趙　琪，李宗磊，吳　昊，阮　浩，蘇成勇（徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化工學(xué)院，江蘇 徐州 221140）

超聲-微波協(xié)同提取螺旋藻中的葉綠素

趙琪，李宗磊，吳昊，阮浩，蘇成勇
（徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化工學(xué)院，江蘇 徐州 221140）

研究了超聲-微波協(xié)同提取螺旋藻中葉綠素的工藝。通過單因素試驗確定了影響提取葉綠素的主要因素及最佳水平范圍，通過正交試驗確定的最佳提取工藝為提取溫度55℃，超聲提取時間300 s，料液比1∶14（g∶mL）。在此最佳條件下，螺旋藻中葉綠素的總提取率為1.141%。

螺旋藻；葉綠素；超聲-微波協(xié)同提取

葉綠素是一種安全無毒的天然脂溶性色素［1-2］，是結(jié)構(gòu)為一個鎂和四個吡咯環(huán)上的氮結(jié)合以卟啉為骨架的綠色色素的總稱［3］。葉綠素的結(jié)構(gòu)和血紅素極相似，易被人體吸收，對人體有良好的生理功效，在醫(yī)藥、食品和化妝品工業(yè)中有廣泛用途［4-6］。螺旋藻作為一種新型食品資源，有著極重要的營養(yǎng)、保健和藥用等開發(fā)潛力，并成為聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦的健康食品［7-9］。

2015年8月，美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）發(fā)布最終條例修訂色素法規(guī)“豁免認證的色素列表”，批準螺旋藻提取物（Spirulinaplatensisextract）作為著色劑用于膳食補充劑、藥品、膠囊的包衣配料中［10］。此外，螺旋藻中的葉綠素a與類胡蘿卜素、藻藍蛋白等活性物質(zhì)顯著正相關(guān)［11］。因此，如何從螺旋藻中高效提取葉綠素成為重要課題。

超聲波提取技術(shù)具有良好的空化效應(yīng)和機械效應(yīng)，微波能產(chǎn)生良好的熱效應(yīng)，使細胞內(nèi)的極性物質(zhì)產(chǎn)生大量熱量［12］。超聲-微波協(xié)同提取具有操作簡單、能有效提高提取率、縮短提取時間、降低能耗，節(jié)約成本等優(yōu)點，在蛋白質(zhì)、色素、多糖、油脂等提取方面應(yīng)用廣泛［13-17］。

本實驗在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過正交試驗法優(yōu)化超聲-微波協(xié)同提取螺旋藻葉綠素工藝，確定其最佳工藝條件，旨在為螺旋藻葉綠素純化與活性研究等提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

螺旋藻粉：市售；體積分數(shù)為95%乙醇（分析純）：南京化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

CW-2000型超聲-微波協(xié)同提取儀：上海新拓分析儀器科技有限公司；UV759型紫外-可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；BSA623S型電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；KQ5002E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；GR-268BTQ型冰箱：LG集團。

1.3實驗方法

1.3.1葉綠素測定方法

精密稱取螺旋藻粉5.000 g，加一定量體積分數(shù)為95%乙醇溶液混勻，在超聲波功率為50W，微波頻率為2450MHz條件下，超聲-微波協(xié)同提取，抽濾，收集濾液并定量。準確吸取1mL濾液，用體積分數(shù)為95%乙醇溶液定容至50mL。以體積分數(shù)為95%乙醇溶液為空白，分別測定其在波長663nm、645 nm處的吸光度值。按如下公式計算葉綠素含量［11，18］：

式中：Ca為葉綠素a質(zhì)量濃度，mg/L；Cb為葉綠素b質(zhì)量濃度，mg/L；A663nm為波長663 nm時的吸光度值；A645nm為波長645 nm時的吸光度值；V為提取液體積，L；n為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，mg。

1.3.2螺旋藻葉綠素提取單因素試驗

提取溫度的確定：精密稱取螺旋藻粉5.000 g，加入體積分數(shù)為95%的乙醇溶液50mL，在溫度分別為35℃、40℃、45℃、50℃、55℃條件下超聲-微波協(xié)同提取240 s，考察提取溫度對提取葉綠素的影響。

超聲提取時間的確定：精密稱取螺旋藻粉5.000g，加入體積分數(shù)為95%的乙醇溶液50 mL，在溫度為35℃條件下超聲-微波協(xié)同提取，微波提取時間設(shè)定為100 s，超聲提取時間分別為120 s、180 s、240 s、300 s、360 s，考察超聲提取時間對提取葉綠素的影響。

料液比的確定：精密稱取螺旋藻粉5.000 g，分別加入50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL體積分數(shù)為95%乙醇，使其料液比分別為1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18（g∶mL），在溫度為50℃條件下進行超聲-微波協(xié)同提取，微波提取時間設(shè)定為100 s，超聲提取時間為240 s，考察料液比對提取葉綠素的影響。

1.3.3提取工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，對影響葉綠素提取效果的3個主要因素：提取溫度（A），超聲提取時間（B）及料液比（C），進行3因素3水平正交試驗設(shè)計，以葉綠素的提取率為考察指標，選擇最佳的提取工藝條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1　提取工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal tests for extraction technology optimization

2　結(jié)果與分析

2.1提取溫度對提取葉綠素的影響

由圖1可知，提取溫度由35～50℃變化的過程中，葉綠素提取率逐漸升高，并在提取溫度為50℃時，葉綠素提取率達到最高值0.741%，提取溫度＞50℃后，提取率減少。隨著提取溫度的攀升，分子擴散速率加快，在超聲空化和分子擴散的協(xié)同作用下，葉綠素提取率先隨升溫而增大，但當提取溫度＞50℃，在超聲空化作用下乙醇揮發(fā)加劇，反而不利于葉綠素的提取，同時，溫度過高也可能會破壞葉綠素的結(jié)構(gòu)［19］。因此，本試驗選取50℃為合適的提取溫度。

圖1　提取溫度對葉綠素提取率的影響

2.2超聲提取時間對提取葉綠素的影響

圖2　超聲提取時間對葉綠素提取率的影響

由圖2可知，超聲提取時間為120～240 s時，隨著超聲提取時間的延長，葉綠素提取率逐漸增加，并在超聲提取時間為240s時，提取率達到最高值0.505%，超聲提取時間＞240 s后，提取率緩慢減少。原因可能是部分葉綠素在長時間超聲空化效應(yīng)下，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。因此，本試驗選擇超聲時間為240 s是比較適宜的。

2.3料液比對提取葉綠素的影響

圖3　料液比對葉綠素提取率的影響

由圖3可知，在料液比為1∶10～1∶14（g∶mL）時，隨著料液比增加，可較明顯的提高螺旋藻中葉綠素的提取率；當料液比為1∶14（g∶mL）時，葉綠素提取率達到0.932%的最大值；料液比＞1∶14（g∶mL），葉綠素提取率變化不大。過多溶劑的加入，會造成溶劑浪費并對葉綠素的進一步分離提純帶來困難。因此，本試驗選擇料液比為1∶14（g∶mL）是比較理想的。

2.4提取工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以影響葉綠素提取效果的3個主要因素提取溫度（A），超聲提取時間（B）及料液比（C）為評價因素，以葉綠素的提取率為考察指標，確定最佳提取工藝條件。正交試驗結(jié)果與分析見表2，正交試驗結(jié)果方差分析見表3。

表2　提取工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for extraction technology optimization

表3　正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

由表2可知，各因素影響螺旋藻中葉綠素提取率的主次順序為B＞A＞C，即提取時間＞提取溫度＞料液比，最佳條件為A3B3C2或A3B3C3，即提取溫度為55℃、超聲提取時間為300 s、料液比為1∶14（g∶mL）或1∶16（g∶mL），為節(jié)約溶劑和降低葉綠素后續(xù)分離純化難度，料液比選定為1∶14（g∶mL）。根據(jù)篩選得到的最佳提取條件A3B3C2，即正交試驗第9組，在此條件下平行提取3次，計算葉綠素的平均提取率，結(jié)果為1.141%。

由表3可知，各因素對試驗結(jié)果均無顯著性影響（P＞0.05）。

3　結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗確定用超聲微波協(xié)同提取法提取螺旋藻中葉綠素的最佳工藝條件為提取溫度55℃、超聲提取時間300 s、料液比1∶14（g∶mL），溶劑為體積分數(shù)為95%乙醇，該條件下螺旋藻中葉綠素的總提取率可達1.141%。

用超聲-微波協(xié)同提取法提取螺旋藻中葉綠素與有機溶劑法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法和超臨界CO2提取法等常規(guī)提取方法相比，具有速度快，能耗小，提取率高等優(yōu)點［11，18，20］。

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Ultrasonic-microvave synergistic extravtion of chlorophyll from Spirulina Platensis

ZHAO Qi，LI Zonglei，WU Hao，RUAN Hao，SU Chengyong
（Department of Chemical Engineering，Xuzhou College of Industrial Technology，Xuzhou 221140，China）

The extraction technology of chlorophyll fromSpirulina platensiswas researched by ultrasonic-microwave synergistic extraction.The main factors and the optimum levels range influencing the chlorophyll extraction were determined by single factors tests.Through the orthogonal test，the optimum extraction technology obtained was extraction temperature 55℃，extraction time 300 s and solid-liquid ratio 1∶14（g∶ml）.Under the optimum conditions，the total extraction rate of chlorophyll inS.platensiswas 1.141%.

Spirulina platensis；chlorophylls；ultrasonic-microwave synergistic extraction

TS202.3；O629.9

0254-5071（2016）02-0106-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.024

2015-12-07

徐州市科技創(chuàng)新專項資金項目（KC15H0071）；江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201513107024H）

趙琪（1978-），女，講師，碩士，研究方向為生物化工。