朱欽豪，邊亞西，吳　昊，梁智群，陳桂光，曾　偉*（1.廣西大學 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530004；2.廣西大學 微生物及植物遺傳工程教育部重點實驗室，廣西 南寧 530004；3.廣西大學 生命科學與技術學院，廣西 南寧 530004）

淡紫灰鏈霉菌H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑發(fā)酵條件優(yōu)化

朱欽豪1，2，3，邊亞西1，2，3，吳昊1，2，3，梁智群1，2，3，陳桂光1，2，3，曾偉1，2，3*
（1.廣西大學 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530004；2.廣西大學 微生物及植物遺傳工程教育部重點實驗室，廣西 南寧 530004；3.廣西大學 生命科學與技術學院，廣西 南寧 530004）

采用響應面的方法對淡紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，經(jīng)過單因素試驗和Plackett-Burman試驗設計篩選出對產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑影響較為顯著的3個因素：初始pH、接種量、發(fā)酵時間，利用最陡爬坡試驗確定Box-Behnken中心組合試驗設計的中心點，然后進行中心組合試驗對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得出最佳發(fā)酵條件為初始pH值為6.5、發(fā)酵時間4 d、接種量9%，經(jīng)過3次試驗驗證，該發(fā)酵液抑制率穩(wěn)定在68.79%，與預測值相接近。

α-葡萄糖苷酶抑制劑；淡紫灰鏈霉菌；響應面法；降血糖作用

糖尿病是一種由于缺乏胰島素或者胰島素活性喪失而導致的一種慢性代謝性疾病［1］，可分為Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病，糖尿病患者數(shù)量已相當驚人，并有每年遞增的趨勢［2-4］，其中Ⅱ型糖尿病占大多數(shù)。有研究表明，通過控制小腸中的α-葡萄糖苷酶活性可以有效的改善糖尿病人的血糖情況［5，6］。

α-葡萄糖苷酶抑制劑目前是臨床上治療Ⅱ型糖尿病的一線口服降糖藥物，它通過可逆性的抑制腸道內的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶（如α-蔗糖酶等），能分別延緩淀粉和多糖的分解，從而降低血糖［5-6］。目前臨床上用的α-葡萄糖苷酶抑制劑主要有阿卡波糖［7］、米格列醇［8］以及一些中藥［9］等。桑葉在古代即被中醫(yī)用于治病，在現(xiàn)代研究中發(fā)現(xiàn)桑葉中含有α-葡萄糖苷酶抑制劑黃酮類［10］等物質，在降血糖以及治療肥胖方面均有應用［11-12］；據(jù)報道，植物來源的活性物質對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用［6，13］；但植物中α-葡萄糖苷酶抑制劑的含量比較少，且受時間和地域的影響較大，而微生物來源的α-葡萄糖苷酶抑制劑不存在這樣的局限性，微生物源的α-葡萄糖苷酶抑制劑主要來源于植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）［14］、淡紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）［15］和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［16］。本實驗室從海洋中篩選得到一株產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的淡紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）菌株，但α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)量較低仍需進一步提高。

響應面法優(yōu)化是微生物發(fā)酵培養(yǎng)過程中常用的一種常用的優(yōu)化方法，陳艷娟等［17］在α-葡萄糖苷酶發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化中利用響應面的方法使發(fā)酵液中α-葡萄糖苷酶的酶活提高了35%左右；齊西珍等［18］在α-葡萄糖苷酶抑制劑發(fā)酵培養(yǎng)基條件優(yōu)化過程中，利用響應面優(yōu)化的方式使發(fā)酵液中α-葡萄糖苷酶抑制劑含量較優(yōu)化前提高了668倍，響應面法在桑葉中α-葡萄糖苷酶抑制劑提取應用中使其產(chǎn)量也有所提高［19-20］。本研究擬采用響應面的方式對淡紫灰鏈霉菌H2進行培養(yǎng)條件優(yōu)化，以提高發(fā)酵液中α-葡萄糖苷酶抑制劑的含量，為發(fā)酵罐培養(yǎng)菌株產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑提供一定的技術支持，以便于大規(guī)模量產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1試驗材料

淡紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）菌株H2由作者實驗室保藏，菌株H2來自于廣西北海。

1.1.2試劑

4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）：美國Aladdin公司；α-葡萄糖苷酶（15 000 U）：美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：可溶性淀粉2%，KNO30.1%，NaCl 0.05%，K2HPO40.05%，MgSO40.05%，瓊脂2%，pH 7.2～7.4，121℃滅菌20 min。

原始發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉4%，黃豆粕粉2%，（NH4）2CO30.06%，NaCl 0.05%，K2HPO40.05%，MgSO40.05%，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基：糊精4%，玉米漿干粉1.5%，NaCl 0.05%，K2HPO40.05%，MgSO40.05%，pH 6.5，121℃滅菌20 min。

1.2儀器與設備

YP1200型電子天平：上海精密科學儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；J2-21高速冷凍離心機：美國Beckman公司；UVmini-1240紫外分光光度計：日本島津公司；DSW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州泰安科技有限公司。

1.3方法

1.3.1α-葡萄糖苷酶抑制活性測定方法［21］

表1　PNPG法測定發(fā)酵液抑制率Table 1 The inhibition rate of fermentation liquid by PNPG

α-葡萄糖苷酶抑制活性測定采用PNPG法。發(fā)酵結束后，提取一定量的發(fā)酵培養(yǎng)基，于4℃、10 000 r/min離心1 min，吸取上清稀釋50倍，在波長405 nm條件下測定吸光度值，測定方法見表1。計算出發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1.3.2單因素試驗

以α-葡萄糖苷酶抑制率為考察指標，分別對碳源、氮源、溫度、搖床轉速、初始pH、接種量、種齡、發(fā)酵時間等因素進行單因素試驗，確定最佳單因素試驗條件。

1.3.3響應面試驗

（1）Plackett-Burman（PB）試驗設計

選擇N=12的PB試驗設計，考察糊精（A）、玉米漿干粉（B）、初始pH（D）、裝液量（F）、接種量（H）、發(fā)酵時間（K）、種齡（L）7個因素對液體發(fā)酵產(chǎn)抑制劑的影響的大小，每個因素取兩個水平，即低水平和高水平，以抑制率（Y）作為響應值，采用Design-Expert 8.0.6進行試驗分析，通過對比各因素顯著性，篩選出對抑制劑產(chǎn)率較大的因素。

（2）最陡爬坡試驗設計

根據(jù)PB試驗分析得到3個顯著性因素進行試驗設計，最陡爬坡方向以PB試驗值正負效應為爬坡方向，以PB試驗中的步長為來確定最陡爬坡的步長，其余不顯著因素取最佳水平，從而確定最佳的產(chǎn)酶抑制率區(qū)域。

（3）中心組合（BB）試驗

根據(jù)PB試驗結果和最陡爬坡試驗結果確定3因素3水平的中心組合試驗，通過Design-Expert8.0.6進行Box-Behnken試驗方案設計，設計共有17組試驗，最后根據(jù)軟件分析得出最優(yōu)的試驗結果，進行驗證，每組試驗重復3次。

2　結果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1不同碳源和最適碳源濃度對菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響

圖1　不同碳源對菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on α-glucosidase inhibitor production withS.lavendulaeH2

在原始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，添加40 g/L的不同碳源，由圖1可知，以糊精為碳源時，對α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，因此選用糊精為最佳碳源；由圖2可知，糊精質量濃度為40 g/L時，發(fā)酵液抑制率達到最大值。因此，選擇質量濃度40 g/L糊精為最適碳源。

圖2　糊精質量濃度對菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響Fig.2 Effect of different dextrin concentration on α-glucosidase inhibitor production withS.lavendulae H2

2.1.2不同氮源及最適氮源濃度對菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響

圖3　不同氮源對菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on α-glucosidase inhibitor production withS.lavendulae H2

圖4　玉米漿干粉質量濃度對菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響Fig.4 Effect of different corn steep dry powder concentration on α-glucosidase inhibitor production withS.lavendulae H2

由圖3可知，當硝酸銨作為氮源時，抑制率不足15%；在添加量均為20 g/L時，玉米漿干粉和蛋白胨抑制率相當，但考慮到經(jīng)濟成本，本研究擬選用玉米漿干粉作為最適氮源。由圖4可知，在玉米漿干粉添加量為20 g/L時發(fā)酵液的抑制率達到最大值，故選擇質量濃度玉米漿干粉20 g/L為最佳氮源質量濃度。

2.1.3裝液量和搖床轉速對菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響

圖5　不同裝液量（A）和搖床轉速（B）對菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響Fig.5 Effect of different liquid volume（A）and rotate speed（B）on α-glucosidase inhibitor production with S.lavendulae H2

由圖5A可知，隨著裝液量的增加，發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制能力逐漸增加，在裝液量為50 mL/250 mL時達到最大值，因此50 mL/250 mL為最佳裝液量。由圖5B可知，搖床轉速在180 r/min和200 r/min時發(fā)酵液抑制能力相當，在其他搖床轉速條件下發(fā)酵液抑制率均有所下降，考慮到設備能源消耗，本研究擬采用較低轉速作為最佳轉速，即選擇180 r/min為后續(xù)發(fā)酵搖床轉速。

2.1.4溫度和初始pH對菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響

由圖6A可知，發(fā)酵液的抑制率隨著溫度的升高先升高后降低，在28℃達到最大值，因此選擇28℃為最適培養(yǎng)溫度。由圖6B可知，初始pH值為10.0時，發(fā)酵液抑制率為0，在發(fā)酵液初始pH為7.0時，對α-葡萄糖苷酶抑制活力達到最大，選擇最適初始pH值為7.0。

圖6　不同溫度（A）和初始pH（B）對菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響Fig.6 Effect of different temperature（A）and initial pH（B）on α-glucosidase inhibitor production withS.lavendulae H2

2.1.5接種量、種齡對菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響

圖7　不同接種量（A）和種齡（B）對菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響Fig.7 Effect of different inoculum（A）and seed age（B）on α-glucosidase inhibitor production withS.lavendulae H2

由圖7A可知，接種量在8%時抑制率達到最大值；由圖7B可知，在種齡較小時接種，菌體量較少，接種后會有較長的停滯期，在種齡較大時，由于菌體即將進入穩(wěn)定期也不利于發(fā)酵液營養(yǎng)物質的應用，種齡在24 h時（此時菌株處于對數(shù)生長期）抑制率達到最大。選用接種量為8%，種齡為24 h最佳。

2.1.6發(fā)酵時間對菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響

圖8　不同發(fā)酵時間對菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響Fig.8 Effect of different fermentation time on α-glucosidase inhibitor production withS.lavendulae H2

由圖8可知，在接種后2 d發(fā)酵液的抑制率即達到45%左右，隨著發(fā)酵時間的增加，發(fā)酵液的抑制率不斷增加，在第4天到最大值，其后隨著時間的增加，還有減小的趨勢，由于菌株培養(yǎng)3 d和培養(yǎng)4 d發(fā)酵液抑制率差別不大，為提高設備利用效率，采用培養(yǎng)時間3 d為最佳。

2.2 Plackett-Burman（PB）試驗

根據(jù)單因素試驗結果，得到各因素的最佳試驗值，根據(jù)此結果設計PB試驗，試驗設計與結果見表2，方差分析見表3。

表2　Plackett-Burman試驗設計及結果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

由表3可知，其中模型的P值為0.020 8＜0.05，表明該模型顯著，影響菌株H2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑顯著性因素的排序為發(fā)酵時間＞初始pH＞接種量，其中發(fā)酵時間和接種量對結果有正效應影響，初始pH值為負效應影響，按Plackett-Burman試驗結果的正負效應進行最陡爬坡試驗設計。

表3　Plackett-Burman試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results

2.3最陡爬坡試驗

表4　最陡爬坡試驗結果Table 4 Results of the steepest ascent experiments

由Plackett-Burman試驗結果設計出最陡爬坡試驗方案，按照一定的步長確定試驗設計，其設計和結果見表4。由表4可知，其中第3組試驗具有最高的α-葡萄糖苷酶抑制率，即初始pH值為6.5，發(fā)酵時間為4 d，接種量為10%，在之后的BB試驗設計中以此條件作為中心點，其他試驗條件不變。

2.4響應面試驗設計

2.4.1響應面試驗設計與結果分析

根據(jù)響應面最佳中心點設計BB中心組合試驗，試驗設計及結果見表5，BB試驗方差分析見表6。

由Box-Behnken試驗方差分析結果可知，模型的P值＜0.000 1，模型高度顯著。該模型的擬合方程為Y=70.05-2.38A-1.09B+1.13C+0.75AB+0.58AC+2.12BC-6.62A2-4.67B2-8.22C2，回歸方程的決定系數(shù)R2為0.980 8，修正系數(shù)RAdj2為0.956 0，變異系數(shù)為2.31%，信噪比為17.516，失擬項P值為0.1608＞0.05，表明失擬項不顯著；說明該擬合方程可以用于H2菌株產(chǎn)抑制劑的分析和預測。

利用Design-Expert軟件對BB試驗組進行響應面分析，得到響應面立體分析結果見圖9。由圖9可知，初始pH和發(fā)酵時間響應面曲線較為陡峭，說明初始pH和發(fā)酵時間對抑制劑產(chǎn)量的影響較為明顯，在發(fā)酵時間不變的情況下，隨著初始pH增加，發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶抑制率先增加后減少；在初始pH不變的情況下，隨著發(fā)酵時間的增加發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶抑制率先升后降。

表5　Box-Behnken試驗結果Table 5 Results of the Box-Behnken experiments

表6　Box-Behnken試驗結果方差分析Table 6 Variance analysis of Box-Behnken experiments results

圖9　初始pH、接種量和發(fā)酵時間交互作用對抑制率影響的響應面和等高線Fig.9 Response surface plots and contour line of effects of interaction between initial pH，inoculum and fermentation time on inhibition rate

2.4.2響應面試驗結果預測與驗證

通過對響應面試驗結果分析，該模型對這三個因素的預測值分別為初始pH值6.44，接種量8.82%，發(fā)酵時間4.02 d，響應值達到最大，即抑制率為70.32%，基于實際操作的可行性，將預測值做以下調整：初始pH值為6.5，接種量為9%，發(fā)酵時間為4 d。在此條件下對結果進行3次平行驗證，最終測得的抑制率為68.79%，與理論值相對誤差為2.17%，該結果表明回歸方程能較好的預測實驗值，即該響應面對菌株H2的發(fā)酵條件的優(yōu)化準確可行。

3　結論

通過單因素試驗和Plackett-Burman（PB）試驗，篩選出對海洋源淡紫灰鏈霉菌H2液體發(fā)酵產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的3個主要因素，并經(jīng)過最陡爬坡試驗逼近抑制劑產(chǎn)量最大區(qū)域的3個水平，再利用Design-Expert8.0.6軟件對其進行中心組合試驗設計得出菌株H2的最佳發(fā)酵條件組合為：初始pH值6.5、發(fā)酵時間4 d、接種量9%，經(jīng)過3次試驗驗證，發(fā)酵液的抑制率達到68.79%，與預測值（發(fā)酵液抑制率70.32%）比較接近，表明該優(yōu)化結果可靠；在此條件下α-葡萄糖苷酶抑制率比在初始培養(yǎng)條件下提高了14.46%。

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Optimization of fermentation conditions for α-glucosidase inhibitor production by Streptomyces lavendulae H2

ZHU Qinhao1，2，3，BIAN Yaxi1，2，3，WU Hao1，2，3，LIANG Zhiqun1，2，3，CHEN Guiguang1，2，3，ZENG Wei1，2，3*
（1.State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Guangxi University，Nanning 530004，China；2.Key Laboratory of Ministry of Education for Microbial and Plant Genetic Engineering，Guangxi University，Nanning 530004，China；3.College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530004，China）

The fermentation conditions of α-glucosidase inhibitor production withStreptomyces lavendulaeH2 were optimized by response surface methodology.Three factors which had significant effect on α-glucosidase inhibitor production were determined as initial pH，inoculum and fermentation time by single factor experiment and Plackett-Burman design.The central point of Box-Behnken central composite design was determined by the steepest ascent experiments，and then the fermentation conditions were optimized.The optimum fermentation conditions were as follows∶initial pH 6.5，fermentation time 4 d and inoculum 9%.Through three validation tests，the inhibition rate of fermented liquid was in steady at 68.79%，which was approached with predicted value.

α-glucosidase inhibitor；Streptomyces lavendulae；response surface methodology；hypoglycemic activity

Q815

0254-5071（2016）02-0018-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.005

2015-12-13

國家自然科學基金資助項目（31560448，21506039）；廣西省自然科學基金資助項目（2015GXNSFBA139052）

朱欽豪（1990-），男，碩士研究生，研究方向為食品發(fā)酵工程。

曾偉（1987-），男，助理研究員，博士，研究方向為工業(yè)微生物的發(fā)酵工藝，代謝調控及生物制品開發(fā)應用。