徐明怡，王麗媛，冷海楠，張玉，倪紅偉（黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所濕地與生態(tài)保育國家地方聯(lián)合工程實驗室，哈爾濱150040）

濕地植物小葉章SSR引物篩選及反應(yīng)體系優(yōu)化

徐明怡，王麗媛，冷海楠，張玉，倪紅偉*
（黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所濕地與生態(tài)保育國家地方聯(lián)合工程實驗室，哈爾濱150040）

開引物發(fā)合適的小葉章PCR-SSR引物并建立優(yōu)化的反應(yīng)體系是開展小葉章遺傳多樣性研究的基礎(chǔ)。利用正價設(shè)計方法對小葉章SSR反應(yīng)體系中的DNA模板和引物2個反應(yīng)因素進(jìn)行了9個水平的優(yōu)化，并通過溫度梯度優(yōu)化引物退火溫度。自主開發(fā)了51對小葉章SSR引物，篩選出12對擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性豐富的SSR引物，為小葉章遺傳多樣性研究提供方法和理論依據(jù)。

小葉章；SSR分子標(biāo)記；引物篩選

小葉章（Deyeuxia angustifolia）是禾本科野青茅屬植物。主要分布于我國的東北、華北、內(nèi)蒙古等地區(qū)的平原低濕地［1］。是三江平原典型草甸、沼澤化草甸的建群植物和優(yōu)勢植物，沼澤植被中的優(yōu)勢種、亞優(yōu)勢種或重要伴生種［2］。氣候、土壤、水文及人類活動對會小葉章這樣的濕地植物產(chǎn)生影響，同時小葉章也對這些影響表現(xiàn)出靈敏的反應(yīng)［3，4］，可以用來指示濕地生態(tài)功能和生態(tài)環(huán)境的變化［5］。國內(nèi)外對小葉章的研究多集中在生理生態(tài)學(xué)方面［6-9］。

近年來，隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，分子標(biāo)記成為小葉章群落的系統(tǒng)關(guān)系等研究的重要手段。SSR （Simplesequence repeats，簡單重復(fù)序列）又稱微衛(wèi)星（Micro satellite DNA），與其他分子標(biāo)記相比較，SSR的優(yōu)點是多態(tài)性頻率高、重復(fù)性好和可靠性高，可以檢測更多等位基因位點［10］，在植物遺傳多樣性研究中被廣泛應(yīng)用。

雖然SSR標(biāo)記在小麥［11］、水稻［12］等作的物遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)多樣性分析、分子輔助育種以及品種鑒定等方面有所應(yīng)用，但由于微衛(wèi)星引物專一性極強(qiáng)，開發(fā)出的SSR引物對小葉章并不適合。因此開發(fā)出小葉章SSR引物，建立其SSR-PCR反應(yīng)體系對小葉章分子生物學(xué)研究非常必要。

本研究通過正交設(shè)計及溫度梯度試驗探索小葉章SSR-PCR反應(yīng)的最適條件，并篩選出多態(tài)性豐富的引物，旨在建立一套適合小葉章的高效、穩(wěn)定的SSR反應(yīng)體系，為小葉章群體遺傳學(xué)和分子生態(tài)學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試材料

引物篩選及優(yōu)化體系所用小葉章取自洪河國家自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所三江平原濕地生態(tài)定位研究站。典型草甸和沼澤化草甸兩個生態(tài)類型各5個地點的10份小葉章樣品（每個地點1份）。2015年6月在各地點采集新鮮無病斑嫩葉，液氮速凍后帶回實驗室于-80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗方法

1.2.1DNA的提取和檢測

DNA的提取按購自北京天根生物有限公司的植物DNA提取試劑盒（離心柱型）說明書進(jìn)行，略有改動。利用紫外可見分光光度計檢測DNA純度和濃度，在2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物的選擇

試驗所選用引物根據(jù)實驗室前期研究基礎(chǔ)，基于小葉章轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)自主設(shè)計的引物，根據(jù)已知序列用SSR Humter軟件搜索含重復(fù)5次以上核苷酸序列的元件，利用Primer Premier 5軟件遵循引物設(shè)計原則設(shè)計了51對引物（表1）。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.2.3SSR-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

PCR擴(kuò)增體系。PCR反應(yīng)體系采用正交設(shè)計優(yōu)化的方法，對引物和DNA模板量2個因素進(jìn)行3個水平的優(yōu)化，共9個處理。Taq PCR Master Mix用量根據(jù)本實驗室資料直接套用。引物選用XYZ1。PCR反應(yīng)因素水平間表2。最終反應(yīng)體系見表3。

溫度梯度PCR。為確定引物最佳退火溫度，根據(jù)已優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系，在耶拿公司的Power Cycler PCR儀上進(jìn)行溫度梯度PCR。溫度梯度設(shè)定為48.5-60.0℃，自動生成12個溫度梯度：48.5、48.8、49.6、50.8、52.2、53.5、55.0、56.3、57.7、58.9、59.7、60.0℃。

PCR反應(yīng)條件：①94℃預(yù)變性5 min；②94℃變性30 s；③55℃退火30 s；④72℃延伸30 s；⑤②-④重復(fù)34個循環(huán)；⑥72℃延伸10 min；⑦4℃保存。

1.2.4引物篩選及反應(yīng)體系的驗證

利用已建立的優(yōu)化體系和程序，隨機(jī)選取兩個生態(tài)類型小葉章DNA，對51對SSR引物進(jìn)行篩選。選出電泳條帶清晰，重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，且表現(xiàn)出較好多態(tài)性的引物。合成SSR熒光引物，對兩個生態(tài)類型10個種群的10個樣品進(jìn)行擴(kuò)增，利用SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測反應(yīng)體系的重復(fù)性及穩(wěn)定性。

2　結(jié)果與分析

2.1反應(yīng)體系的優(yōu)化

對正交試驗的9個PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結(jié)果見圖1。1-6號處理幾乎看不見條帶，7-9號處理能擴(kuò)增出明顯條帶。由圖1可知，7號處理條帶效果較好，條帶最清晰，且背景較干凈。

2.2引物篩選

利用兩個不同生態(tài)類型小葉章樣品對51對SSR云霧進(jìn)行初選，結(jié)果篩選出46對引物具有擴(kuò)增產(chǎn)物，其中22對引物在兩個居群間表現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)性頻率為43.14％。圖2為部分引物篩選的6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜。從中選出12對電泳條帶清晰，重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，且表現(xiàn)出較好多態(tài)性的引物用于小葉章群體的SSR標(biāo)記分析。選出的引物序列、退火溫度及擴(kuò)增條帶數(shù)見表4。

2.3引物篩選及反應(yīng)體系的驗證

以來自5個不同群落的10個小葉章個體為模板，對12對有效擴(kuò)增的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。熒光標(biāo)記引物擴(kuò)增產(chǎn)物在自動測序儀上掃描鑒定。部分引物擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示。擴(kuò)增產(chǎn)物大小與理論產(chǎn)物大小相一致。說明自主引物設(shè)計合理，反應(yīng)體系重復(fù)性及穩(wěn)定性高，篩選出的引物可以于用后期小葉章SSR分子標(biāo)記遺傳多樣性分析。

2.4引物多態(tài)性分析

篩選出12對SSR引物對10個小葉章個體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出24條清晰度高、重復(fù)性好的條帶，擴(kuò)增片段長度為150 bp-300 bp，平均每對引物擴(kuò)增出2條條帶，其中16條為多態(tài)性條帶，多態(tài)位點百分率為66.67％。

表1　小葉章57對自主設(shè)計SSR引物信息

表2　SSR-PCR反應(yīng)正交試驗設(shè)計L9（23）

表3　PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

圖1　XYZ1引物對小葉章樣品的正交試驗產(chǎn)物電泳圖

圖2　部分SSR引物在兩個小葉章居群中的多態(tài)性

3　討論

SSR反應(yīng)體系的建立、優(yōu)化以及引物篩選是研究植物SSR分子標(biāo)記的基礎(chǔ)和依據(jù)。影響SSR反應(yīng)的主要因子是Mg2+濃度、DNA濃度、dNTP、引物濃度、Taq酶等。本研究采用了商品化的Taq PCR Master Mix，僅對DNA濃度和引物濃度兩個因素進(jìn)行正交試驗，縮短了體系優(yōu)化時間。已報道的研究結(jié)果表明，不同物種和不同分子標(biāo)記方法，各因素對PCR反應(yīng)的影響作用不同［13，14］。本研究結(jié)果表明，模板濃度在60ng以上對小葉章DNA擴(kuò)增結(jié)果較好。

SSR標(biāo)記的前提條件是必須已知物種DNA序列才能設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，因此，種屬特異的SSR引物開發(fā)成為研究關(guān)鍵［15］。本研究通過生物信息學(xué)分析，設(shè)計了51對小葉章SSR引物，其中有22對表現(xiàn)出多態(tài)性。篩選出的12對小葉章SSR引物在10個樣品中均有特異性條帶被擴(kuò)增出來，并且特異條帶大小與理論條帶大小相一致，表明引物具有良好的穩(wěn)定性和較高的多態(tài)性。但篩選引物數(shù)量偏少，仍不能滿足研究需要。后續(xù)試驗應(yīng)繼續(xù)篩選出更多SSR位點，加大小葉章SSR引物開發(fā)設(shè)計工作，為小葉章遺傳多樣性分析奠定基礎(chǔ)。

表4　篩選出的引物序列

［1］倪紅偉.三江平原濕地植物多樣性研究［D］.東北師范大學(xué)，博士后出站報告，2001.

［2］高俊琴，呂憲國，李兆富.三江平原濕地冷濕效應(yīng)研究［J］.水土保學(xué)報，2002，16（4）：149-151.

［3］Leigh M G，Jason MN，John G C.Changes in vegetation patterns on the margins of a constructed wetland after 10 years［J］.Ecol. Manage.Rest.2004，5（2）：111-117.

［4］Leo R B，Anthony O G.Response of mid-water common reed stands to water level variations and w inter conditions in Lake Poygan，Wisconsin，USA［J］.Aquat.Bot.2003（76）：49-64.

［5］Charles A C.The assessment of herbaceous plant cover in wetlands as an indicator of function［J］.Ecol.Indicators，2002，2（3）：287-293.

［6］倪紅偉，趙玉敏，高玉慧.小葉章居群生產(chǎn)結(jié)構(gòu)及其與微環(huán)境因子的關(guān)系［J］.國土與自然資源研究，1998（4）：71-73.

［7］邢軍會，倪紅偉，王建波.二氧化碳濃度升高與氮沉降對三江平原小葉章群落生物量累積及其分配格局的影響［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2011，27（13）：49-54.

［8］楊永興，王世巖，何太蓉，田昆，楊波.三江平原典型濕地生態(tài)系統(tǒng)生物量及其季節(jié)動態(tài)研究［J］.中國草地，2002，24（1）：522-526.

［9］王麗，胡金明，宋長春，楊濤.波動和靜止水文情勢下小葉章的生理生態(tài)特征［J］.生態(tài)學(xué)報，2008，28（4）：1794-1801.

［10］高潔，李巧明.羽葉金合歡的DNA提取和SSR引物篩選［J］.云南植物研究，2008，30（1）：64-68.

［11］李小軍，馮素偉，李淦，董娜，等.應(yīng)用SSR分子標(biāo)記分析小麥品種（系）的遺傳重組［J］.作物學(xué)報，2013，39（2）：238-248.

［12］王學(xué)霞，馬靜，安永平.SSR標(biāo)記在水稻種質(zhì)研究中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（6）：137-140.

［13］張玉平，潘青華，金萬梅，等.樹莓SSR反應(yīng)體系的優(yōu)化及應(yīng)用［J］.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，16（6）：58-63.

［14］賈波，徐海濱，徐陽，等.鵝掌楸Genomic-SSR反應(yīng)體系優(yōu)化［J］.林業(yè)科學(xué)研究，2013，26（4）：506-510.

［15］陳懷瓊，隋春，魏建和.植物SSR引物開發(fā)策略簡述［J］.分子植物育種，2009，7（4）：845-851.

（2016-04-16收稿劉曉佳編輯）

SSR Primer Screening and Optimization of Reaction System for Wetland Plant Deyeuxia angustifolia

XU Ming-yi et al
（Institute of Natural Resources and Ecology，HAS.National and Provincial Joint Engineering Laboratory of Wetlands and Ecological Conservation，Harbin 150040，China）

AorthogonaldesignwasusedtooptimizeSSR amplification for Deyeuxia angustifolia in 9 levels of two factors （DNA templateandprimer）．51pairsofSSRprimerswere developed independently.The screened 12 pairs of polymorphic SSR primers were suitable for studying on genetic diversity of Deyeuxia angustifolia.

Deyeuxia angustifolia；SSR molecular markers；Primer screening

圖3　部分多態(tài)性引物對小葉章樣品的SSR產(chǎn)物毛細(xì)管電泳圖

S722

A

1003-7853（2016）03-0088-05

黑龍江省院所基本應(yīng)用技術(shù)研究專項“CO2倍增條件下三江平原小葉章光合蛋白分析及相關(guān)基因功能驗證研究”

徐明怡（1982-），女，博士，助理研究員，主要研究方向為植物分子生態(tài)學(xué)。

倪紅偉。