHAO Shiming，PENG Wenbo，ZHANG Jiansong，XIONG Fujun
（Jiangsu Jiuwu Hi-Tech Co.，Ltd.，Nanjing 210061，China）

The continuous feed diafiltertration（CFD）had better effect in high flux and yield by using pretreated vancomycin fermentation broth as material liquid.The separating effect of ceramic membrane on vancomycin fermentation liquor was investigated.The results showed that the flux was negatively related with viscosity，50 nm ceramic membrane was the optimum.The operating parameters were operating pressure 290 kPa，membrane velocity 5 m/s，temperature 20-30℃，concentration cycle 1.66，continuous washing filter 2.5 BV.Under the conditions，the average flux of CFD filtration could reach to 78.9 kg/（h·m2）and the yield was 99.1%，which was approached to the theoretical value of mathematical model.With the mixed cleaning method of NaOH 2%-3%and NaClO 0.5%-1.0%，the repeat recovery rate of flux of ceramic membrane was up to more than 98%after cleaning，and it had good reproducibility.

ceramic membrane；vancomycin；filtration；flux；yield

TQ465.92

0254-5071（2016）02-0119-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.027

2015-11-11

趙士明（1987-），男，工程師，碩士，主要從事膜應(yīng)用研發(fā)工作。